李 琳，李彥林，周云豐，王麗麗，李志強，葛爭艷，郭宇潔，金 龍，任 燁，許 揚

（1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100093；2.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院實驗研究中心，北京 100091）

糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變研究中，采用胰蛋白酶消化視網(wǎng)膜是視網(wǎng)膜鋪片技術(shù)中關(guān)鍵的一環(huán)。目前，國內(nèi)外文獻中報道的胰蛋白酶視網(wǎng)膜消化方法主要是針對短時間固定的組織，以4%甲醛或Carson’s固定液固定 24～48 h后進行胰酶消化［1－4］。但由于實驗研究中常因操作技術(shù)和實驗安排等原因，視網(wǎng)膜組織長時間固定的情況也較多見。筆者在糖尿病大鼠眼球病理學研究中發(fā)現(xiàn)，采用常規(guī)條件消化長時間固定的視網(wǎng)膜，消化效果比較差，大量組織附著在視網(wǎng)膜血管周圍，無法獲取干凈的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)進行鋪片、染色和相應(yīng)的病理學研究。本實驗對不同時間甲醛固定的眼球視網(wǎng)膜組織，設(shè)計了不同的消化液濃度和消化時間，得到了完整清晰的視網(wǎng)膜消化鋪片效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠，32只，♂，體質(zhì)量180～220 g。購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（京）2012－0001］，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所SPF級動物房內(nèi)［許可證號：SYXK（京）2013－0023］，20℃，照明 12h晝夜交替，大鼠自由攝食和飲水。

1.1.2 主要試劑 PBS（Solarbio）；胰蛋白酶（1∶250，Amresco）；馬來酸（Sigma，M0375）；氫氧化鈉（北京益利精細化學品有限公司，20071105）；Tris（Amresco，AR0497）。

1.1.3 儀器 pH計（上海精密科學儀器有限公司，型號 PHS-25）；電熱恒溫鼓風干燥箱（型號DHG-9140A）；脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號 TS-2000A）；Olympus正置顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號BX53）。Nikon多功能連續(xù)變焦顯微鏡（日本尼康公司，型號：AZ100）。

1.2 方法

1.2.1 動物處死及取材固定 正常大鼠32只，購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗時頸椎脫臼法處死，立即摘取眼球，4%甲醛溶液固定2 d、2周、1月、3月、5月和7月。

1.2.2 胰蛋白酶液的配制 分別取 1 mol·L－1馬來酸溶液 10 ml、1 mol·L－1Tris溶液 10 ml、0.5 mol·L－1NaOH溶液24 ml，加蒸餾水稀釋至100 ml，調(diào)節(jié)pH為7.8，配制Tris-Maleic稀釋液。用Tris-Maleic稀釋液分別配制3%、6%、9%胰蛋白酶，4℃保存。

1.2.3 視網(wǎng)膜鋪片的制備 分別將固定2 d、2周、4周、3月、5月、7月的眼球分離視網(wǎng)膜。自睫狀體后部近鋸齒緣剪開鞏膜，去掉眼前節(jié)和玻璃體，將眼后段平均分成3份，在PBS中輕輕分離視網(wǎng)膜。將視網(wǎng)膜在PBS中浸洗過夜，每個眼球的3份視網(wǎng)膜分別放在3%、6%、9%胰蛋白酶消化，將按照Fig 1的消化方法進行操作。

Fig 1 Protocol for retina digestion time and trypsin concentration in formalin fixed eye

分離好的視網(wǎng)膜組織胰蛋白酶消化液中，37℃恒溫箱孵育。孵育過程中，將視網(wǎng)膜移入PBS中，輕輕吹打，使殘余的視網(wǎng)膜神經(jīng)成分及內(nèi)界膜完全脫去。繼續(xù)消化直至視網(wǎng)膜消化完全。記錄不同固定時間的大鼠眼球組織的視網(wǎng)膜在3個濃度消化液中完全消化分別所需的時間。消化結(jié)束后，在蒸餾水中輕輕吹去視網(wǎng)膜血管網(wǎng)上黏附的細胞，平鋪在防脫載玻片上，自然干燥。行PAS染色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。在光鏡下攝取并記錄視網(wǎng)膜消化的狀況。實驗重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1 眼球組織常規(guī)固定后視網(wǎng)膜消化鋪片 固定時間48 h，在37℃3%胰蛋白酶消化3.5 h，顯示視網(wǎng)膜消化完全，顯微鏡下可見清晰視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，血管周細胞和內(nèi)皮細胞核深染，并具有完整的輪廓（Fig 2）。

Fig 2 Retinal blood vessel of conventional fixed retina digested in 3%trypsin（A：×100，B：×400）

2.2 大鼠眼球組織固定2周及1月后視網(wǎng)膜消化鋪片 對于甲醛固定2周及1月的大鼠眼球，按照“2.1”的方法進行消化，通過實際摸索，消化時間需要延長，固定2周的大鼠眼球分離的視網(wǎng)膜組織以消化9 h為最適宜時間，而固定1月的大鼠眼球分離的視網(wǎng)膜組織則需要延長至14 h。實驗結(jié)果表明，不改變胰蛋白酶的濃度，僅延長胰蛋白酶的消化時間，仍得到了常規(guī)固定時間同樣的實驗結(jié)果（Fig 3）。

2.3 大鼠眼球組織固定3月后視網(wǎng)膜消化鋪片固定3月后的大鼠眼球分離的視網(wǎng)膜組織，用3%胰蛋白酶消化時，每2 h通過肉眼及光學顯微鏡觀察，消化至22 h時，視網(wǎng)膜組織完全消化（Fig 4A）。胰蛋白酶濃度增加至6%，延長消化時間至20 h，視網(wǎng)膜組織達到完全消化的程度（Fig 4C）。而胰蛋白酶濃度增加至9%，視網(wǎng)膜組織同樣需要經(jīng)過20 h達到完全消化的程度（Fig 4E）。3%、6%與9%的胰蛋白酶均能將視網(wǎng)膜組織充分消化，提示固定3月的大鼠眼球的視網(wǎng)膜消化適宜胰蛋白酶消化濃度為3%，消化時間為22 h。提高胰蛋白酶濃度對于縮短視網(wǎng)膜消化時間的影響不大。

2.4 大鼠眼球組織固定5月后視網(wǎng)膜消化鋪片采用3%胰蛋白酶消化固定5月后的大鼠眼球分離的視網(wǎng)膜組織，消化至24 h時，視網(wǎng)膜組織可大部分消化，但仍有部分組織存在（Fig 5A）。延長消化時間，血管周圍殘余的非血管組織仍然存在，且隨著消化時間的延長，視網(wǎng)膜血管容易出現(xiàn)斷裂而得不到完整的視網(wǎng)膜血管網(wǎng)。將胰蛋白酶的濃度分別增加至6%和9%，隨著消化時間延長，消化的程度明顯增加，且達到完全消化的程度均需要經(jīng)過22 h（Fig 5C，5E）。6%與9%的胰蛋白酶濃度對視網(wǎng)膜組織均能達到充分消化的程度，提示固定5月的大鼠眼球視網(wǎng)膜組織的適宜胰蛋白酶消化濃度為6%，消化時間為22 h。

Fig 3 Retinal blood vessel of 2 week-fixed and 1month-fixed retina digested in 3%trypsin（A，C：×100，B，D：×400）A，B：fixed for 2 weeks；C，D：fixed for 1 month

Fig 4 Retinal blood vessel of 3 month-fixed retina digested in 3%，6%，9%trypsin（A，C，E：×100，B，D，F(xiàn)：×400）

Fig 5 Retinal blood vessel of 5 month-fixed retina digested in 3%，6%，9%trypsin（A，C，E：×100，B，D，F(xiàn)：×400）

2.5 大鼠眼球組織固定7月后視網(wǎng)膜消化鋪片采用同樣的方法對固定7月后的大鼠眼球視網(wǎng)膜組織進行消化，3%胰蛋白酶消化至30 h時，視網(wǎng)膜組織上存在部分非血管組織（Fig 6A），且由于消化時間的延長，視網(wǎng)膜血管容易出現(xiàn)斷裂而明顯影響視網(wǎng)膜血管網(wǎng)的完整性。將胰蛋白酶的濃度分別增加至6%和9%，消化時間延長至28 h，視網(wǎng)膜組織均可以達到完全消化的程度（Fig 6C，6E）。6%與9%的胰蛋白酶濃度對視網(wǎng)膜組織的消化均能達到充分的程度，提示固定7月的大鼠眼球視網(wǎng)膜組織的適宜胰蛋白酶消化濃度為6%，消化時間為28 h。

3 討論

視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)是研究視網(wǎng)膜血管病變的一種重要技術(shù)。要制作良好的視網(wǎng)膜血管鋪片，需要對視網(wǎng)膜組織進行充分的胰蛋白酶消化。長期以來，視網(wǎng)膜組織胰蛋白酶消化的方法都是按照1960年Kuwabara等［1］創(chuàng)立的方法進行。通過視網(wǎng)膜血管鋪片技術(shù)，可以清晰觀察到視網(wǎng)膜微血管的清晰結(jié)構(gòu)及細胞狀態(tài)，以及病理狀態(tài)下的微血管增生、血管內(nèi)皮細胞丟失等改變［2－3，5－6］。但是在對糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究中，筆者發(fā)現(xiàn)對于長時間固定的大鼠眼球，分離視網(wǎng)膜組織后，常規(guī)濃度的胰蛋白酶消化液和常規(guī)消化時間均無法使視網(wǎng)膜消化完全。

Fig 6 Retinal blood vessel of 7 month-fixed retina digested in 3%，6%，9%trypsin（A，C，E：×100，B，D，F(xiàn)：×400）

視網(wǎng)膜血管由于其特殊的物質(zhì)組成，對胰蛋白酶具有抵抗，因此胰蛋白酶不能消化視網(wǎng)膜血管［7］。在胰蛋白酶消化視網(wǎng)膜過程中，胰蛋白酶通過水解細胞間結(jié)合處蛋白，將細胞分開，使視網(wǎng)膜神經(jīng)成分和內(nèi)界膜脫離血管網(wǎng)，得到完整的視網(wǎng)膜血管層。胰酶分散細胞的活性與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)。研究中我們發(fā)現(xiàn)，隨著視網(wǎng)膜組織固定時間的延長，消化難度逐漸增大。因為甲醛在常溫時能自動聚合為三聚甲醛，而醛基對蛋白質(zhì)形成廣泛的交聯(lián)作用［8］。短時間固定，胰蛋白酶可以打開蛋白質(zhì)間交聯(lián)；長時間固定，蛋白質(zhì)間緊密交聯(lián)，因此需要通過提高胰蛋白酶濃度、延長消化時間，增加胰酶分散細胞的活性。

本研究首先采用常規(guī)濃度胰蛋白酶，對常規(guī)固定眼球的視網(wǎng)膜組織進行消化，消化時間為3.5h得到完整視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，與文獻報道［3，5，9］的消化時間一致。在此基礎(chǔ)上，我們摸索了較短時間固定的眼球視網(wǎng)膜組織的最佳消化條件，發(fā)現(xiàn)對于甲醛固定2周及1月的大鼠眼球，采用常規(guī)胰蛋白酶濃度（3%），僅延長胰蛋白酶的消化時間至9 h及14 h，可以達到與常規(guī)固定24～48 h同樣的消化效果。在上述實驗基礎(chǔ)上，筆者進一步摸索了更長時間固定的眼球視網(wǎng)膜組織的最佳消化條件。研究結(jié)果表明，對于固定3月的大鼠眼球，采用常規(guī)濃度的胰蛋白酶僅延長消化時間至22 h，同樣可以得到完整的視網(wǎng)膜血管鋪片，且提高胰蛋白酶濃度對于縮短視網(wǎng)膜消化時間的影響不大。而對于固定5～7月的大鼠眼球，隨著消化時間的延長，視網(wǎng)膜血管容易出現(xiàn)斷裂，這可能是消化過度而造成了血管細胞的損傷。當胰蛋白酶濃度提高到6%和9%時，固定5月及7月視網(wǎng)膜消化的時間延長至22 h和28 h，則可得到相對消化完整的視網(wǎng)膜血管。

過度的胰酶濃度可造成組織細胞的損傷，在本研究中也得到了證實。因此，在實驗過程中，掌握合適的胰酶濃度和消化的時間顯得尤為重要。對于甲醛固定的組織，隨著固定時間延長，醛基對蛋白質(zhì)形成的交聯(lián)被牢固封閉，蛋白酶無法使長期被掩蓋的抗原決定簇重新暴露［8］，然而針對這種抗原遮蔽可以采用抗原修復(fù)的方法來解除部分交聯(lián)，減輕對免疫組化染色造成的影響［10］。同時有文獻報道［11］，腦組織在固定液中長時間浸泡，對于其超微結(jié)構(gòu)的電鏡檢查造成的影響是微不足道的。我們的實驗結(jié)果表明，固定達7月眼球組織的視網(wǎng)膜經(jīng)過適當濃度和時間進行胰酶消化，可得到和短時間固定的眼球組織相同的清晰形態(tài)學結(jié)構(gòu)，對于研究受試物對視網(wǎng)膜的病理形態(tài)學影響具有明顯的實用價值。而視網(wǎng)膜的亞細胞結(jié)構(gòu)的病理學研究、視網(wǎng)膜組織的超微結(jié)構(gòu)是否能夠得到理想的結(jié)果，還需要進一步深入研究。

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