馮青，劉偉，蘇楠，吳新榮

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣州 510640;2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510010;3.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510515;4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510405)

純陽正氣膠囊抑制幽門螺桿菌作用研究

馮青1，2，劉偉2，3，蘇楠2，4，吳新榮2

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣州 510640;2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510010;3.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510515;4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510405)

目的 考察純陽正氣膠囊對(duì)幽門螺桿菌(Hp)的體外抑制作用。方法采用紙片擴(kuò)散法、微量倍比稀釋法觀察純陽正氣膠囊對(duì)Hp的抑菌圈與吸光度(A)值。結(jié)果紙片擴(kuò)散法實(shí)驗(yàn)中,Hp對(duì)濃度≥0.05 g·mL-1純陽正氣膠囊藥液為中敏;通過測定菌液的A值,確定0.4,0.2,0.1 g·mL-1(按生藥計(jì))純陽正氣膠囊藥液的抑菌率分別為76.01%, 69.83%,48.52%,與陰性對(duì)照比較,均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論純陽正氣膠囊對(duì)Hp具有一定的體外抑制作用。

純陽正氣膠囊；幽門螺桿菌；抑菌作用,體外

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是一種微需氧性革蘭陰性桿菌,傳染性強(qiáng),感染后可寄生于人胃和十二指腸黏膜,引發(fā)消化性潰瘍、非潰瘍性消化不良[1],也是引發(fā)胃癌和低度胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的重要致病因素[2]。目前,廣泛采用以抗菌藥物、質(zhì)子泵抑制藥、鋁酸鉍制劑為主的三聯(lián)或四聯(lián)方法[3],但在治療過程中,廣泛使用抗菌藥物,Hp會(huì)出現(xiàn)耐藥性[4]。耐藥菌株的出現(xiàn)已成為藥物根除Hp成功率下降的主要因素。文獻(xiàn)報(bào)道,一些單味中藥[5],如蒼術(shù)[6]、陳皮[7]、丁香[8],及中藥復(fù)方如除幽湯[9](處方由茯苓、白術(shù)、法半夏等組成)、胃喜康煎劑[10](由茯苓、丹參等組成)在一定濃度下具有抑制Hp作用。純陽正氣膠囊由廣藿香、半夏、土木香、陳皮、丁香、肉桂、蒼術(shù)、白術(shù)、茯苓、朱砂、硼砂等組成,筆者在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)該藥進(jìn)行體外抑制Hp作用研究。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)鑒定 Hp(ATCC43504)購自廣州微生物研究所。培養(yǎng)基為含5%的脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂,在37℃微需氧環(huán)境[85%氮?dú)?N2)、10%二氧化碳(CO2)、5%氧氣(O2)培養(yǎng)72 h。菌株經(jīng)菌落特征、菌體形態(tài)、生理生化鑒定為Hp菌株。

1.2 藥物 純陽正氣膠囊(合肥立方制藥股份有限公司,批號(hào):110201)。陽性對(duì)照藥阿莫西林(石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司,規(guī)格:按C16H19N3O5S計(jì),每粒0.25 g,批號(hào):160110215)。

1.3 試劑及設(shè)備 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、腦-心浸出液肉湯(brain heart infusion broth,BHI,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司),無菌脫纖維羊血,微需氧產(chǎn)氣袋(英國OXOID公司),CW-CJ-2F凈化工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),LRH-250A生化培養(yǎng)箱(廣東醫(yī)療器械廠),ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器,酶標(biāo)儀(MULTISKAN GO Thermo scientific)。

1.4 藥液的制備 純陽正氣膠囊去膠囊后用鈷60(60Co)消毒,采用半仿生法原理溶解藥物,模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)原理,用pH為3.0的純化水將藥物粉末超聲溶解,過濾,未溶解藥物粉末用pH 7.0的純化水進(jìn)行超聲溶解,過濾,每次超聲時(shí)間為35 min,混合兩次濾液,調(diào)pH為中性。藥液濃度為0.4 g·mL-1(按生藥計(jì))。將中性藥液以培養(yǎng)液倍比稀釋(1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32),備用。阿莫西林采取相同方法處理。

1.5 菌懸液的制備 將接種3 d的Hp用無菌0.9%氯化鈉溶液洗下,加入腦心浸出液肉湯配成腦心浸液Hp菌懸液,用標(biāo)準(zhǔn)比濁管進(jìn)行比濁,校正菌液濃度,使菌液濃度達(dá)到1×108CFU·mL-1。

1.6 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.6.1 紙片擴(kuò)散法 取Hp懸液100 μL,均勻涂于含5%脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上,于37℃微需氧環(huán)境(85%N2、10%CO2、5%O2)平衡0.5 h。取直徑6 mm圓形滅菌濾紙片,浸入梯度濃度藥液、阿莫西林藥液、陰性對(duì)照溶液(滅菌的中性純化水),1 h,取濾紙片3張,平貼于涂布菌株的平皿內(nèi),置于37℃微需氧環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)72 h,觀察結(jié)果,取出,計(jì)算抑菌圈(包括紙片)直徑。取3張抑菌圈的平均直徑。陽性對(duì)照阿莫西林濃度分別為0.125, 0.062 5 g·mL-1。判斷標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑＞20 mm為極敏,抑菌圈直徑15～20 mm為高敏,抑菌圈直徑10～15 mm為中敏,抑菌圈直徑＜10 mm為低敏,無抑菌圈為不敏感。

1.6.2 微量倍比稀釋法 取96孔微量培養(yǎng)板,于1～5孔加入倍比稀釋的梯度濃度藥液,每孔的藥量均為100 μL,將配好的菌懸液用液體培養(yǎng)基稀釋1 000倍,使Hp菌懸液的濃度為1×105CFU·mL-1。用微量移液器將菌懸液100 μL加入對(duì)應(yīng)區(qū)的各實(shí)驗(yàn)孔中,將孔內(nèi)液體充分混勻,此時(shí)各孔含液200 μL,藥物濃度為0.2,0.1,0.05,0.025,0.012 5 g·mL-1。陰性對(duì)照孔加入液體培養(yǎng)基200 μL,陽性對(duì)照孔加入菌懸液100 μL和含陽性對(duì)照藥液體培養(yǎng)基100 μL,根據(jù)“1.6.1”項(xiàng)結(jié)果,純陽正氣膠囊內(nèi)容物藥液濃度在0.012 5 g·mL-1時(shí),對(duì)Hp無抑菌性,故在此方法中,陽性對(duì)照藥選擇對(duì)菌株有高敏性的0.125 g·mL-1的藥液。將接種好的微量培養(yǎng)板置于37℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)72 h。以上實(shí)驗(yàn)過程重復(fù)3次。酶標(biāo)儀測定吸光度(A)值:上述微量培養(yǎng)板于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后,用酶標(biāo)儀于540 nm處測各孔A值,與陽性對(duì)照孔對(duì)比,計(jì)算各濃度藥液對(duì)Hp的抑菌率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 抑菌率計(jì)算公式:抑菌率(%)= (陽性對(duì)照A值-實(shí)驗(yàn)A值)/(陽性對(duì)照A值-陰性對(duì)照A值)×100%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,并采用SPSS 17.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紙片擴(kuò)散法抑菌結(jié)果 結(jié)果表明,幽門螺桿菌對(duì)0.05 g·mL-1藥液有一定的敏感性。

表1 不同濃度藥液的抑菌圈直徑及敏感性Tab.1 Inhibition zone diameters and sensitivities of different concentrations of solutions mm,±s,n=3

表1 不同濃度藥液的抑菌圈直徑及敏感性Tab.1 Inhibition zone diameters and sensitivities of different concentrations of solutions mm,±s,n=3

組別濃度/(g·mL-1)抑菌圈/mm 敏感性純陽正氣膠囊藥液0.213.1±0.265中敏0.111.5±0.153中敏0.0510.5±0.115中敏0.0257.8±0.153低敏0.012 50.0±0.0不敏感陰性對(duì)照0.00.0±0.0不敏感陽性對(duì)照0.12518.7±0.265高敏0.062 510.9±0.187中敏

2.2 微量倍比稀釋法抑菌結(jié)果 結(jié)果表明藥液濃度>0.1 g·mL-1具有體外抑制Hp的作用,見表2。與陰性對(duì)照相比,濃度≥0.1 g·mL-1的藥液(按生藥計(jì))對(duì)Hp有抑制作用。

表2 Hp在不同濃度藥液中生長72 h后的A值及抑菌率Tab.2 A values and bacteriostasis rate on H.pylori 72 hours after growth in different concentration of solutions ±s,n=3

表2 Hp在不同濃度藥液中生長72 h后的A值及抑菌率Tab.2 A values and bacteriostasis rate on H.pylori 72 hours after growth in different concentration of solutions ±s,n=3

與陰性對(duì)照組比較,*1P＜0.05Compared with negative control group,*1P＜0.05

組別濃度/(g·mL-1)A值抑菌率/%純陽正氣膠囊藥液0.40.482 4±0.011 1*176.01 0.20.517 8±0.006 0*169.83 0.10.639 9±0.011 7*148.52 0.050.871 4±0.018 28.10 0.0250.911 5±0.001 81.09陰性對(duì)照0.00.917 8±0.001 80.00陽性對(duì)照0.1250.341 7±0.010 2100.00

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,純陽正氣膠囊對(duì)Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株有一定的抑制作用,其藥液濃度與抑菌效果呈正相關(guān), 0.2 g·mL-1藥液對(duì)Hp為中敏,0.012 5 g·mL-1藥液對(duì)Hp無抑制作用。對(duì)菌株有中敏感性的藥液,與陰性對(duì)照比較,0.4,0.2,0.1 g·mL-1藥液(按生藥計(jì))對(duì)實(shí)驗(yàn)菌有抑制作用,結(jié)果表明,微量倍比稀釋法可更準(zhǔn)確判斷不同濃度藥液的抑菌率,因此純陽正氣膠囊在臨床應(yīng)用中要注意有效藥物濃度。

組成純陽正氣膠囊的16味中藥中,廣藿香和半夏兩藥為主藥。廣藿香歸脾胃、肺經(jīng),辛者散邪行氣行濕,溫者祛寒。體外實(shí)驗(yàn)證明,廣藿香中的藿香酮對(duì)大腸桿菌有抑制作用。半夏歸脾、胃、肺經(jīng),以燥濕化痰、降逆止嘔為特點(diǎn),是止吐的良藥,尤其適宜于寒濕所致的嘔吐,純陽正氣膠囊治療急性胃腸炎具有療效好、奏效快的特點(diǎn),不增加胃腸負(fù)擔(dān),無毒副作用[11]。目前Hp對(duì)抗生素的耐藥性增加,中藥治療中感染副作用小,不產(chǎn)生耐藥性,使該復(fù)方膠囊具有開發(fā)用于治療Hp感染的前景。有文獻(xiàn)報(bào)道,蒼術(shù)[6]、陳皮[7]、丁香[8]等具有體外抑菌作用,而本實(shí)驗(yàn)所用復(fù)方中含有此類具有抑菌作用的中藥成分。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.013

Inhibition Effect of Chunyang Zhengqi Capsule Against Helicobacter Pylori in vitro

FENG Qing1,2,LIU Wei2,3,SU Nan2,4,WU Xin-rong2
(1.School of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.Department of Pharmacy,General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA,Guangzhou 510010,China;3.School of Pharmaceutical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;4.School of Chinese Materia Medica,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China)

Objective To evaluate the antibacterial effect of herbal compoundchunyang zhengqicapsules againstHelicabacter pylori in vitro.MethodsThe inhibition zone andAvalue were measured by the agar disk method and trace multiple proportion dilution for evaluating the bacteriostasis ofchunyang zhengqicapsules.ResultsIt was showed thatHelicabacter pyloriwas moderately sensitive tochunyang zhengqisolution at concentrations above 0.05 g·mL-1.By measuring theAvalue of the bacteria solution,the bacterialstasis ofchunyang zhengqicapsule at 0.4,0.2,0.1 g·mL-1was 76.01%,69.83%,48.52%,respectively,which was significantly different from the negative control(P＜0.05).ConclusionThe herbal compoundchunyang zhengqicapsule has a certain inhibitory effect against H.pylori.

Chunyang zhengqicapsule;Helicobacter pylori;Bacteriostasis,in vitro

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0322-03

2013-05-15

2013-06-20

馮青(1989-),女,河北邯鄲人,在讀碩士,研究方向:藥物篩選及機(jī)制研究。電話:020-88654670,E-mail：fqyouxue@163.com。

吳新榮,女,主任藥師,博士生導(dǎo)師。電話: 020-88653476,E-mail：gzwxrong@yahoo.com。