鄭 喜，李國(guó)紅，王 芯，祁 燕，萬(wàn)春平

（1.云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650021；2.云南大學(xué)云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650021）

植物內(nèi)生菌是一種新的微生物資源，它能影響藥用植物活性成分的產(chǎn)生和積累，因此通過(guò)植物內(nèi)生真菌獲取活性物質(zhì)是一條有效的途徑。國(guó)內(nèi)、外對(duì)昆明山海棠的研究主要集中在化學(xué)成分及免疫抑制、抗腫瘤活性的研究，但對(duì)其內(nèi)生真菌以及抑菌、殺線蟲研究較少［1－4］。本研究基于“藥用植物－內(nèi)生菌－活性成分”的研究思路，以昆明山海棠內(nèi)生真菌為研究對(duì)象，通過(guò)內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物化學(xué)成分分離與抑菌、殺蟲效應(yīng)有機(jī)結(jié)合的研究，從中發(fā)現(xiàn)具有活性的代謝產(chǎn)物，以期對(duì)昆明山海棠資源二次開發(fā)和生態(tài)環(huán)境平衡產(chǎn)生積極意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Bruker DRX-500型核磁共振儀；Bruker Avance III-600 NMR型超導(dǎo)核磁共振儀；Finnigan LCQ-Advantage型質(zhì)譜儀；薄層層析用硅膠板和柱層析硅膠G（200-300目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（Amersham Pharmacia公司）。分離所用的有機(jī)溶劑均為重蒸的工業(yè)純?cè)噭?/p>

1.2 供試菌株、病原菌、線蟲 菌株ThF-11分離于昆明山海棠；大腸桿菌Escherichia coli、蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus、枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa均保藏于云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)。以秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans作為供試線蟲。

1.3 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）（馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g，蒸餾水定容至1 000 ml，pH值自然）；LB培養(yǎng)基（NaCl 10 g、Tryptone 10 g、Yeast Extract 5 g，去離子水定容至 1 000 ml，pH 7.0）；燕麥片培養(yǎng)基（燕麥片 20 g，蒸餾水 80 ml）。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 DNA的提?。?］將真菌 ThF-11菌絲（0.5～1 g）在液氮中迅速研磨成粉；加入500μl 65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液，快速振蕩混勻，65℃水浴30 min，期間混勻2～3次；加入50μl5 mol·L－1KAc，冰浴20 min；用酚（pH 8.0）∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）和氯仿∶異戊醇（24∶1）各抽提1次（10 000 r·min－1，4℃離心5 min）；取上清，加入 2／3倍體積的－20℃預(yù)冷異丙醇，混勻，靜置約30 min；用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀，用75%乙醇反復(fù)漂洗2次，10 000 r·min－1，4℃離心 15 min，棄上清，吹干沉淀，重懸于500μl TE buffer中；加入1μl RNaseA（20 g·L－1），37℃處理 1 h，－20℃保存?zhèn)溆谩NA提取緩沖液：100 mmol·L－1Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol·L－1EDTA（pH 8.0），1.5 mol·L－1NaCl，2%CTAB（W／V），4%PVP40（W／V）和 2%巰基乙醇（V／V），PVP和巰基乙醇使用前加入5 mol·L－1KAc。

1.4.2 ITS系列擴(kuò)增

真菌 ITS擴(kuò)增通用引物：ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3′）。

1.4.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收和測(cè)序 PCR結(jié)束后，進(jìn)行濃度2% 的瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)以5μl的DNA maker作為標(biāo)準(zhǔn)參照，130V，15 min。然后用Biotake的DNA純化回收試劑盒，按說(shuō)明書要求對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。檢測(cè)后的目的DNA片段的樣品，送華大基因測(cè)序。

1.5 提取與分離 菌株ThF-11發(fā)酵8 L，減壓濃縮至500 m l，發(fā)酵液經(jīng)正丁醇萃取、濃縮合并得粗提物10.8 g，粗提物過(guò)大孔樹脂，分別用去離子水（3 L）、30%乙醇（5 L）、60%乙醇（5 L）、95%乙醇（5 L）依次洗脫，得6個(gè)組分 A1～A6。A1～A2（2.56 g）甲醇溶解，拌樣，過(guò)硅膠柱，石油醚－丙酮系統(tǒng)（40∶1，30∶1，20∶1；V／V）梯度洗脫，再利用 Sephedex LH-20甲醇凝膠進(jìn)一步純化得到化合物［1］；將A3（1.14 g）過(guò)凝膠柱，甲醇洗脫，得到 3個(gè)組分（A3.1～A3.3），然后將 A3.3（0.686 g）等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干過(guò)硅膠柱，石油醚－丙酮系統(tǒng)（25∶1，20∶1，15∶1；V／V）梯度洗脫，再經(jīng) Sephedex LH-20丙酮凝膠進(jìn)一步純化得到化合物［2］；將A4～A5合并的B組分（2.44 g）過(guò)凝膠柱，甲醇洗脫，得2個(gè)組分B1～B2，再將B1（0.565 g）過(guò)凝膠柱，甲醇洗脫，得到3個(gè)組分（B1.1～B1.3），將 B1.2（0.427 g）等量硅膠拌樣，自然風(fēng)干過(guò)硅膠柱，石油醚－丙酮系統(tǒng)（40∶1，30∶1，20∶1，15∶1，10∶1；V／V）梯度洗脫，得到化合物［3］。

1.6 殺線蟲活性的測(cè)定 線蟲培養(yǎng)于燕麥片培養(yǎng)基，使用時(shí)洗出配成線蟲懸液（2×105條·L－1），取0.9 ml線蟲懸液于16孔板中，加入0.1 ml相應(yīng)濃度（1 000、800、600、400、200 mg·L－1）的化合物，對(duì)照組加入等體積的甲醇，混勻后放于28℃溫箱，每一處理重復(fù)3次。在解剖鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)視野定時(shí)（12、24、36、48 h）觀察，如線蟲僵直，針刺無(wú)反應(yīng)視為死亡，記下觀察到的死線蟲數(shù)。線蟲的校正死亡率用以下公式計(jì)算：

其中，M（mortality）表示線蟲校正死亡率，Nt表示實(shí)驗(yàn)組的總線蟲數(shù)，Nts表示實(shí)驗(yàn)組存活線蟲數(shù)，Nc對(duì)照組的總線蟲數(shù)，Ncs為對(duì)照組存活線蟲數(shù)。通過(guò)校正致死率計(jì)算出化合物對(duì)線蟲的致死中濃度LC50。

1.7 抑菌活性的測(cè)定 以病原菌S.aureus、B.subtilis、B.scereus、E.Coli和P.aeruginosa為供試菌株，采用抑菌圈法［6］和試管法［7］測(cè)定化合物抑菌活性。抑菌圈法測(cè)試濃度分別為 800、400、200μg·disc－1，等量甲醇作為對(duì)照。37℃培養(yǎng)12 h觀察、測(cè)量抑菌圈的直徑（含濾紙片的直徑6 mm），每個(gè)抑菌圈在垂直方向上測(cè)兩次取平均值，抑菌圈直徑大小表示抑菌效果；同時(shí)用二倍梯度稀釋法分別進(jìn)行平板（500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5、3.906 25 mg·L－1）和試管（1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 mg·L－1）測(cè)試化合物［1］和［3］對(duì)五種細(xì)菌的最低抑菌濃度，綜合評(píng)價(jià)化合物的抑菌效果。

2 結(jié)果

2.1 菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 用通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和 ITS5 （5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收和測(cè)序，并進(jìn)行ITS比對(duì)，與簡(jiǎn)青霉Penicillium Simplicissimum相似度達(dá)98%，因此鑒定該菌株為簡(jiǎn)青霉。

2.2 化合物結(jié)構(gòu) 運(yùn)用1H-NMR、13C-NMR、MS等分析方法，對(duì)化合物［1］－［3］進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)構(gòu)見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Chem ical structures of［1］-［3］

化合物［1］：無(wú)色晶體；1H-NMR（CDCl3，600 MHz）：1.74（s，CH3），3.89（s，OCH3），5.10（s，H-2），5.17（s，H-6），5.45（s，H-6）；13CNMR （CDCl3，150 MHz）：17.6 （Me），60.2（OCH3），89.5（C-2），103.2（C-4），116.5（C-6），139.6（C-5），171.6（C-1），179.4（C-3）.ESI-MS：171［M＋H］＋與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)［8］一致，因而鑒定該化合物結(jié)構(gòu)為Penicillic acid。

化合物［2］：白色粉末；1H-NMR（CDCl3，500 M Hz）：2.25（3H，s，CH3-6），3.76（3H，s，OCH3-4），3.86（3H，s，OCH3-2），6.30（1H，d，J＝2.7 Hz，H-3），6.36（1H，d，J＝2.7 Hz，H-5）；13CNMR（CDCl3，125 MHz）：153.1（C-4），147.1（C-2），138.3（C-2），124.2（C-1），107.0（C-5），97.2（C-3），56.4（C-2），56.2 16.1（C-4），ESIMS：189［M＋H］＋與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)［9］一致，鑒定該化合物結(jié)構(gòu)為 2，4-dimethoxy-6-methylphenol。

化合物［3］：無(wú)色晶體；1H-NMR（CDCl3，500 M Hz）：0.68（3H，d，J＝6.9 Hz，CH3-7），2.49（1H，m，H-5），3.49（1H，d，J＝10.0 Hz，H-6b），3.75（1H，t，J＝ 10.0 Hz，H-6a），3.87（3H，s，OCH3-3），5.09（1H，s，H-2）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）：178.8（C-3），171.7（C-1），106.8（C-4），89.9（C-2），65.5（C-6），60.1（OCH3-3），38.0（C-5），11.4（C-7），ESI-MS：189［M＋H］＋與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)［10］一致，因此確定其結(jié)構(gòu)為5（6）-dihydropenicillic acid。

2.3 殺線蟲活性結(jié)果 殺蟲活性測(cè)試表明，化合物［2］和［3］無(wú)殺蟲活性，化合物［1］具有較強(qiáng)的殺蟲作用，在12、24、36和48 h化合物對(duì)秀麗隱桿線蟲C.elegans的 LC50分別為 1 325.25、829.39、611.26、453.40 mg·L－1，呈現(xiàn)良好的量效和時(shí)效關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Corrected morbidity（%）of compound 1 on C.elegans

Tab 2 M inimal inhibitory concentration（M IC，p late assay）of compound 1 and 3 on the grow th of five bacteria

Tab 3 M inimal inhibitory concentration（M IC，tubemethod）of compound 1 and 3 on the grow th of five bacteria

2.4 抑菌活性結(jié)果 采用最低抑菌濃度值法（MIC，平板法和試管法）評(píng)估化合物［1］和［3］對(duì)5種病原菌的抑菌活性。Tab 2、3結(jié)果顯示，化合物［1］對(duì)5種病原菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，其抑菌效果明顯強(qiáng)于化合物［3］，且具有較好的量效關(guān)系。試管法的抑菌效價(jià)比平板法高，這可能與藥物對(duì)病原菌作用速度及時(shí)間有關(guān)［11］。

3 討論

昆明山海棠［Tripterygiumhypoglaucum（Levl.）Hutch，THH］為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，又名六方藤、紫金藤、火把花等，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)。始載于《滇南本草》，具有祛風(fēng)通絡(luò)、活血化淤的功效，為拉祜族、哈尼族、彝族等常用藥［12］。現(xiàn)代研究表明，昆明山海棠主要含有生物堿、萜類、色素類等多種成分，具有抗炎、抗腫瘤及免疫抑制等多種藥理活性［1－4］。但對(duì)其內(nèi)生真菌以及抑菌、殺線蟲研究較少［13］。

內(nèi)生菌與宿主植物間的關(guān)系復(fù)雜，歸納為相互作用、互利共生。內(nèi)生菌對(duì)宿主植物的作用主要有：調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、抗蟲害、抗菌性、抗逆性、促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物的合成等。植物內(nèi)生菌存在于各種植物中，抗菌活性菌株分布廣泛，是抗菌物質(zhì)的重要潛在來(lái)源，一方面，有些內(nèi)生菌能夠分泌與宿主相同或相似的抗菌物質(zhì)；再者，很多內(nèi)生菌會(huì)產(chǎn)生新穎的活性物質(zhì)［13］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1］，昆明山海棠植物內(nèi)無(wú)青霉酸（Penicillic acid），因此推測(cè)昆明山海棠內(nèi)生真菌可能增強(qiáng)宿主植物產(chǎn)生抗蟲害和抗菌性，從而產(chǎn)生具有抗生素樣具有抑菌、抗蟲害的代謝產(chǎn)物。

植物病原線蟲是植物病害的主要病原之一，而且種類多樣，每年對(duì)世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的損失。隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，化學(xué)殺蟲劑的應(yīng)用逐步受到限制，因此對(duì)線蟲防治研究成為焦點(diǎn)和重點(diǎn)。內(nèi)生真菌普遍存在于植物體內(nèi)，且能夠產(chǎn)生較多的生物活性物質(zhì)［14］，因此從次級(jí)代謝物中尋找殺線蟲活性物質(zhì)已成為新的研究熱點(diǎn)。本研究首次從昆明山海棠中分離內(nèi)生菌株ThF-11，其代謝化合物［1］、［2］和［3］均首次從昆明山海棠內(nèi)生真菌中獲得，所得化合物［1］表現(xiàn)出較強(qiáng)殺蟲活性。該研究進(jìn)一步拓展了民族藥昆明山海棠應(yīng)用價(jià)值，為其二次開發(fā)應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)病害蟲的防治提供了理論依據(jù)和參考，對(duì)開發(fā)云南地產(chǎn)植物藥材，促進(jìn)中藥資源的保護(hù)、生態(tài)環(huán)境的平衡、社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前有關(guān)代謝化合物［1］對(duì)于模式生物秀麗隱桿線蟲的作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

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