馬劍敏 靳 萍，郭 萌，代克巖，徐婷婷，楊 程，藺慶偉

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453007;2.河南省環(huán)境污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黃淮水環(huán)境與污染防治省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng) 453007)

富營養(yǎng)化已成為當(dāng)今世界普遍面臨的水環(huán)境問題，它會(huì)影響水體中浮游植物和浮游動(dòng)物種群的變化，從而改變生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能［1-2］。藍(lán)藻水華的頻繁發(fā)生是富營養(yǎng)化淡水水體的一個(gè)主要表現(xiàn)，如何控制藍(lán)藻水華則成為現(xiàn)今的水體生態(tài)環(huán)境研究熱點(diǎn)［3］。經(jīng)過多年理論研究和實(shí)踐達(dá)成共識(shí)，生態(tài)修復(fù)是長期有效的控制水華的最佳方式。而生態(tài)修復(fù)中有兩種重要而有效的措施:利用生物操縱［4］和大型水生植物來控制藻類［4-6］。

生物操縱是通過浮游動(dòng)物的攝食(下行作用)，達(dá)到直接控制浮游植物的目的。一些研究發(fā)現(xiàn)［7-8］，以水溞等大型透明溞動(dòng)物占優(yōu)勢的湖泊中浮游植物生物量和生產(chǎn)力較低。而大型水生植物不僅能與浮游植物競爭營養(yǎng)、光照、空間等資源［9-10］，還能分泌化學(xué)物質(zhì)抑制浮游植物的生長［11-12］。兩者相輔相成，最終獲得良好的抑藻效果。Benndorf最早提出了生物操縱的磷負(fù)荷閾值問題［13］，但不同學(xué)者對(duì)磷負(fù)荷閾值范圍的研究結(jié)果并不一致，有人認(rèn)為該范圍為 0.05—0.15 mg/L［14］，有人認(rèn)為是 0.25mg/L［15］，因此適用于我國水體的磷濃度條件需要進(jìn)一步研究。不僅如此，當(dāng)水體中的磷濃度超過某一限度后，以大型沉水植物為主的清潔型草型穩(wěn)態(tài)就會(huì)轉(zhuǎn)化為以浮游植物為主的渾濁型藻型穩(wěn)態(tài)的水生態(tài)系統(tǒng)［5］。且生物操縱能否有效和大型沉水植物能否恢復(fù)重建這兩者之間是有關(guān)聯(lián)的。所以磷濃度閾值是需要研究的關(guān)鍵。而之前我們也對(duì)這方面做了一些初步研究［16］，但研究尚不完善，有必要進(jìn)一步研究在富營養(yǎng)化水體中實(shí)施生物操縱和恢復(fù)大型沉水植物所需的磷濃度。銅綠微囊藻是藍(lán)藻水華中占主要優(yōu)勢的藻類，大型溞是牧食浮游植物的重要浮游動(dòng)物，因此選擇銅綠微囊藻、大型溞和金魚藻為實(shí)驗(yàn)材料，研究不同的磷濃度對(duì)三者相互作用的影響，為治理水華和恢復(fù)健康水體環(huán)境提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa，F(xiàn)ACHB573)購自中國科學(xué)院水生生物研究所，保存在BG-11培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為溫度25℃，光暗比14h∶10h，光強(qiáng)2000—3000lx。實(shí)驗(yàn)前將其在BG-11培養(yǎng)基中馴化3次后擴(kuò)大培養(yǎng)。進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，便可作為實(shí)驗(yàn)接種藻種。

大型溞(Daphnia magna):實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行純化培養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前的馴化(溫度 25℃，光強(qiáng) 2000—3000lx，光暗比14h∶10h)，使用同一母體繁殖三代以上的出生6—24h的幼齡期大型溞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

金魚藻(Ceratophyllum demersum):采集于牧野湖，取回實(shí)驗(yàn)室后用自來水清洗干凈，培養(yǎng)于BG-11培養(yǎng)基中，放在實(shí)驗(yàn)室靠窗的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水清洗3遍，選取生長良好、長勢一致的長15cm的頂枝做實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 培養(yǎng)液的配制

以BG-11培養(yǎng)基［17］為基礎(chǔ)，根據(jù)之前的預(yù)實(shí)驗(yàn)配制成11mg/L氮濃度下磷濃度梯度為0.2、0.5、1.0、1.5mg/L的培養(yǎng)液，然后用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到7.5;氮濃度的設(shè)置以重富營養(yǎng)化水質(zhì)為參考，磷濃度則覆蓋從中度到重度富營養(yǎng)化水質(zhì)的范圍。所有培養(yǎng)液及器皿均高壓滅菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 接種方法

將經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)的銅綠微囊藻細(xì)胞接種于無氮無磷的BG-11培養(yǎng)液中饑餓培養(yǎng)2d，以去除藻細(xì)胞中蓄積的氮、磷，之后倒取適量藻液，4000r/min離心15min，棄去上清液，再用無菌蒸餾水洗滌2次，棄去上清液，以去除吸附性營養(yǎng)，最后稀釋成所需的藻細(xì)胞濃度。均為無菌操作。

1.3.2 銅綠微囊藻和大型溞共培養(yǎng)

在250mL的錐形瓶中加入150mL BG-11培養(yǎng)液及5個(gè)大型溞，然后加入不同體積的銅綠微囊藻藻液，每個(gè)銅綠微囊藻密度梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)10d，觀察大型溞的繁殖情況，以確定最適宜大型溞繁殖的藻細(xì)胞密度(表1)。經(jīng)單因素方差分析，各密度組之間的大型溞數(shù)目差異著性(P＜0.05);最適宜藻細(xì)胞密度為1.48×105個(gè)/mL。

表1 大型溞在不同密度的銅綠微囊藻中培養(yǎng)時(shí)的數(shù)量變化Table 1 The quantitative change of D.magna cultured in different M.aeruginosa density

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所確定的適宜的銅綠微囊藻密度，在不同磷濃度梯度培養(yǎng)液的錐形瓶中，加入等量的銅綠微囊藻藻液調(diào)節(jié)成1.5×105個(gè)/mL的藻密度，放入5個(gè)形態(tài)相似的大型溞，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)(25±1℃，14h ∶10h，2000—3000lx)培養(yǎng) 15d，每個(gè)磷濃度3個(gè)重復(fù)，每隔3d添加適量培養(yǎng)液。測定銅綠微囊藻密度和大型溞數(shù)目、以及各培養(yǎng)液中總氮和總磷的濃度，計(jì)算各指標(biāo)的變化率，以確定不同磷濃度下各指標(biāo)的變化趨勢。

1.3.3 金魚藻對(duì)銅綠微囊藻的化感作用

金魚藻種植水對(duì)銅綠微囊藻的化感作用:在不同磷濃度培養(yǎng)液的1000mL錐形瓶中，加入相同質(zhì)量的金魚藻置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)15d后，取出金魚藻，補(bǔ)充與改良的BG-11培養(yǎng)液相同的氮、磷，接種相同密度的銅綠微囊藻后再于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d(25±1℃，14h ∶10h，2000—3000lx)，每個(gè)磷濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每隔3d添加適量培養(yǎng)液。以同樣條件下單獨(dú)培養(yǎng)的銅綠微囊藻為對(duì)照(3個(gè)重復(fù))。測定藻細(xì)胞密度、以及各培養(yǎng)液中總氮和總磷的濃度，計(jì)算各指標(biāo)的變化率。

金魚藻與銅綠微囊藻共培養(yǎng):與上述化感實(shí)驗(yàn)條件相同，讓金魚藻和銅綠微囊藻共培養(yǎng)，此外，再增加單獨(dú)培養(yǎng)的金魚藻作為對(duì)照(3個(gè)重復(fù))。測定銅綠微囊藻密度和金魚藻生物量、以及各培養(yǎng)液中總氮和總磷的濃度，計(jì)算各指標(biāo)的變化率。

1.3.4 銅綠微囊藻、大型溞和金魚藻三者共培養(yǎng)

在含不同磷濃度培養(yǎng)液的1000mL燒杯中，加入等量的銅綠微囊藻藻液調(diào)節(jié)成相同的藻密度，然后加入相同重量的金魚藻和5個(gè)形態(tài)相似的大型溞，置于培養(yǎng)箱內(nèi)(25±1℃，14h ∶10h，2000—3000lx)培養(yǎng)15d，每個(gè)磷濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每隔3d添加適量培養(yǎng)液。測定銅綠微囊藻密度、大型溞數(shù)目和金魚藻生物量、以及各培養(yǎng)液中總氮和總磷的濃度，計(jì)算各指標(biāo)的變化率。

1.4 測定指標(biāo)

銅綠微囊藻細(xì)胞密度:在分光度計(jì)上掃描銅綠微囊藻的藻液在400—800nm的吸光值，確定銅綠微囊藻最大吸收峰的波長為680nm(圖1)。以相同初始條件接種3瓶銅綠微囊藻，培養(yǎng)14d，每隔2d測定1次藻液的吸光值(OD)，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)藻細(xì)胞，建立藻細(xì)胞密度與吸光值OD間的回歸方程:y=119.597x-2.107，式中x為吸光值(OD)，y為藻細(xì)胞密度(×106個(gè)/mL)，回歸系數(shù) R2=0.993，P＜0.05，因此可以用OD值直接反應(yīng)藻細(xì)胞密度。

圖1 銅綠微囊藻培養(yǎng)液在波長400—800nm下的吸光值掃描圖Fig.1 Absorbance scan of M.aeruginosa culture solution on 400—800 nm wavelength

大型溞數(shù)目:肉眼計(jì)數(shù)。

金魚藻生物量:用吸水紙吸取枝條上的多余水分后，用電子天平稱其鮮重。

總氮和總磷濃度:將培養(yǎng)液以4000r/min離心10min，取其上清液，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定［18］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用spss19.0進(jìn)行作圖及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 銅綠微囊藻和大型溞共培養(yǎng)

圖2顯示:磷濃度為0.2mg/L時(shí)，銅綠微囊藻密度增加幅度較小，大型溞的增長率大于銅綠微囊藻，培養(yǎng)液較清澈;磷濃度大于0.2mg/L時(shí)，銅綠微囊藻密度急劇增加，培養(yǎng)液變?yōu)樗{(lán)綠色?？梢娏诐舛葹?.2mg/L時(shí)，大型溞對(duì)銅綠微囊藻具有顯著抑制作用(P＜0.05);隨著磷濃度增高，大型溞對(duì)銅綠微囊藻的抑制程度減弱 (P＜0.05)。

圖2 銅綠微囊藻和大型溞共培養(yǎng)時(shí)增長率變化情況Fig.2 The change of growth rate of M.aeruginosa and D.magna when they cultured together

2.2 金魚藻和銅綠微囊藻的相互作用

用金魚藻種植水培養(yǎng)銅綠微囊藻時(shí)(圖3)，隨著磷濃度的升高，銅綠微囊藻的增長率升高，但實(shí)驗(yàn)組中銅綠微囊藻的增長率遠(yuǎn)低于對(duì)照組(P＜0.05)。磷濃度為0.2mg/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的銅綠微囊藻的增長率很低，約為接種值的40%，可見磷濃度越低時(shí)金魚藻種植水對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果越明顯。

金魚藻與銅綠微囊藻共培養(yǎng)時(shí)(圖3)，隨著磷濃度的增高，銅綠微囊藻的增長率逐漸增大，對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組的金魚藻增長率均逐漸減小，實(shí)驗(yàn)組的金魚藻增長率顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，原因是微囊藻與金魚藻之間存在競爭，甚至存在化感作用。磷濃度為0.2mg/L時(shí)，金魚藻對(duì)銅綠微囊藻有較高的抑制作用，銅綠微囊藻的密度比起始降低了20%;磷濃度介于0.5—1.5mg/L時(shí)，金魚藻生物量明顯下降，而銅綠微囊藻受到的抑制作用減弱，其密度呈現(xiàn)正增長。對(duì)比圖3中微囊藻的增長率可以發(fā)現(xiàn)，金魚藻種植水的抑藻效果明顯小于兩者共培養(yǎng)時(shí)的抑藻效果，原因是:后者除了有化感作用外，還有金魚藻對(duì)銅綠微囊藻的競爭作用;此外，也可能是兩種條件下金魚藻分泌的抑藻物質(zhì)的量有所不同，或抑藻物質(zhì)進(jìn)入水環(huán)境后隨時(shí)間延長效力下降所致。

圖3 銅綠微囊藻和金魚藻的增長率變化情況Fig.3 The change of M.aeruginosa and C.demersum growth rate on experiment

2.3 藻-溞-草共培養(yǎng)

結(jié)果表明(圖4，圖5):高氮濃度下，銅綠微囊藻密度一直保持負(fù)增長，且隨著磷濃度的增大，負(fù)增長趨勢逐漸增大。說明銅綠微囊藻的種群數(shù)量得到了顯著抑制(P＜0.05)。金魚藻生物量隨磷濃度的升高而減少，磷濃度為0.2mg/L時(shí)，其生物量增量顯著高于其他3個(gè)磷處理組(P＜0.05)。大型溞數(shù)目隨磷濃度的升高而增加，各濃度組之間存在顯著差異(P＜0.05)。

圖4 三者共培養(yǎng)時(shí)銅綠微囊藻和金魚藻的增長率變化Fig.4 The change of M.aeruginosa and C.demersum growth rate when M.aeruginosa，D.magnaand C.demersum cultured together

圖5 三者共培養(yǎng)時(shí)大型溞的增長率變化情況Fig.5 The change of D.magna growth rate when M.aeruginosa，D.magna and C.demersum cultured together

2.5 不同組合下共培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)液中氮磷的去除效果

由圖6可見:銅綠微囊藻和大型溞共培養(yǎng)時(shí)，4個(gè)磷濃度梯度間的除氮效果有顯著差異(P＜0.05)，氮去除率最高為45%;磷平均去除率在50%以上，磷濃度為0.2、0.5mg/L時(shí)去除率(約70%—80%)均高于其他兩個(gè)濃度?；袑?shí)驗(yàn)時(shí)，磷濃度為0.5mg/L時(shí)的氮磷去除效果均高于其他3個(gè)濃度。銅綠微囊藻和金魚藻共培養(yǎng)時(shí)，隨著磷濃度的升高，磷去除率增大，最高可達(dá)到95%;4個(gè)磷濃度梯度間的除氮效果有顯著差異，對(duì)氮的去除率，在1.0mg/L磷濃度下，氮平均去除率均顯著高于其他磷濃度下的去除率(P＜0.05)。可見，銅綠微囊藻和金魚藻共存時(shí)的氮、磷去除效果和化感實(shí)驗(yàn)時(shí)的去除效果完全不同。在三者共培養(yǎng)時(shí)，磷濃度為0.5mg/L時(shí)，對(duì)磷的去除率均顯著高于其他濃度(P＜0.05);隨著磷濃度升高，氮去除率增大，4個(gè)組之間除氮效果差異顯著(P＜0.05)。

圖6 水中總氮和總磷去除率Fig.6 Theremovalrate change oftotalnitrogen and total phosphorus

3 討論

本實(shí)驗(yàn)清楚地表明了富營養(yǎng)化水體中生物操縱的效果會(huì)受到磷濃度以及N/P比的明顯影響。磷與銅綠微囊藻的生長關(guān)系密切，且水體中的磷濃度易受到人為因素的影響。本研究中，對(duì)于0.2、0.5、1.0和1.5mg/L的磷濃度，N/P比分別為55/1、22/1、11/1、7.3/1。實(shí)驗(yàn)中，磷濃度升高時(shí)，銅綠微囊藻的增長率也隨之增大。沈宏等［19］的研究表明，微囊藻對(duì)磷的攝取存在積累性，微囊藻的生長取決于藻細(xì)胞內(nèi)的磷濃度。因此隨著培養(yǎng)液中磷的不斷消耗，細(xì)胞內(nèi)的磷含量增加，而低磷培養(yǎng)液首先出現(xiàn)磷限制，高磷培養(yǎng)液中的銅綠微囊藻密度逐漸超過低磷培養(yǎng)液，銅綠微囊藻的細(xì)胞增長率高于低磷培養(yǎng)液。陳國永等［20］也指出細(xì)胞內(nèi)磷增加有利于銅綠微囊藻生長，藻體內(nèi)的磷對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。

銅綠微囊藻和大型溞共培養(yǎng)時(shí)，兩者的種群數(shù)量均隨磷濃度的升高而增加。磷濃度為0.2mg/L時(shí)，銅綠微囊藻的增長相對(duì)于其它高磷濃度較為緩慢，且存在大型溞的攝食作用，藻的增長率更加減小，前者的增長率低于后者，因而大型溞在磷濃度為0.2mg/L時(shí)占優(yōu)勢。這一結(jié)果和有的學(xué)者提出的生物操縱在0.05—0.15mg/L的磷濃度時(shí)有較好的抑藻效果［14］的結(jié)論接近，但范圍略大。表明生物操縱的效果的確與水體的磷負(fù)荷有密切關(guān)系。也直接反映許多學(xué)者的研究事實(shí)，大型浮游動(dòng)物的攝食可短期內(nèi)控制浮游植物生物量，卻不能長期有效控制藍(lán)藻水華的急速增加，不能維持生物操縱效果的穩(wěn)定性和長期性。從氮磷比的角度看，磷的相對(duì)缺乏有利于大型溞控制藻。

銅綠微囊藻和金魚藻共培養(yǎng)時(shí)，磷濃度為0.2mg/L(N/P=55/1)時(shí)，金魚藻在競爭中占優(yōu)勢，而銅綠微囊藻的生長受到抑制;當(dāng)磷濃度大于0.2mg/L(N/P比為22/1—7.3/1)時(shí)，隨著磷濃度升高，銅綠微囊藻的種群數(shù)量增大，而金魚藻的增長率最低降到初始值的60%。在磷濃度為0.2mg/L時(shí)，金魚藻生長狀況最好，表明高磷濃度不利于金魚藻生長，與王珺等［21］的研究結(jié)果一致。原因是營養(yǎng)鹽濃度超過金魚藻抗逆能力時(shí)，嚴(yán)重影響金魚藻的生理活動(dòng)，對(duì)金魚藻的生長產(chǎn)生脅迫現(xiàn)象，從而使它的抗逆性弱化。而隨著磷濃度的升高，銅綠微囊藻增長率增大，是因?yàn)榱诐舛鹊脑黾訉?duì)藻細(xì)胞的增長有促進(jìn)作用;從氮磷比的角度分析，浮游植物與大型沉水植物競爭時(shí)，較高的氮磷比對(duì)大型沉水植物有利。金魚藻的生物量最大時(shí)，銅綠微囊藻的生長受到抑制，說明金魚藻通過對(duì)重要生態(tài)因子(光、空間、營養(yǎng)等)的競爭、以及向水中釋放化感物質(zhì)［22］，從而抑制藻的生長。Scheffer等認(rèn)為［15］，0.25mg/L以內(nèi)的磷負(fù)荷下，淺水湖泊可以通過大型沉水植物固定營養(yǎng)物而維持清潔狀態(tài)，高于此濃度，浮游植物將會(huì)占據(jù)優(yōu)勢。

三者共培養(yǎng)時(shí)，銅綠微囊藻和大型溞的增長率變化趨勢相反。在所有的磷濃度下(N/P比為55/1—7.3/1)，銅綠微囊藻均處于負(fù)增長狀態(tài)，金魚藻和大型溞處于正增長狀態(tài)，尤其是大型溞的增幅更為明顯。表明三者共培養(yǎng)時(shí)，銅綠微囊藻始終受到明顯的抑制，而大型溞和金魚藻則一直處于優(yōu)勢。說明在藻-溞系統(tǒng)中，大型沉水植物的加入，可以提高浮游動(dòng)物枝角類對(duì)水華藻類的控制效果。因?yàn)榇笮退参餅楦∮蝿?dòng)物提供了良好的棲息場所，水生植物的光合作用，增加水體溶氧量，為浮游動(dòng)物的生長和繁殖提供足夠的氧氣;大型沉水植物不僅同浮游植物競爭光照和營養(yǎng)，還可能分泌化感物質(zhì)，從而抑制浮游植物的生長和發(fā)展［22］，使水體透明度提高，水質(zhì)得到改善。反映了生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性和生物多樣性的提高，有利于增強(qiáng)大型沉水植物的競爭力和控制水華藻類的效果。生物操縱的開拓者Shapiro認(rèn)為，生物操縱之后，必須恢復(fù)水生植被才能維持清水態(tài)湖泊生態(tài)系統(tǒng)［23］。許多研究也表明［24-25］，大型沉水植物可以有效地降低淺水湖泊中營養(yǎng)物質(zhì)的含量，從而顯著提高富營養(yǎng)水體的水質(zhì)，對(duì)氮、磷污染有明顯的凈化作用，可維持水體長期穩(wěn)定于清澈狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)中氮磷去除率的結(jié)果也證明了這點(diǎn)。

綜上可見，生物操縱與水生植被重建同時(shí)進(jìn)行是可以實(shí)現(xiàn)的。合理的生物操縱和重建大型水生植物相結(jié)合，可以有效的控制浮游植物的過量生長，凈化水體。

鑒于上述結(jié)論只是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬自然水生態(tài)條件下研究的結(jié)果，與實(shí)際水體的復(fù)雜性還有很大的差距，其結(jié)論的實(shí)際應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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