阮昊，鄭小玲，陳悅

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310004)

分子排阻色譜法測定注射用磺芐西林鈉中高分子聚合物

阮昊，鄭小玲，陳悅

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310004)

目的 建立測定注射用磺芐西林鈉中高分子聚合物的方法。方法采用Sephadex G-10凝膠色譜柱,以pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液[0.1 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液∶0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]為流動相A,以水為流動相B,流速1.5 mL·min-1,檢測波長254 nm。結(jié)果磺芐西林高分子聚合物與磺芐西林能較好分離,磺芐西林對照品在進(jìn)樣量為含磺芐西林0.59～47.46 μg范圍內(nèi),線性關(guān)系良好(r=0.999 9);供試品溶液在20.68～40.48 mg·mL-1范圍內(nèi),溶液濃度與聚合物峰面積呈良好線性關(guān)系(r=0.999 4);重復(fù)性較好(RSD=4.3%,n=5);重現(xiàn)性較好(RSD=4.8%,n=3)。結(jié)論該方法簡便,結(jié)果可靠,可以用于注射用磺芐西林鈉中高分子聚合物的檢測。

磺芐西林鈉；高分子聚合物；分子排阻色潽

磺芐西林屬廣譜半合成青霉素類抗生素,主要適用于對本品敏感的銅綠假單胞菌、變形桿菌屬以及其他敏感革蘭陰性菌所致的肺炎、尿路感染、復(fù)雜性皮膚軟組織感染和敗血癥等[1]。

磺芐西林鈉致變態(tài)反應(yīng)常見。多年來的研究已證明,在β-內(nèi)酰胺類抗生素所致的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中,藥物分子本身只是半抗原,藥物中存在的高分子聚合物才引發(fā)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)[2],因此嚴(yán)格控制抗生素中高分子聚合物的含量有著重要的意義?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版采用Sephadex G-10凝膠色譜柱柱床體積變小,減少了分析時(shí)間(45～60 min)[3]。在水中,磺芐西林鈉由于分子間的氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用等可以形成締合物[4],與高分子聚合物具有相似的色譜行為,因此可以采用藥物自身為對照品,按外標(biāo)法計(jì)算。筆者在文獻(xiàn)[5-6]的基礎(chǔ)上,優(yōu)化并建立了測定注射用磺芐西林鈉中的聚合物的方法,縮短了分析時(shí)間,為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量提供了參考。

1 儀器與試藥

上海金達(dá)生化儀器有限公司KFG-1抗生素高聚物分析系統(tǒng)(紫外檢測器),色譜柱為葡聚糖凝膠G-10 (40～120 μm)填充柱(內(nèi)徑1.0 cm,柱高40 cm)?；瞧S西林鈉對照品(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,批號: 20040601,含量:82.4%);注射用磺芐西林鈉(蘇州二葉制藥有限公司,批號:080501;瑞陽制藥有限公司,批號:08122212);葡聚糖凝膠Sephadex G-10為進(jìn)口分裝(Amersham Biosciences);磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、藍(lán)色葡聚糖2 000(GE Pharmacia)均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 用葡聚糖凝膠G-10(40～120 μm)為填充劑,玻璃柱(1.0 cm×40 cm),以pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液[0.1 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液∶0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]為流動相A,以水為流動相B,流速1.5 mL·min-1,檢測波長為254 nm。量取0.2 mg·mL-1藍(lán)色葡聚糖2 000溶液100 μL,注入液相色譜儀,分別以流動相A、B進(jìn)行測定,理論板數(shù)按藍(lán)色葡聚糖2000峰計(jì)算,在流動相A與B中理論板數(shù)及拖尾因子均符合要求,理論板數(shù)為872,919,均大于700,拖尾因子為1.44,1.16,均＜2.0。

2.2 分離度實(shí)驗(yàn) 根據(jù)《中華人民共和國藥典》2010年版[3]附錄ⅤH分子排阻色譜法規(guī)定,檢查高分子聚合物時(shí),某些藥物分子單體與其聚合體不能達(dá)到基線分離時(shí),其分離度計(jì)算公式為:R=高聚體的峰高/單體與高聚體之間的谷高。

分離度實(shí)驗(yàn)溶液:由于高分子聚合物的對照品不易獲得,而樣品中的高聚物又極少,在配制分離度溶液時(shí),適當(dāng)加入藍(lán)色葡聚糖2 000,使聚合物峰增大。藍(lán)色葡聚糖2 000系在葡萄糖T2 000(平均相對分子質(zhì)量2 000 000)上引入多環(huán)生色團(tuán)冷凍干燥而成。在凝膠過濾法中,用于各種類型葡萄糖的床空隙容積的測定和校核柱的填充。一般藍(lán)色葡聚糖2 000的加入量是使聚合物峰面積達(dá)到規(guī)定限度的1～2倍。

稱取磺芐西林鈉約300 mg,置10 mL量瓶,用0.2 mg·mL-1藍(lán)色葡聚糖溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,進(jìn)樣100 μL,用流動相A進(jìn)行測定,記錄色譜圖進(jìn)行分析,得高聚物峰的含量為0.80%(擬規(guī)定限度為0.5%),分離度為2(圖1)。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液 取磺芐西林鈉對照品適量,精密稱定,加水溶解并定量制成每毫升含磺芐西林60 μg的溶液,以流動相B進(jìn)樣測定。

2.3.2 供試品溶液 取本品約0.3 g,精密稱定,置10 mL量瓶,加水適量,使溶解后,用水稀釋至刻度,搖勻,以流動相A立即進(jìn)樣測定(圖2)。

圖1 分離度實(shí)驗(yàn)色譜圖

圖2 供試品的聚合物圖譜(流動相A)1.高分子聚合物;2.磺芐西林鈉

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 已知用藍(lán)色葡聚糖2000溶液實(shí)驗(yàn)測得的流出時(shí)間(圖3),即為Kav=0。在上述規(guī)定的色譜條件下,在Kav=0時(shí),樣品中有一峰流出(tR為8.6 min),至12 min后藥物單體開始流出(圖4),且分離度符合要求。故確認(rèn)為tR為8.6 min時(shí)的峰即為聚合物峰。

2.5 對照溶液線性關(guān)系考察 精密稱取磺芐西林鈉對照品14.40 mg,置25 mL量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻。用水逐步精密稀釋,制成分別含磺芐西林5.93, 29.67,59.33,118.66,237.31和474.62 μg·mL-1的溶液,分別按“2.1”項(xiàng)色譜條件以流動相B進(jìn)行測定。以對照品濃度(C,μg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,回歸方程Y=406.84X+1 679.1,r= 0.9999,表明對照品溶液濃度在5.9～474.6 μg·mL-1范圍內(nèi)(進(jìn)樣100 μL),溶液濃度與測得的峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖3 流動相B中藍(lán)色葡聚糖2 000(A)與對照溶液(B)的色譜圖比較

2.6 定量限與檢測限 取“2.5”項(xiàng)5.93 μg·mL-1溶液,精密稀釋10倍,按“2.1”項(xiàng)色譜條件以流動相B進(jìn)行測定,記錄色譜圖,并對色譜系統(tǒng)進(jìn)行基線檢測,結(jié)果最低檢測濃度為1.02 μg·mL-1(S/N=3),計(jì)算最低檢測限為0.003%,最低檢測量0.102 μg,最低定量限0.01%(S/N=10)。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取磺芐西林鈉對照品18.96 mg,置于250 mL量瓶,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取100 μL注入液相色譜儀,按“2.1”項(xiàng)色譜條件,以流動相B為流動相進(jìn)行測定。連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄色譜圖,以峰面積計(jì)算,RSD為4.1%,小于5.0%,說明精密度良好[3]。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取注射用磺芐西林鈉樣品(蘇州二葉制藥有限公司,批號:080501)約0.3 g,稱取5份,分別置10 mL量瓶,用水溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液;另取精密度實(shí)驗(yàn)溶液,作為對照品溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定,分別精密量取100 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。含磺芐西林聚合物以磺芐西林計(jì),結(jié)果分別為0.12%,0.11%, 0.10%,0.11%,0.11%,RSD=4.3%,表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取樣品(蘇州二葉制藥有限公司,批號:080501),在不同日期按“2.8”項(xiàng)方法共測定3次,結(jié)果分別為0.11%,0.12%,0.11%,RSD=4.8%,表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 樣品取樣量對聚合物測定結(jié)果的相關(guān)性考察 分別取樣品(蘇州二葉制藥有限公司,批號:080501) 200,300,400 mg,置3個(gè)10 mL量瓶,按“2.1”項(xiàng)色譜條件以流動相A進(jìn)行測定。以供試品濃度(C, mg·mL-1)為橫坐標(biāo),高分子聚合物峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,回歸方程Y=371.87X+4 820.5,r= 0.999 4,表明供試品溶液濃度在20.68～40.48 mg·mL-1范圍內(nèi)(進(jìn)樣100 μL),供試品溶液濃度與測得的高分子聚合物峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.11 樣品的聚合物測定 按“2.3.1”和“2.3.2”項(xiàng)方法及“2.1”項(xiàng)色譜條件,測定2批樣品磺芐西林聚合物(表1)。

表1 樣品中高分子聚合物測定結(jié)果 %

3 討論

3.1 流動相的選擇 流動相A:流動相的種類和濃度可以改變?nèi)苜|(zhì)的色譜行為和分離效果[7],故選用pH 7.0的0.1,0.05,0.025 mol·L-1磷酸鹽緩沖液分別作為流動相A,流速均為1.5 mL·min-1。在pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液作為流動相A時(shí)分離最好,故選用pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液作為流動相A。

流動相B:選用水作為流動相B,用每毫升約含60 μg的磺芐西林鈉溶液,進(jìn)樣100 μL進(jìn)行測定。結(jié)果表明磺芐西林鈉在以水作為流動相的條件下能完全締合形成表觀分子量較大的締合物,在Sephadex G-10凝膠色譜系統(tǒng)中的色譜行為與聚合物相似,都在Kvo= 0處流出,表現(xiàn)為單一色譜峰,故采用自身對照外標(biāo)法。

3.2 流速的選擇 選用pH7.0的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液作為流動相A時(shí),比較流速為1.0和1.5 mL·min-1的分離情況,可見二者分離都較好。因流速為1.5 mL·min-1時(shí)分離好且較快出峰,故選用該流速。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中選用比文獻(xiàn)[6-7]鹽濃度更高的緩沖液及更快的流速,使得整個(gè)樣品的分析時(shí)間縮短一半以上,且分離效果更好。故本實(shí)驗(yàn)建立的注射用磺芐西林鈉高分子聚合物檢測方法簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,對于保證藥品質(zhì)量和用藥安全均具有重要的意義。

[1] 國家藥典委員會.臨床用藥須知[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2] 金少鴻,胡昌勤.β-內(nèi)酰胺類抗生素過敏反應(yīng)的研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志,1994,3(4):38-41.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄37,1138-1139.

[4] HU C Q,JIN S H,WANG K M.The chromatographic behaviour of cephalosporins in gel filtration chromatography,a novel method to separate high molecular with impurities[J]. Pharm Biomed Anal,1994,12(4):533-541.

[5] 田貴容,呂露陽,方梅.Sephadex G10凝膠色譜法測定磺芐西林鈉中的高分子雜質(zhì)[J].華西藥學(xué)雜志,2007,22 (6):699-700.

[6] 馬曉寧,劉雁鳴.凝膠色譜法測定注射用磺芐西林鈉的聚合物[J].中南藥學(xué),2009,7(9):659-662.

[7] 蔡姍英,胡昌勤,馮芳.β-內(nèi)酰胺抗生素在Superdex peptide凝膠過濾色譜柱上的色譜行為[J].中國抗生素雜志,2002,27(3):157-161.

DOI 10.3870/yydb.2014.03.033

R978.1;R927.1

A

1004-0781(2014)03-0386-03

2013-02-18

2013-03-20

阮昊(1981-),女,浙江杭州人,主管藥師,碩士,主要從事抗生素藥品質(zhì)量研究。電話:0571-86459427,E-mail：clare_ruan@163.com。

陳悅(1971-),男,浙江永康人,主任藥師,學(xué)士,主要從事抗生素藥品質(zhì)量研究。電話:0571-86459427,E-mail：13868057010@163.com。