張辰辰，楊繼章，吳丹，劉紅淼

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，石家莊 050031)

香桂化濁膠囊的HPLC-PDA指紋圖譜研究*

張辰辰，楊繼章，吳丹，劉紅淼

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，石家莊 050031)

目的 建立香桂化濁膠囊高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-PDA)指紋圖譜的分析方法,完善香桂化濁膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法以高效液相色譜法為基礎(chǔ),采用DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱,流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液,梯度洗脫,流速1.0mL·min-1,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。結(jié)果相同色譜條件下,8批香桂化濁膠囊的相似度均>0.9,藥物組成一致性較好。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,可作為香桂化濁膠囊的鑒別和質(zhì)量控制。

香桂化濁膠囊；指紋圖譜；桂皮醛；廣藿香酮；大黃素

香桂化濁膠囊處方為河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗(yàn)方,由肉桂、土大黃、廣藿香組成。具有芳香醒脾、清化濕濁之功,其療效確切。主治因各種疾病后邪留未盡、脾胃內(nèi)傷所致長(zhǎng)期大便溏泄或有黏液、腹脹腸鳴、納呆或有低熱、舌苔白膩或白滑或見(jiàn)微黃、脈濡緩；主要用于慢性腸炎、真菌感染致腸炎證屬脾虛濕困的治療。關(guān)于本方制劑工藝、質(zhì)量控制、含量測(cè)定及毒理學(xué)研究的方法已有報(bào)道［1-6］。鑒于香桂化濁膠囊在化學(xué)組成上是一個(gè)復(fù)雜體系,各成分構(gòu)成不明確,有效成分和雜質(zhì)沒(méi)有明確的劃分,化學(xué)成分間共存的相互作用不明確,而中藥指紋圖譜能夠部分反映中藥中所含化學(xué)成分的組成、數(shù)量及其適當(dāng)?shù)谋壤P(guān)系［7］。為更好地控制香桂化濁膠囊的質(zhì)量,完善其檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),筆者采用高效液相色譜(HPLC)法,建立了香桂化濁膠囊的指紋圖譜。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20A高效液相色譜儀,包括四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、光電二極管陣列(photo-diode-array, PDA)檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理工作站(日本島津公司)；BS210S型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；KQ2200E型超聲波清洗儀(頻率:40 kHz,功率: 100W,昆山市超聲儀器有限公司)；《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)》(國(guó)家藥典委員會(huì))。

1.2 試藥 甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)TEDIA公司),水為娃哈哈純凈水,其他試劑均為分析純。大黃素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110756-200110)；廣藿香酮對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):111822-201001)；桂皮醛對(duì)照品(四川省維克奇生物科技有限公司,批號(hào):101114,純度:HPLC≥98%)；香桂化濁膠囊(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院制劑室,批號(hào):120208,120222,120229,120314,120328, 120404,120411,120425)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取肉桂醛、廣藿香酮、大黃素對(duì)照品適量,分別置10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻。分別取肉桂醛、廣藿香酮和大黃素對(duì)照品各1 mL至10 m L量瓶中,用甲醇稀釋定容成濃度分別為200.00,15.87,85.16μg·m L-1的混合溶液,即得。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取香桂化濁膠囊0.74 g,置50 mL量瓶中,加甲醇至刻度,精密稱重,浸泡2 h后超聲處理30 min,冷卻后用甲醇補(bǔ)足失重,搖勻,經(jīng)孔徑0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。

2.3 色譜條件和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱: DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm,5μm)；流動(dòng)相:甲醇-乙腈-0.1%醋酸溶液,梯度洗脫,以甲醇為流動(dòng)相A,乙腈為流動(dòng)相B,0.1%醋酸溶液為流動(dòng)相C,洗脫程序見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm；柱溫:30℃；進(jìn)樣量: 20μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

2.4 參照物肉桂醛的確定 將上述已配制好的肉桂醛、廣藿香酮和大黃素對(duì)照品混合溶液和供試品溶液按“2.3”項(xiàng)下的分離條件進(jìn)行測(cè)定,得圖1。根據(jù)單一對(duì)照品保留時(shí)間及相應(yīng)對(duì)照品紫外光譜得知圖1中1號(hào)峰為肉桂醛峰,2號(hào)峰為廣藿香酮峰,3號(hào)峰為大黃素峰。肉桂醛峰與相鄰峰分離度良好,保留時(shí)間適中,故選作參照峰(S),確定18個(gè)共有峰。計(jì)算各樣品中非共有峰占總峰面積的比值,結(jié)果表明其值均<5%。90 min樣品供試品溶液色譜圖表明,組分在65 min內(nèi)出峰完全。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取批號(hào)為120208的香桂化濁膠囊供試品溶液,按上述色譜條件分別在0,2,4, 8,12,24,48 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄各共有峰保留時(shí)間和面積,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD=0.28%～0.97%,相對(duì)峰面積的RSD 0.76%～2.33%,表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 兩種溶液的HPLC色譜圖A.對(duì)照品;B.供試品;1.肉桂醛;2.廣藿香酮;3.大黃素Fig.1 HPLC chromatogram of two kinds of solutionsA.reference;B.test;1.cinanamic aldehyde reference; 2.patchouli ketone reference;3.emodin reference

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為120208的香桂化濁膠囊供試品溶液適量,按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄各共有峰保留時(shí)間和面積,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 0.16%～0.84%,相對(duì)峰面積的RSD 0.48%～2.01%,表明本實(shí)驗(yàn)所用儀器的精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取批號(hào)為120208的香桂化濁膠囊適量,制備供試品溶液5份,按上述色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定,記錄各共有峰保留時(shí)間和面積,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果表明,各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 0.39%～0.47%,相對(duì)峰面積的RSD 0.89%～2.58%,表明本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.6 指紋圖譜的建立及分析

2.6.1 指紋圖譜的建立 取8批香桂化濁膠囊,按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)進(jìn)行測(cè)定,得到8批樣品的指紋圖譜。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”得到其疊加圖,見(jiàn)圖2。

2.6.2 共有指紋峰的標(biāo)定及計(jì)算 根據(jù)8批供試品溶液的測(cè)定結(jié)果,分析確定了香桂化濁膠囊的18個(gè)共有指紋峰,以肉桂醛為參考峰,將其相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積定為1,計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD,得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均<2%,結(jié)果見(jiàn)表2,3。

圖2 8批樣品和對(duì)照品的HPLC指紋圖譜S1～8.第1～8批樣品;R.對(duì)照品;1.肉桂醛;2.廣藿香酮; 3.大黃素Fig.2 HPLC fingerprints of 8 batches of samples and referenceS1-8.first to eighth batches of samp les;R.reference; 1.cinanam ic aldehyde;2.patchouli ketone;3.emodin

2.6.3 香桂化濁膠囊指紋圖譜相似度測(cè)定 采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)》評(píng)價(jià)8批香桂化濁膠囊的指紋圖譜,以均值法生成對(duì)照指紋圖譜,建立共有模式,測(cè)得各批次樣品與共有模式間的相似度,結(jié)果均在0.9以上,說(shuō)明工藝較穩(wěn)定,結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

筆者主要是建立香桂化濁膠囊的HPLC-PDA指紋圖譜特征,并對(duì)不同批次的香桂化濁膠囊進(jìn)行比較,為有效控制香桂化濁膠囊的質(zhì)量提供了新方法。為了得到滿意的分離效果,實(shí)驗(yàn)比較了水、甲醇、乙醇(分別為25%,50%,75%,100%)對(duì)提取率(超聲和回流)的影響。結(jié)果顯示,純甲醇的提取率最高,超聲效果優(yōu)于回流,所以確定提取方法為純甲醇超聲提取。對(duì)于流動(dòng)相的選擇,筆者嘗試了甲醇-0.1%冰醋酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸溶液以及甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn),甲醇-0.1%冰醋酸溶液的色譜峰分離度小,不符合高效液相色譜法的要求；乙腈-0.1%冰醋酸溶液和甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相的分離結(jié)果相似。故選擇甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相。關(guān)于檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇,本實(shí)驗(yàn)比較了香桂化濁膠囊在254,280和310 nm波長(zhǎng)下的圖譜。結(jié)果顯示,在280 nm的波長(zhǎng)下,色譜基線平穩(wěn),噪聲干擾最小,各色譜峰吸收度適中,出峰均勻,圖譜信息完整,因此選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

通過(guò)相似度計(jì)算,發(fā)現(xiàn)8批樣品具有相同的色譜特征峰,且各峰的保留時(shí)間穩(wěn)定,相似度較高,表明該實(shí)驗(yàn)所建立的方法穩(wěn)定性好,具有可操作性。本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,可作為香桂化濁膠囊的鑒別和質(zhì)量控制。

表2 8批香桂化濁膠囊指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of the common peaks of HPLC fingerprints of 8 batches of xianggui huazhuo capsule min

表3 8批香桂化濁膠囊指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab.3 Relative peak area of the common peaks of HPLC fingerprints of 8 batches of xiangguihuazhuo capsule

表4 8批香桂化濁膠囊指紋圖譜相似度數(shù)據(jù)Tab.4 Sim ilarity of HPLC fingerp rints of 8 batches of xianggui huazhuo capsule

［1］劉紅淼,姜少灝,張振杰,等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選香桂化濁膠囊中揮發(fā)油的包合工藝[J].中國(guó)藥房,2010,21(47):4449-4450.

［2］劉紅淼,房桂珍,李艷玲,等.香桂化濁膠囊成型工藝研究[J].中國(guó)藥房,2011,22(11):990-991.

［3］劉紅淼,楊繼章,王云志,等.香桂化濁膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房,2011,22(27):2553-2554.

［4］楊繼章,劉紅淼,李艷玲.肉桂油的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2011,22(27):2579-2581.

［5］劉紅淼,楊繼章,李艷玲.HPLC法測(cè)定香桂化濁膠囊中大黃素的含量[J].中國(guó)藥房,2012,23(15):1397-1398.

［6］劉紅淼,李艷玲,楊繼章,等.香桂化濁膠囊毒理學(xué)研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,32(2):17-21.

［7］李家春,孫蘭,李紅娟,等.桂枝茯苓膠囊HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥,2012,43(7):1333-1335.

DOI 10.3870/yydb.2014.01.025

Study on HPLC-PDA Fingerprints of Xianggui Huazhuo Capsule

ZHANG Chen-chen,YANG Ji-zhang,WU Dan,LIU Hong-miao
(Department of Pharmacy,the First Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050031,China)

Objective To establish a HPLC-PDA fingerprint analysis for theχianggui huazhuocapsule,and improve the quality control standard for it. ，MethodsHPLC separation was carried out on DiamonsilTMC18column(250 mm× 4.6mm,5μm).Themobile phase was composed ofmethanol,acetonitrile and 0.1%glacial acetic acid with gradient elution. The flow rate wasmaintained at 1.0 mL·min-1and the column temperature was set at 30℃.The detective wavelength was 280 nm.ResultsUnder the same chromatographic conditions,the similarity of eight batches ofχianggui huazhuocapsule was above0.9,and the chemical composition was consistent among different batches.ConclusionThe operation is simple and accurate,and therefore can be used for the identification and quality control ofχianggui huazhuocapsule.

Xianggui huazhuocapsule;Fingerprint;Cinanamic aldehyde;Patchouli ketone;Emodin

R284;R927.2

A

1004-0781(2014)01-0086-04

2013-01-09

2013-05-22

*河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃課題資助項(xiàng)目(2012083)

張辰辰(1987-),女,河北石家莊人,在讀碩士,研究方向:藥劑學(xué)。電話：(0)15333315270,E-mail：zhangchenchen6666@163.com。

楊繼章(1957-),男,河北邢臺(tái)人,主任藥師,教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:藥物新劑型、藥物穩(wěn)定性。電話： 0311-85917352,E-mail：yjzh1957@163.com。