宋 煒，蔡 鵬，杜 雷，王志達，許志強，張詠梅

（徐州醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院，江蘇 徐州 221004）

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)比較常見的疾病之一，在所有的癲癇患者中，約有30%～40%存在不同程度的認知功能損害以及學(xué)習(xí)記憶功能的減退［1－2］。患者常出現(xiàn)記憶障礙、智力下降、性格改變等。近年來，關(guān)于癲癇患者伴有認知損害的報道越來越多，多數(shù)學(xué)者的研究認為認知損害與抗癲癇藥的副作用有關(guān)。但也有部分研究表明抗癲癇劑對癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶有改善作用，所以其確切的影響機制尚未明確。丙泊酚是目前臨床最常用的靜脈全身麻醉藥物之一，具有起效迅速、蘇醒快且功能恢復(fù)完善等優(yōu)點，因而普遍用于臨床麻醉誘導(dǎo)與維持。王丹等［3］用荷包牡丹堿證實γ-氨基丁酸（GABA）A受體介導(dǎo)了全麻藥丙泊酚、依托咪酯對成年小鼠的學(xué)習(xí)記憶損害作用，說明丙泊酚有產(chǎn)生記憶障礙的副作用。突觸的可塑性被認為是學(xué)習(xí)記憶的可能機制，海馬是哺乳動物邊緣系統(tǒng)的主要組成部分，是參與空間學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)。海馬含有大量谷氨酸能和GABA能神經(jīng)元，因而推測丙泊酚對以海馬為基礎(chǔ)的空間學(xué)習(xí)記憶可能具有影響［4］。近年來研究表明，丙泊酚擾亂認知并阻斷感覺信息投射到大腦高級中樞，從而影響認知的形成，所以丙泊酚使大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的影響已被普遍認可。苯巴比妥鈉是目前用來預(yù)防和治療癲癇發(fā)作的主要藥物，而丙泊酚也是目前臨床最常用的靜脈麻醉藥，其對于癲癇大鼠以及服用抗癲癇劑后癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響還不明確。免疫炎癥反應(yīng)在癲癇發(fā)生過程中起著重要作用，而 Toll樣受體 4（toll-like receptor 4，TLR4）是一種重要的天然免疫受體。有研究表明，TLR4介導(dǎo)的信號通路能識別內(nèi)源性配體，參與癲癇所致炎癥反應(yīng)，其具體作用機制尚不完全清楚。本研究制備癲癇大鼠模型，觀察丙泊酚和苯巴比妥鈉對癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，為臨床上癲癇以及服用抗癲癇制劑后的癲癇患者是否適合用丙泊酚作為靜脈麻醉劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 生理鹽水、脂肪乳劑（濃度為20%）為貝朗醫(yī)療公司產(chǎn)品；丙泊酚為國瑞公司有限責(zé)任公司產(chǎn)品；苯巴比妥鈉為上海新亞公司產(chǎn)品；戊四唑為Aladdin公司產(chǎn)品。

1.2 儀器 Morris水迷宮為上海軟隆科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗動物及分組 大鼠36只，體質(zhì)量200～250 g，由徐州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，♀♂不拘。實驗前1周，動物每天在12 h光照、12 h黑暗交替（8∶00～20∶00為光照時間）的房間內(nèi)飼養(yǎng)，保持室溫20℃～25℃，自由飲水和攝食。隨機分為癲癇模型組（EP）、生理鹽水＋癲癇組（NS）、脂肪乳劑＋癲癇組（LE）、苯巴比妥鈉＋癲癇組（PB）、丙泊酚＋癲癇組（Prof）及丙泊酚與苯巴比妥鈉聯(lián)合用藥＋癲癇組，每組6只。

1.4 大鼠癲癇模型制備 大鼠癲癇模型的建立參照文獻［5］：大鼠每天腹腔注射1次亞驚厥劑量15 g·L－1戊四唑溶液（30 mg·kg－1），每天注射均在早上8∶00～10∶00進行，連續(xù)28 d。模型成功與否以其發(fā)作時的行為變化為主要依據(jù)，按Racine分級，0級：無任何反應(yīng)；1級：面部陣攣，包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等；2級：1級加節(jié)律性點頭；3級：2級加前肢陣攣；4級：3級加后肢站立；5級：4級加摔倒。達到4～5級的大鼠選用，未達到4級的淘汰［6］。苯巴比妥鈉＋癲癇組大鼠于每日注射戊四唑前0.5 h腹腔注射10%苯巴比妥鈉溶液（60 mg·kg－1）。丙泊酚＋癲癇組和聯(lián)合用藥＋癲癇組在d 1～5訓(xùn)練前，腹腔注射丙泊酚50 mg·kg－1作為誘導(dǎo)劑量，待翻正反射消失后，再腹腔追加50 mg·kg－1加深麻醉。在d 6的測試前不應(yīng)用。丙泊酚組與聯(lián)合組均在大鼠翻正反射恢復(fù)后20 min開始訓(xùn)練。

1.5 Morris水迷宮測試 Morris水迷宮為直徑125 cm、高50 cm的圓形水池，水深30 cm，水溫保持（26±1.0）℃。池壁上有象征四個象限的不同標(biāo)志，在一個象限的正中離池壁33 cm處放一個9 cm、高28 cm的黑色平臺，平臺頂?shù)陀谒?.5 cm。訓(xùn)練期間迷宮外參照物保持不變。Morris水迷宮測試大鼠對水迷宮的學(xué)習(xí)和記憶能力。訓(xùn)練共進行5 d，1～5 d觀察大鼠的定位航行能力。訓(xùn)練時分別以四個象限作為入水點，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠爬到平臺所用時間（潛伏期），如大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，則將其引至平臺并停留30 s，此時潛伏期記為120 s，不能游泳者去除。記錄各組動物潛伏期進行比較。d 6測定大鼠的空間探索能力。撤去水中的平臺，把大鼠從距原平臺最遠的象限投入水中，入水點與d 1～5訓(xùn)練時的位置相同。記錄60 s內(nèi)在隱藏平臺所在象限停留的時間。

1.6 TLR4蛋白檢測 海馬組織勻漿碾碎后，離心取上清液，按說明書采用酶聯(lián)吸附測定方法（ELISA）檢測海馬中TLR-4蛋白的含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)均采用ˉx±s表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)檢驗，組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和q檢驗，各組多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Newman-Keuls Comparison Test法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對癲癇大鼠定位航行能力的影響 各組大鼠d1潛伏期相比無明顯差別（P＞0.05）。癲癇模型組、生理鹽水＋癲癇組、脂肪乳劑＋癲癇組、苯巴比妥鈉＋癲癇組、聯(lián)合用藥＋癲癇組大鼠d 2潛伏期均開始縮短。d 3丙泊酚組大鼠較癲癇模型組和脂肪乳劑對照組大鼠潛伏期明顯延長，其他組間差異無顯著性。d 4和d 5，生理鹽水對照組與脂肪乳劑對照組相比，潛伏期差異無顯著性（P＞0.05）。丙泊酚組與癲癇模型組相比，潛伏期明顯延長；苯巴比妥鈉組與癲癇模型組相比，潛伏期差異無顯著性（P＞0.05）。聯(lián)合用藥組與丙泊酚組相比，潛伏期差異無顯著性（P＞0.05）；聯(lián)合用藥組與苯巴比妥鈉組相比，潛伏期明顯延長。見Fig 1，2。

Fig 1 Escape latency in training test*P＜0.05 vs EP；＃＃P＜0.05 vs LE

Fig 2 Escape latency in training test（d 5）*P＜0.05 vs EP；＃P＜0.05 vs combination

2.2 丙泊酚對癲癇大鼠空間探索能力的影響 d 6撤去平臺，觀察各組大鼠的空間探索能力。生理鹽水對照組（51.6±10.74）與脂肪乳劑對照組（52.3±6.78）對比，平臺停留期差異均無顯著性（P＞0.05）。丙泊酚組（38.9±3.45）與癲癇模型組（53.5±4.39）對比，平臺停留縮短；苯巴比妥鈉組（29.5±10.80）與癲癇模型組對比，平臺停留期縮短。聯(lián)合用藥組與丙泊酚組對比，平臺停留期縮短；聯(lián)合用藥組與苯巴比妥鈉組對比，平臺停留期縮短（Fig 3）。水迷宮軌跡圖顯示（Fig 4），各用藥組在平臺象限停留的時間以及穿梭次數(shù)均較癲癇模型組減少。

Fig 3 Time spent in quadrant 3 in probe test*P＜0.05 vs EP；＃P＜0.05 vs combination

2.3 丙泊酚對癲癇大鼠腦組織TLR4表達的影響與癲癇模型組相比，生理鹽水組、脂肪乳組的TLR4蛋白表達量均無明顯差異（P＞0.05）；苯巴比妥鈉組、丙泊酚組TLR4蛋白表達明顯增高（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組與苯巴比妥鈉組和丙泊酚組相比，TLR4蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見 Fig 5。

3 討論

本實驗研究表明，丙泊酚以及抗癲癇劑對癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有不同程度的損害，各用藥組TLR4的表達較癲癇模型組明顯增多，提示了TLR4可能參與了丙泊酚及抗癲癇劑對大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)生與發(fā)展。

實驗中應(yīng)用的Morris水迷宮是神經(jīng)生物學(xué)研究動物空間學(xué)習(xí)、記憶功能常用的行為學(xué)檢測方法，能夠較準(zhǔn)確地反映實驗動物以視覺為基礎(chǔ)的空間學(xué)習(xí)、記憶、定向及定位能力的變化［7］。實驗中，點燃大鼠在前5 d進行游泳尋航訓(xùn)練，學(xué)會了找到固定位置隱蔽的平臺，并且記錄每一次找到平臺的時間和路程軌跡，從而可以檢驗點燃大鼠的學(xué)習(xí)能力。d 6撤去了平臺，檢測大鼠在原平臺位置所在象限停留時間，從而可以檢驗點燃大鼠的記憶能力。這樣從兩個方面來綜合評判點燃大鼠的認知能力，使結(jié)論更具說服性。丙泊酚是目前臨床最常用的靜脈全身麻醉藥物之一，但近來有文獻報道，用丙泊酚麻醉后的患者可發(fā)生學(xué)習(xí)、語言、判斷等認知功能異常［8－9］。實驗發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用苯巴比妥鈉、丙泊酚的癲癇大鼠相比其他各組大鼠，潛伏期明顯延長，說明聯(lián)合應(yīng)用的藥物造成大鼠腦神經(jīng)元不可逆性的損傷，其學(xué)習(xí)能力受明顯抑制，記憶能力明顯減退，聯(lián)合應(yīng)用藥物對神經(jīng)元損害程度最大。

癲癇對大鼠的學(xué)習(xí)記憶損害機制并未明了。以往的研究中發(fā)現(xiàn)，反復(fù)癲癇發(fā)作可以導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)發(fā)生病理變化，包括海馬神經(jīng)元的變性壞死、突觸間隙異常增寬及突觸后膜的密度改變、海馬異常苔蘚樣發(fā)芽以及由此導(dǎo)致的突觸聯(lián)系異常，與學(xué)習(xí)記憶聯(lián)系緊密的NMDA受體表達分布異常、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常等［10］。

TLR4是一種重要的天然免疫受體，它可以介導(dǎo)受損或應(yīng)激產(chǎn)生的內(nèi)源性配體，引發(fā)炎癥反應(yīng)。近年來研究顯示，大腦內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)參與了癲癇發(fā)作引起的腦損傷過程，癲癇發(fā)作后，腦組織存在的炎癥反應(yīng)提高了神經(jīng)元的興奮性，損傷存活的細胞，增加血腦屏障的通透性［11］。Maroso等［12］在海人酸或荷包牡丹堿誘導(dǎo)的小鼠EP模型中發(fā)現(xiàn)，TLR4與HMGBl在海馬的神經(jīng)細胞、星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞均有表達。運用HMGBl或TLR4的拮抗劑，小鼠的癲癇點燃時間、發(fā)作次數(shù)及發(fā)作持續(xù)時間均有所下降。由此可見，EP的發(fā)作激活了TLR4炎癥反應(yīng)信號通路，而這些通路的激活直接導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變，從而引起記憶功能損害。

雖然目前癲癇的發(fā)病病理機制尚未完全清楚，但近年眾多研究已表明，免疫炎癥反應(yīng)與癲癇的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性。有研究表明，TLR4在腦中風(fēng)的神經(jīng)元死亡中起重要的作用，敲除TLR4后腦梗死的面積明顯減少，可以推斷TLR4在調(diào)控中樞炎癥介導(dǎo)的急性腦損傷中起重要作用，從而對學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生影響。本實驗結(jié)果顯示，隨著戊四唑造模時間延長以及丙泊酚的注射，各組癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力呈明顯下降趨勢。我們通過TLR4在癲癇大鼠海馬內(nèi)的表達情況可以觀察到丙泊酚以及聯(lián)合用藥組的TLR4的表達水平明顯增強，說明TLR4介導(dǎo)的中樞炎癥反應(yīng)與學(xué)習(xí)記憶能力有一定相關(guān)性。

綜上所述，聯(lián)合應(yīng)用苯巴比妥鈉、丙泊酚對認知和記憶有損害加深作用，對腦神經(jīng)元有不可逆的損害。因此臨床上不建議丙泊酚作為靜脈麻醉藥應(yīng)用于使用苯巴比妥鈉治療的癲癇患者。

Fig 4 Typical sw im－tacking path in probe trial in different groups

Fig 5 Expression of TLR4*P＜0.05 vs EP；＃P＜0.05 vs combination

參考文獻：

［1］ Schouten A，Oostrom K J，Pestman W R，etal.Learning andmemory of school children with epilepsy：a profspective controlled longitudinal study［J］.Dev Med Child Neurol，2002，44（12）：803－11.

［2］ 洪 震，江澄川.現(xiàn)代癲癇學(xué)［M］.上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2001：1.

［2］ Hong Z，Jiang CC.Modern epileptology［M］.Shanghai：Fu Dan U-niversity Press，2001：1

［3］ 王 丹，戴體俊，馬 濤，孟 晶.側(cè)腦室注射荷包牡丹堿、NMDA對依托咪酯所致遺忘作用的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25（8）：1029－32.

［3］ Wang D，DaiT J，Ma T，Meng J.Effectsof intracerebroven tricular injection of bicuculline or NMDA on the amnestic effect induced by etomidate［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（8）：1029－32.

［4］ 尚 游，吳 艷，姚尚龍.丙泊酚對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力影響的實驗研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2007，23（6）：764－8.

［4］ Shang Y，Wu Y，Yao S L.Experimental research on the effect of propofol on spatial learning andmemory in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23（6）：764－8.

［5］ 王 麗，Onn J，Walson P D.大鼠戊四唑點燃模型建立［J］.藥學(xué)學(xué)報，1993，28（7）：486－9.

［5］ Wang L，Onn J，Walson PD.Establishmentof PTZ kindlingmodel［J］.Acta Pharm Sin，1993，28（7）：486－9.

［6］ KantG J，Wylie RM，Vasilakis A A，Ghosh S.Effectsof triazolam and diazepam on learning and memory as assessed using a water maze［J］.Pharmacol Biochem Behav，1996，53（2）：317－22.

［7］ Gekas J，Walther G，Skuk D，etal.In vitro and in vivo study of human amniotie fluid—derived stem cell differentiation intomyogenic Lineage［J］.Clin Exp Med，2010，10（1）：1－6.

［8］ Dong Y，Benveniste E N.Immune function of astrocytes［J］.Gila，2001，36（2）：180－90.

［9］ Garcia-Ovejere D，Azcoitia I，Doncarlos L L，et al.Gila-neuron crosstalk in the neuroprotective mechanisms of sex steroid hormones［J］.Brain Res Rev，2005，48（2）：273－86.

［10］黃亞玲，孫 丹，劉亞黎.戊四氮反復(fù)致癇對新生鼠海馬的損傷及其機制［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2005，34（3）：274－90.

［10］Huang Y L，Sun D，Liu Y L.Injuring effects of repeated seizures unduced by pentylenetetrazol on the hippocampus of neonatal rats and the mechanism［J］.Acta Med Univ Sci Technol Huazhong，2005，34（3）：274－90.

［11］Vezzani A，Granate T.Brain in eprilepsy：experimrntal and clinical evidence［J］.Eplepsia，2005，46（11）：1724－43.

［12］Maroso M.Toll-like receptor 4 and high-mobility group box-1 are involved in ictogenesis and can be targeted to reduce seizures［J］.Nat Med，2010，16（4）：413－9.