林 巖，肖 薇，金 莉，鄧志會，李 波，王國忠，劉吉成

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院1.醫(yī)藥研究所、2.病理生理學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合博士后流動站，黑龍江哈爾濱 150040）

心肌肥大是心肌長期過度負(fù)荷引起的一種適應(yīng)性病理變化，是高血壓、心肌病、急性心肌梗死等許多心血管疾病共有的病理生理過程和獨立危險因素。因此，研究心肌肥大的發(fā)生發(fā)展以及如何逆轉(zhuǎn)心肌肥大，對心血管疾病的防治具有重要意義。

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種在紅酒和葡萄中存在的多酚類化學(xué)物質(zhì)，具有強大的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎癥等生物學(xué)特性［1］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是在多種生理或病理條件下，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能，通過一系列蛋白表達(dá)調(diào)控，不能恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)后導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡［2］。目前對Res的心血管保護(hù)研究主要集中在抗氧化、抗損傷等方面［3］，關(guān)于Res對異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用及與ERS的關(guān)系研究甚少。本實驗采用乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，觀察了白藜蘆醇對心肌細(xì)胞肥大中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78和CHOP表達(dá)的影響，探討其心肌肥大的保護(hù)作用機制，為臨床藥物應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 取新生1～3 d Sprague-Dawley大鼠乳鼠共20只，♀♂不拘，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物研究所提供。

1.2 藥品與試劑 白藜蘆醇、異丙腎上腺素、5-溴2-脫氧尿嘧啶和胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；DEME培養(yǎng)基、新生牛血清購自Gibco；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、丙二醛（MDA）測試盒購于南京建成生物工程研究所；GRP78一抗、CHOP一抗和 β-actin一抗（Santa Cruz公司），二抗（辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔IgG和兔抗鼠IgG購自武漢博士德生物科技有限公司）。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司。

2 方法

2.1 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 乳鼠無菌條件下開胸取心室肌，0.25%胰酶分次消化至單細(xì)胞懸液，離心，棄上清，用含20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，CO2孵箱中差速貼壁90 min，吸取未貼壁的心肌細(xì)胞接種到培養(yǎng)板上，置入37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁24 h后出現(xiàn)自發(fā)性同步搏動，于接種48 h后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 實驗分組 培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機分為4組：①正常對照組（control）：無血清DMEM培養(yǎng)液；② 異丙腎上腺素組（ISO）：無血清DMEM培養(yǎng)液加入ISO 1 μmol·L－1作用 48 h；③ 白藜蘆醇干預(yù)組（Res＋I(xiàn)SO）：分別向培養(yǎng)基中加入ISO 1μmol·L－1和 Res 50μmol·L－1作用 48 h；④ 白藜蘆醇對照組（Res）：向無血清DMEM培養(yǎng)液中加入Res 50μmol·L－1。2.3 細(xì)胞表面積測定 將細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后爬片，分組處理后，體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇固定15 min后行HE染色。采用圖像分析系統(tǒng)（奧林巴斯BS53）測定心肌細(xì)胞表面積，隨機選取5個視野，每個視野測定5個細(xì)胞，取其平均值。

2.4 實時定量PCR檢測 ANP、GRP78和 CHOP基因表達(dá) 按照TRIzol試劑說明書提取心肌細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的含量、純度和完整性。參照TaKaRa公司提供的實時定量SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit說明書，在2700型PCR System擴增儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃15min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)95℃2 min。在AB I 7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃，10 s。PCR反應(yīng)95℃，變性 5 s，60℃ 退火 30 s，共 40個循環(huán)。由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成特異性引物用于定量檢測ANP、GRP78和CHOPmRNA的表達(dá)。ANP上游引物：5′-GGGAAGTCAACCCGTCTCA-3′，下游引物：5′-GGGCTCCAATCCTGTCAAT-3′；GRP78上 游 引 物：5′-CTCAAAGCACCACACCAGTC-3，下游引物：5′-ACCGCAAAGTCTACCCACAG-3′；CHOP上 游 引 物：5′-GGCAGCGACAGAGCCAAA-3′，下游引物：5′-CAGCTGGACACTGTCTCAAAGG-3′。同時采用 β-actin為內(nèi)參照，mRNA的表達(dá)量用 2－ΔΔCt表示。

2.5 LDH和MDA漏出量測定 取各組培養(yǎng)液上清，分別按各自檢測試劑盒操作說明書步驟進(jìn)行操作、檢測和計算LDH和MDA漏出量。

2.6 心肌細(xì)胞凋亡率檢測 細(xì)胞凋亡的檢測采用Annexin V／PI凋亡檢測試劑盒。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，PBS清洗，加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI至細(xì)胞懸液中，輕輕搖勻，置冰浴中反應(yīng)10 min，加入400μl預(yù)冷的binding buffer至樣品中，1 h內(nèi)上機檢測（激發(fā)光488 nm；發(fā)射光578 nm），各組陽性細(xì)胞百分率用于表示細(xì)胞凋亡水平。

2.7 W estern blot檢測蛋白的表達(dá) 取各組心肌細(xì)胞，加裂解液，離心后吸取上清液，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。各組取30μg上樣，SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液室溫封閉1 h后分別加入一抗GRP78和CHOP多克隆抗體和β-actin單克隆抗體，濃度均為1∶500，4℃孵育過夜，相應(yīng)二抗孵育1.5 h，濃度1∶5 000?；瘜W(xué)發(fā)光ECL顯色。電泳成像系統(tǒng)定量掃描分析，結(jié)果以β-actin校正。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理，結(jié)果以ˉx±s表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩之間均數(shù)比較采用q檢驗。

3 結(jié)果

3.1 Res對心肌細(xì)胞肥大的影響 與正常對照組比較，ISO作用后心肌細(xì)胞表面積和心肌肥大標(biāo)志基因ANPmRNA表達(dá)明顯增加，Res抑制了ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積和ANP表達(dá)，兩組數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。Res對照組對心肌細(xì)胞表面積和ANP基因表達(dá)無影響（Fig 1，2）。

Fig 1 Effect of resveratrol on cell surface area of primary cultured neonatal rat cardiomyocytes（ˉx±s，n＝6）＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs ISO group

Fig 2 Effect of resveratrol on mRNA expression of ANP of primary cultured neonatal rat cardiomyocytes±s，n＝5）＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs ISO group.

3.2 Res對細(xì)胞培養(yǎng)液LDH和MDA漏出量的影響 ISO組培養(yǎng)液中LDH和MDA漏出量均高于正常對照組 （P＜0.01），表明ISO可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。白藜蘆醇干預(yù)后，LDH和MDA漏出量與ISO組比較明顯降低 （P＜0.01），表明白藜蘆醇對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用（Tab 1）。

3.3 Res對心肌細(xì)胞凋亡的影響 Tab 1顯示，ISO組心肌細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對照組 （P＜0.01）。與ISO組相比，Res干預(yù)組心肌細(xì)胞凋亡率降低 （P＜0.05），表明Res可以對抗ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，Res對照組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

Tab 1 Effect of resveratrol on content of LDH and MDA in culturemedium and value of cell apoptosis（±s，n＝6）

Tab 1 Effect of resveratrol on content of LDH and MDA in culturemedium and value of cell apoptosis（±s，n＝6）

＃＃P＜0.01 vs control；*P＜0.05，**P＜0.01 vs ISO

Group LDH／U·L－1 MDA／μmol·g－1 Pro Value of cell apoptosis／%Control 458.4±26.3 4.3±0.8 14.7±2.5 ISO 725.3±28.2＃＃ 8.6±1.1＃＃ 32.6±2.7＃＃Res＋I(xiàn)SO 507.9±29.3** 5.1±1.3** 19.5±3.2*Res 484.5±25.6 4.1±0.9 15.1±1.9

3.4 Res對GRP78和CHOP基因和蛋白表達(dá)的影響 實時定量PCR（Fig 3）與Western blot（Fig 4）結(jié)果顯示，ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后GRP78和CHOP基因和蛋白表達(dá)均明顯高于正常對照組（P＜0.01，P＜0.05），白藜蘆醇干預(yù)后，抑制 GRP78和CHOP基因和蛋白表達(dá)水平，與ISO組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig 3 Effect of resveratrol on gene expression of GRP78 and CHOP of primary cultured neonatal rat cardiom yocytes（±s，n＝5）＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs ISO group

4 討論

心肌肥大既是心力衰竭的重要代償方式，又是心力衰竭發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。心肌肥大時表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大，但無細(xì)胞分裂，常伴有胚胎基因的表達(dá)增多。臨床上已將分泌型蛋白質(zhì)如ANP和BNP編碼基因表達(dá)的上調(diào)作為判斷心肌肥大的分子標(biāo)志［4］。本實驗觀察到 ISO作用心肌細(xì)胞后，心肌細(xì)胞表面積增大，胚胎基因ANP表達(dá)增加，這些結(jié)果表明ISO可成功復(fù)制心肌肥大細(xì)胞模型。

Fig 4 Effect of resveratrol on protein expression of GRP78 and CHOP of primary cultured neonatal rat cardiom yocytes（xˉ±s，n＝5）＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs ISO group.

本實驗從細(xì)胞水平觀察白藜蘆醇對心肌肥大的保護(hù)作用，研究結(jié)果顯示，ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的同時伴有心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和MDA含量增加，LDH和MDA是反映心肌損傷的重要生化指標(biāo)，二者水平增加表明ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重。機制可能與ISO抑制心肌細(xì)胞葡萄糖的有氧氧化，氧自由基產(chǎn)生增多、膜脂質(zhì)過氧化增強和心肌細(xì)胞鈣超載有關(guān)。白藜蘆醇干預(yù)后，心肌細(xì)胞表面積和ANP基因表達(dá)下降，同時LDH和MDA漏出量減少，說明白藜蘆醇抑制心肌細(xì)胞肥大的同時，可能通過抗氧化、清除自由基發(fā)揮對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

白藜蘆醇是一類廣泛存在于植物中的多酚化合物，在缺血／再灌注性心肌損傷、動脈粥樣硬化以及冠心病等方面對心血管系統(tǒng)具有明顯的保護(hù)作用。近年來，大量研究觀察了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在心力衰竭［5］、心室負(fù)荷增加所致心肌肥厚［6］、心肌缺血／再灌注損傷［7］、慢性心肌缺血［8］、藥物所致心肌損傷［9］、心臟停搏／復(fù)蘇［10］等多種心肌疾病進(jìn)程中的作用，對其干預(yù)也成為心臟疾病治療的重要研究方向。但是，關(guān)于白藜蘆醇的心肌保護(hù)作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系的研究較少。目前認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要涉及3個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜效應(yīng)蛋白：iron responsible element1（IRE1）、PKR like ER kinase（PERK）和 activating transcription factor6（ATF6）。正常情況下，這3種蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)都與GRP78結(jié)合而處于無活性狀態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡表現(xiàn)為大量未折疊蛋白聚集，由于GRP78與未折疊蛋白質(zhì)具有更高的親和力，導(dǎo)致GRP78與PERK、ATF6、IRE1解離，由此促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，并啟動上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激3條主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。因此，GRP78被視為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的感受器，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的標(biāo)志因子。然而，當(dāng)ERS嚴(yán)重或持續(xù)得不到緩解，則通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡通路而觸發(fā)細(xì)胞死亡［11，2］。

本實驗觀察到與正常對照組比較，ISO組心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加，GRP 78和CHOP基因和蛋白水平均上調(diào)，白藜蘆醇干預(yù)后降低了細(xì)胞凋亡率同時下調(diào)GRP78和CHOP的表達(dá)，表明白藜蘆醇對ISO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和過度的ERS反應(yīng)有保護(hù)作用。心肌細(xì)胞凋亡是慢性壓力超負(fù)荷情況下，心肌肥大向心力衰竭轉(zhuǎn)變的可能機制之一。除了細(xì)胞內(nèi)兩條經(jīng)典的凋亡途徑即死亡受體活化和線粒體損傷途徑外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動的凋亡途徑是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑，包括CHOP／GADD153基因的激活通路、JNK激活通路和 caspase-12激活通路［12］。GADD153／CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時，通過啟動CHOP轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，抑制CHOP的表達(dá)，有助于保護(hù)細(xì)胞對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡。

研究表明［13］，缺血／再灌注損傷能夠激活 ERS通路凋亡前體蛋白分子CHOP的表達(dá)，而通過抑制缺血后心肌細(xì)胞CHOP的表達(dá)，能夠明顯減少凋亡的百分率，從而減輕缺血／再灌注對心臟的損害。我們的結(jié)果提示ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大時，蛋白質(zhì)合成增加造成持續(xù)、嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊反應(yīng)，影響新合成蛋白質(zhì)的折疊和糖基化，從而啟動蛋白質(zhì)質(zhì)量控制機制，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，GRP78和CHOP活化后通過介導(dǎo)相應(yīng)信號通路引起心肌細(xì)胞凋亡。白藜蘆醇通過減輕ERS，抑制氧自由基，從而拮抗ISO誘導(dǎo)的心肌凋亡和肥大，實現(xiàn)其對心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用。

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