繆捷飛，吳 鋒

（南通大學(xué)1.附屬醫(yī)院腫瘤化療科、2.藥學(xué)院藥理系，江蘇 南通 226001）

胃癌為發(fā)生于胃上皮組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率占消化道腫瘤的40%～50%，在我國胃癌發(fā)病死亡率為各種癌癥之首［1］。Bcl-2腺病毒E1B19ku相關(guān)蛋白 3（E1B-19ku-interacting protein3，BNIP3）是一種能與腺病毒E1B19ku相互作用的促凋亡線粒體蛋白，屬于BH3-only亞族成員，缺氧時BNIP3的過表達(dá)可激活腫瘤細(xì)胞自噬從而影響腫瘤的生存和進(jìn)展［2］。本文試圖通過觀察BNIP3能否通過干預(yù)自噬影響胃癌病理進(jìn)程，并探討其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 SGC-7901細(xì)胞系（中國科學(xué)院上海細(xì)胞所），胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基等（GIBCO，美國）；氯化鈷（CoCl2，Sigma公司，美國）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）；BNIP3抗體（用于免疫印跡實驗，CST公司，美國）；BNIP3抗體（用于組織化學(xué)實驗，Abcam公司，美國）；LC3抗體（CST公司，美國）；CCK8細(xì)胞活力檢測試劑盒（同仁化工，日本）；ABC法免疫組化檢測試劑盒（Vector Laboratories公司，美國）；DAB顯色劑（Sigma公司，美國）。

1.2 材料 選取2013年10月～2014年2月江蘇省南通大學(xué)附屬醫(yī)院普外科收治的術(shù)前未經(jīng)過放療、化療的胃癌手術(shù)切除標(biāo)本18例；正常對照標(biāo)本均為同批次的手術(shù)標(biāo)本的正常胃組織。18例胃癌病例中，男11例，女7例，年齡42～68歲；高分化腺癌4例，中分化10例，低分化4例。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測 標(biāo)本手術(shù)取材、多聚甲醛固定后，石蠟切片機(jī)貼片法制片。予0.5%Triton X-100透膜0.5 h，5%山羊血清封閉1 h，BNIP3抗體（1∶400）一抗孵育過夜；次日生物素二抗（1∶500）1 h，ABC法用于檢測抗原 （1∶100）1.5 h后，DAB染色拍片。正常和腫瘤組織中各取12個具有代表性的高倍視野，結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行半定量處理，染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為：不著色0分，黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分；著色細(xì)胞百分比＜5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，＞50%記3分；總分相乘后0～1分為陰性表達(dá)（－），2～3分為弱陽性表達(dá)（＋），4～6分為陽性表達(dá)（），＞6分為強(qiáng)陽性表達(dá)（）。

1.3.2 免疫印跡蛋白檢測 標(biāo)本手術(shù)取材后迅速放置于液氮。加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液冰上提取蛋白，BCA法蛋白定量。15%的 SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，電流100V；300mA轉(zhuǎn)膜90 min；含5%脫脂奶粉TBST室溫封閉1 h；分別加BNIP3和LC3一抗4℃過夜；第2天加相應(yīng)的二抗室溫反應(yīng)1 h，掃膜并使用image J進(jìn)行灰度分析。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)和低氧誘導(dǎo) 取中分化的人胃癌細(xì)胞系SGC-7901，在含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，另加青霉素（100 kU·L－1）和鏈霉素（100 g·L－1），37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。加入CoCl2（濃度為100μmol·L－1）培養(yǎng) 48 h，用于模擬腫瘤內(nèi)部缺氧微環(huán)境后檢測細(xì)胞活力。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及活力檢測 根據(jù)BNIP3基因序列及小分子干擾RNA（siRNA）設(shè)計原則，參考Kinsella等［3］的文獻(xiàn)報道，設(shè)計并合成出兩對針對人源性 BNIP3基因的 siRNA，5′-AAGGAACACGAGCGUCAUGAAdTdT-3′ 和 5′-GCAACACUCUGGAUGGGAUUGdTdT-3′，同時設(shè)計1條陰性對照 siRNA（上海吉瑪公司）。選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，用脂質(zhì)體lipofectamin 2000介導(dǎo)干擾鏈BNIP3 siRNA等分別對SGC-7901進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，同時使用自噬阻滯劑 3-MA（5 mmol·L－1）預(yù)處理 0.5 h，然后在低氧環(huán)境48 h后，進(jìn)行CCK8細(xì)胞活力測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，對計量和計數(shù)資料差異性比較分別進(jìn)行t檢驗和χ2檢驗，計量資料用ˉx±s表示。

2 結(jié)果

2.1 胃癌中BNIP3蛋白表達(dá)變化 免疫組化檢測提示胃癌組織中BNIP3蛋白陽性細(xì)胞主要位于腫瘤壞死區(qū)的周圍以及癌浸潤邊緣，正常胃粘膜組織幾乎沒有表達(dá)；BNIP3以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主，部分細(xì)胞核也有表達(dá)，如Fig 1所示。與正常組織相比，腫瘤區(qū)BNIP3蛋白表達(dá)明顯增高，兩者差異有顯著性（P＜0.01），見 Tab 1。如Fig 2所示，免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤組織BNIP3單體及其二倍體形式蛋白表達(dá)量均較正常組織增高（P＜0.05）。

Fig 1 HE staining（A）and DAB staining（B）of gastric carcinoma tissues（Scale bar＝20μm）

Tab 1 Expression of BNIP3 in gastric carcinoma（n＝12）

2.2 胃癌中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增高 如Fig 3所示，和正常組織比較，腫瘤組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）。

Fig 2 Protein levels of BNIP3 in gastric carcinoma tissues and normal tissuesˉx±s，n＝10）*P＜0.05 vs Con

Fig 3 Protein levels of LC3-Ⅱin gastric carcinoma tissues and normal tissues±s，n＝10）*P＜0.05 vs Con

2.3 胃癌細(xì)胞SGC-7901在RNA干擾后BNIP3蛋白表達(dá)降低 如Fig 4所示，兩對siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，1鏈?zhǔn)筍GC-7901中BNIP3表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。

2.4 BNIP3 siRNA使胃癌細(xì)胞SGC-7901中LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)下調(diào) 免疫印跡結(jié)果顯示，BNIP3被RNA干擾后，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量同時下調(diào)，見Fig 5（P＜0.05）。

Fig 4 Protein levels of BNIP3 in SGC-7901 cells of each group±s，n＝3）*P＜0.05 vs Con

Fig 5 Protein levels of LC3-Ⅱin SGC-7901 cells of each group（±s，n＝3）*P＜0.05 vs Hypoxia

2.5 BNIP3 siRNA和3-MA使胃癌細(xì)胞 SGC-7901在低氧環(huán)境細(xì)胞活力明顯提高 在CoCl2干預(yù)后的低氧環(huán)境中，SGC-7901細(xì)胞活力明顯降低；BNIP3 siRNA干擾后可以提高細(xì)胞活力，使用自噬阻滯劑3-MA后細(xì)胞活力也能夠得到部分恢復(fù)，見Fig 6（P＜0.05）。

Fig 6 Cell viability in SGC-7901 cells of each group（ˉx±s，n＝3）*P＜0.05 vs Hypoxia

3 討論

乏氧是眾多實體腫瘤的共同特征，對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用。腫瘤細(xì)胞生長迅速導(dǎo)致需氧量增高和血氧供給不足的失衡導(dǎo)致微環(huán)境低氧狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)乏氧環(huán)境，啟動一系列調(diào)節(jié)機(jī)制；胃癌細(xì)胞對于低氧微環(huán)境的感應(yīng)主要通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）的蛋白表達(dá)水平［4］。上調(diào)的 HIF-1蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖和侵襲［5］。

BNIP3位于10號染色體，包含6個外顯子，基因序列全長585 bp，編碼194個氨基酸，分子質(zhì)量約21 ku。目前認(rèn)為BNIP3是HIF-1在乏氧環(huán)境中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)的主要活性物質(zhì)［6］，BNIP3自身形成同源二聚體或與Bcl-2家族其他成員形成異源二聚體后，主要定位于線粒體外膜，少量定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細(xì)胞核膜［7］。BNIP3既可以通過促進(jìn)線粒體膜通透性增高、線粒體損傷來誘導(dǎo)凋亡，又可通過與Bcl-2及Bcl-xl形成異構(gòu)體，拮抗其抗凋亡作用，在缺氧環(huán)境中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［8］。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，BNIP3不僅參與腫瘤細(xì)胞的凋亡，而且在調(diào)控細(xì)胞自噬進(jìn)程中也發(fā)揮重要的作用。在各種應(yīng)激壓力下，尤其是在缺氧條件下，細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的BNIP3可以通過調(diào)控自噬水平的途徑來平衡自身生存狀態(tài)。

自噬是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象，在一些生理和病理因素的誘導(dǎo)下形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，延伸包裹待降解的蛋白質(zhì)、破損細(xì)胞器，形成自噬體，然后和溶酶體膜融合后形成自噬溶酶體，內(nèi)容物被蛋白水解酶（cathepsins）降解后可循環(huán)利用，從而維持了細(xì)胞的自身穩(wěn)定［9］。在腫瘤進(jìn)展中，由于血供減少，癌細(xì)胞在乏氧和“饑餓”的狀況下能夠誘導(dǎo)自噬啟動。越來越多的研究表明細(xì)胞自噬在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中占有重要的地位［10］，自噬對腫瘤也具有抑制作用，相關(guān)自噬基因的缺失、突變等和腫瘤發(fā)生正相關(guān)。早期胃癌中，作為酵母自噬相關(guān)基因的哺乳細(xì)胞同源基因Beclin1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)［11］；人自噬相關(guān)蛋白（ATG）基因的突變在胃癌發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮重要的作用［12］；Azad等［8］報道在低氧環(huán)境下，激活BNIP3可以誘導(dǎo)自噬抑制膠質(zhì)瘤和乳腺癌細(xì)胞增殖。我們實驗發(fā)現(xiàn)BNIP3蛋白能夠有效上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)水平，可能是通過誘導(dǎo)自噬發(fā)生，在乏氧環(huán)境中促進(jìn)細(xì)胞死亡；針對這一作用靶點，可為胃癌防治提供新方法的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 李鴻梅，李雪巖，蔡德富，等.齊墩果酸對順鉑耐藥胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26（5）：657－60.

［1］ Li H M，Li X Y，CaiD F，et al.Effects of oleanolic acid on proliferation of SGC-7901／CDDP in vitro and its potentialmechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（5）：657－60.

［2］ Tracy K，Dibling B C，Spike B T，etal.Bnip3 isan rb／e2f target gene required for hypoxia-induced autophagy［J］.Mol Cell Biol，2007，27：6229－42.

［3］ Zeng X，Kinsella T J.Bnip3 is essential formediating 6-thioguanine-and 5-fluorouracil-induced autophagy following DNA mismatch repair processing［J］.Cell Res，2010，20：665－75.

［4］ Liu L，Ning X，Sun L，etal.Involvementofmgr1-ag／37lrp in the vincristine-induced hif-1 expression in gastric cancer cells［J］.Mol Cell Biochem，2007，303：151－60.

［5］ Sendoel A，Kohler I，F(xiàn)ellmann C，et al.Hif-1 antagonizes p53-mediated apoptosis through a secreted neuronal tyrosinase［J］.Nature，2010，465：577－83.

［6］ Kothari S，Cizeau J，McMillan-Ward E，et al.Bnip3 plays a role in hypoxic cell death in human epithelial cells that is inhibited by growth factors egf and igf［J］.Oncogene，2003，22：4734－44.

［7］ Gustafsson A B.Bnip3 as a dual regulator ofmitochondrial turnover and cell death in the myocardium［J］.Pediatr Cardiol，2011，32：267－74.

［8］ Azad M B，Chen Y，Henson E S，et al.Hypoxia induces autophagic cell death in apoptosis-competent cells through a mechanism involving bnip3［J］.Autophagy，2008，4：195－204.

［9］ Mizushima N，Yoshimori T，Levine B.Methods inmammalian autophagy research［J］.Cell，2010，140：313－26.

［10］Lorenzi P L，Claerhout S，Mills G B，Weinstein JN.A curated census of autophagy-modulating proteins and small molecules：Candidate targets for cancer therapy［J］.Autophagy，2014，10：1316－26.

［11］Ahn CH，Jeong EG，Lee JW，et al.Expression of beclin-1，an autophagy-related protein，in gastric and colorectal cancers［J］.APMIS，2007，115：1344－9.

［12］Kang M R，Kim M S，Oh JE，etal.Frameshiftmutationsof autophagy-related genes atg2b，atg5，atg9b and atg12 in gastric and colorectal cancers with microsatellite instability［J］.J Pathol，2009，217：702－6.