馬艷霞，王明艷 1，，姜澤群，趙鳳鳴1，，杭愛武

（南京中醫(yī)藥大學(xué)1.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210023）

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果實(shí)，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫等功效［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，山茱萸具有抗菌、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血脂、抗氧化等作用［2］。本課題組前期研究表明，山茱萸炮制增效部位（石油醚萃取部位、正丁醇萃取部位、醇沉多糖部位等）對(duì)老年小鼠的大腦衰老有一定的保護(hù)作用［3］。有文獻(xiàn)研究山茱萸環(huán)烯醚萜總苷可通過促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)而發(fā)揮腦保護(hù)作用［4］。馬錢苷和莫諾苷屬于山茱萸環(huán)烯醚萜苷類，對(duì)于這兩種成分抗大腦衰老的作用尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在探討馬錢苷和莫諾苷對(duì)大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，為山茱萸的抗腦衰老、神經(jīng)保護(hù)作用提供更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑 馬錢苷、莫諾苷（江蘇省藥檢所，含量≥98%）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國(guó) Amresco）；二甲基亞砜（DMSO，廣東光華化學(xué)廠有限公司）；SOD、MDA、GDNF、bFGF試劑盒（南京建成生物研究所）；兔抗 p-ERK1／2、p-MEK1／2、Bax、caspase-3抗體（美國(guó) Cell Signaling Technology公司）；β-actin、HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG（聯(lián)科生物科技技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物有限公司）。

1.2 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó) BIO-RAD公司）；CKX-31倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生1～2 d的SD大鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)：scxk（蘇）2008－004。

2 方法

2.1 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 參考李燁等［5］方法并改進(jìn)，取出生1～2 d的SD大鼠，酒精消毒后，超凈臺(tái)內(nèi)撕開頭皮和顱骨，暴露兩側(cè)大腦半球，小心取出顳葉皮層，置解剖液中，清洗，轉(zhuǎn)入0.125%胰酶中，反復(fù)吹打至組織塊完全消失，液體呈渾濁狀。將液體用等體積含10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，過200目尼龍篩網(wǎng)，1 500 r·min－1離心 12 min，傾去上清，加入含 10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基使聚集細(xì)胞重懸，種植在75 cm2培養(yǎng)瓶中。置37℃，5%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后換液1次，之后每3～4天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)9～12 d，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部，置恒溫?fù)u床（37℃，250 r·min－1）連續(xù)震搖20 h，進(jìn)行純化，舍棄含脫落細(xì)胞的細(xì)胞懸液，以去除少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定 具體步驟如下：爬片細(xì)胞用預(yù)熱PBS洗3次，每次10 min；4%多聚甲醛室溫下固定 10 min，PBS洗 3次，每次 10 min；0.1%Triton X-100作用5 min，PBS洗3次，每次10 min；10 g·L－1BSA封閉30 min；加入抗 GFAP抗體，4℃放置過夜；PBS洗3次，每次10 min，加熒光二抗室溫避光放置2 h；PBS洗去多余的熒光抗體，洗3次，每次10 min；顯微鏡觀察照相。

2.3 D-半乳糖造模實(shí)驗(yàn) 將純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞消化，離心后，加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基重懸，種植于96孔板中，分為正常組、D-半乳糖造模4、8、20、40 g·L－1組。在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別孵育48 h。孵育后每孔加20μl 5 g·L－1MTT溶液，37℃溫育4 h，吸出上清液，每孔加150μl DMSO，混勻后用酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定每孔0D值，計(jì)算各組抑制率。

2.4 馬錢苷、莫諾苷對(duì)D-半乳糖致衰星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用

2.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 空白組、模型組（D-半乳糖40 g·L－1）、馬錢苷組（馬錢苷 0.1 g·L－1＋D-半乳糖40 g·L－1）、莫諾苷組（莫諾苷 0.1 g·L－1＋D-半乳糖 40 g·L－1）。

2.4.2 細(xì)胞存活率檢測(cè) 取96孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好的星形膠質(zhì)細(xì)胞，按照上述分組給藥后37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。MTT操作步驟同上。

2.4.3 SOD、MDA含量測(cè)定 取每孔細(xì)胞上清液50μl，按南京建成生物研究所提供的測(cè)定試劑盒說明書操作，結(jié)果分別以 kU·g－1及 μmol·g－1表示。

2.4.4 GDNF、bFGF的測(cè)定 取適量每組細(xì)胞上清液，按南京建成生物研究所提供的測(cè)定試劑盒說明書操作，結(jié)果分別以 μg·L－1、ng·L－1表示。

2.4.5 Western blot檢測(cè)各蛋白表達(dá) 按常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。將各組蛋白與上樣緩沖液混勻，95℃～100℃煮沸變性，取各組細(xì)胞的總蛋白50μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。按1∶1 000濃度稀釋一抗，搖床搖蕩孵育（4℃，過夜），充分洗滌，將HRP結(jié)合的二抗按1∶5 000濃度室溫?fù)u蕩孵育1 h，充分洗膜，加ECL發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)曝光，重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以ˉx±s表示，各組數(shù)據(jù)采用One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用q檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 GFAP免疫熒光結(jié)果 GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架蛋白，為星形膠質(zhì)細(xì)胞所特有，可作為成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物［6］。采用免疫熒光染色對(duì)GFAP進(jìn)行鑒定顯示絕大多數(shù)細(xì)胞為GFAP陽(yáng)性，說明培養(yǎng)的細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞，見Fig 1。

Fig 1 GFAP immunofluorescenceBluemarker is cell nucleus.Green colour is GFAP fluorescence coloration.

3.2 D-半乳糖造模實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)證明，作用48 h，D-半乳糖濃度20 g·L－1，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞抑制率為15.41%，40 g·L－1時(shí)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制率為52.69%，與空白組比較差異具有顯著性（P＜0.01）。因此本次實(shí)驗(yàn)選擇 40 g·L－1的 D-半乳糖為合適的造模濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見Tab 1。

Tab 1 D-galactose-induced aging test±s，n＝6）

Tab 1 D-galactose-induced aging test±s，n＝6）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Group Dose／g·L－1OD value Inhibitory rate／%Control － 0.84±0.04 －D-galactose 4 0.82±0.05 1.80±0.03 8 0.79±0.03 5.19±0.09 20 0.71±0.07* 15.41±0.06*40 0.39±0.05**52.69±4.60**

3.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率檢測(cè) 與空白組比較，模型組細(xì)胞增殖抑制率達(dá)52.91%，馬錢苷、莫諾苷組細(xì)胞增殖抑制率與模型組比較，分別降低了20%、24%，差異具有顯著性（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab 2。

Tab 2 Effects of loganin and morroniside on proliferation activity of aging astrocytesˉx±s，n＝6）

Tab 2 Effects of loganin and morroniside on proliferation activity of aging astrocytesˉx±s，n＝6）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Group OD value Inhibitory rate／%Control 0.87±0.05**－Model 0.41±0.05 52.91±6.48 Loganin 0.59±0.02* 32.71±1.31*Morroniside 0.62±0.07** 28.31±1.26**

3.4 SOD和MDA含量檢測(cè) 模型組SOD活力低于正常組，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量升高。馬錢苷、莫諾苷組抗氧化酶活力較模型組升高，脂質(zhì)過氧化物含量較模型組降低，差異有顯著性（P＜0.05）。見 Tab 3。

Tab 3 Content of SOD and MDA±s，n＝5）

Tab 3 Content of SOD and MDA±s，n＝5）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Group SOD／kU·g－1 MDA／μmol·g－1 Control 13.47±0.45**0.13±0.07 Model 11.17±0.55 2.76±0.49 Loganin 13.10±0.30** 2.03±0.27*Morroniside 12.97±0.47** 1.67±0.53**

3.5 GDNF、bFGF含量的檢測(cè) 模型組 GDNF、bFGF含量低于正常組，馬錢苷、莫諾苷均可提高D-半乳糖致衰老的星形膠質(zhì)細(xì)胞的GDNF、bFGF分泌量，差異有顯著性（P＜0.05）。見 Tab 4。

Tab 4 Content of GDNF and bFGF（±s，n＝5）

Tab 4 Content of GDNF and bFGF（±s，n＝5）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Group GDNF／μg·L－1 bFGF／ng·L－1 Control 467.22±23.07** 89.03±11.62*Model 391.11±38.20 59.43±28.89 Loganin 463.34±42.19** 104.07±27.06*Morroniside 456.62±24.06* 104.30±21.55*

3.6 W estern blot蛋白表達(dá)結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示，D-半乳糖造成星形膠質(zhì)細(xì)胞p-MEK1／2、p-ERK1／2蛋白表達(dá)降低，馬錢苷、莫諾苷給藥后可增加兩蛋白的表達(dá)，Bax、caspase-3在各組中表達(dá)較少且無差異。見Fig 2，各組蛋白灰度值見Tab 5。

Tab 5 Expressions of related proteins inastrocytes of each group（±s，n＝3）

Tab 5 Expressions of related proteins inastrocytes of each group（±s，n＝3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Group p-MEK1／2／β-actin p-ERK1／2／β-actin Control 0.76** 0.54*Model 0.49 0.27 Loganin 0.97** 0.40*Morroniside 0.73* 0.67**

Fig 2 Expressions of related proteins in astrocytes of each group by W estern BlotA：Control group；B：Model group；C：Loganin group；D：Morroniside group

4 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)目較多的一類大膠質(zhì)細(xì)胞，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，始終伴隨著神經(jīng)元的整個(gè)發(fā)育過程，與神經(jīng)元相互作用，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)從胚胎發(fā)生到老化的各個(gè)活動(dòng)［7］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)起結(jié)構(gòu)支持作用，維持血管、神經(jīng)元胞體、軸突和突觸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，參與血腦屏障，對(duì)腦內(nèi)微環(huán)境的建立和保持起了基礎(chǔ)性作用。其中，對(duì)于神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)、修復(fù)等多種功能是通過分泌大量的神經(jīng)因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞識(shí)別因子實(shí)現(xiàn)的，比如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等［8］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，馬錢苷、莫諾苷給藥組可以提高GDNF、bFGF這兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌。

D-半乳糖致腦衰老是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，主要機(jī)制是D-半乳糖在半乳糖氧化酶作用下，生成醛糖和過氧化氫，反應(yīng)過程中產(chǎn)生超氧陰離子自由基，及大量氧自由基，其過量會(huì)引起多種生物大分子損傷，影響基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平降低等衰老改變。超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除多種自由基。丙二醛是脂質(zhì)過氧化物分解產(chǎn)物，可引起多種毒性反應(yīng)，形成老年斑、脂褐素等異常代謝產(chǎn)物，造成機(jī)體衰老和多種疾病。本實(shí)驗(yàn)采用體外D-半乳糖致星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老模型，考慮到D-半乳糖是通過代謝途徑導(dǎo)致的細(xì)胞衰老，實(shí)驗(yàn)中我們選擇48 h為合適的造模時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，馬錢苷、莫諾苷可通過提高D-半乳糖致衰星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖能力，提高衰老細(xì)胞的抗氧化能力，發(fā)揮抗衰老作用。

我們進(jìn)而初步探討了bFGF、GDNF這兩種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。星形膠質(zhì)細(xì)胞合成神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子bFGF、GDNF增加，繼而與其相應(yīng)的受體結(jié)合后，可啟動(dòng)并激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中最重要的一條就是MEK／ERK信號(hào)通路。在接受細(xì)胞外信號(hào)刺激后，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是唯一能在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭往返的組件，活化的ERK可將胞外的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)傳遞至核內(nèi)，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化及基因表達(dá)［9－10］。本實(shí)驗(yàn)研究首次發(fā)現(xiàn)D-半乳糖作用后，星形膠質(zhì)細(xì)胞中 MEK1／2、ERK1／2蛋白的磷酸化水平降低，而對(duì)于凋亡蛋白Bax、caspase-3的表達(dá)并無影響，提示D-半乳糖造成的星形膠質(zhì)細(xì)胞衰老不是影響細(xì)胞的凋亡，而主要是影響了膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步增殖。而馬錢苷和莫諾苷處理后，可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MEK1／2、ERK1／2迅速磷酸化。由此，我們推測(cè)馬錢苷和莫諾苷可能通過激活細(xì)胞內(nèi)MEK／ERK信號(hào)通路，并進(jìn)一步激活下游轉(zhuǎn)錄因子入核調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，提高D-半乳糖致衰的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖能力，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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