黃輝，蔣宏玲，劉芬菊，白雪，何卓凱，蔡銳，張榮君，趙博，劉美蓮

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放療科，桂林 541001；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院康復(fù)科，桂林 541001；3.蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院，蘇州 215007)

·抗腫瘤藥物專欄·

三氧化二砷對人腦膠質(zhì)瘤SHG44細胞增殖的抑制作用*

黃輝1，蔣宏玲2，劉芬菊3，白雪1，何卓凱1，蔡銳1，張榮君1，趙博1，劉美蓮1

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放療科，桂林 541001；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院康復(fù)科，桂林 541001；3.蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院，蘇州 215007)

目的 探討三氧化二砷(As2O3)對人腦膠質(zhì)瘤SHG44細胞增殖的抑制作用及其作用機制。方法采用噻唑藍(MTT)法觀察As2O3對SHG44細胞的增殖抑制率;激光共聚焦顯微鏡檢測As2O3作用于SHG44細胞后細胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)水平變化。結(jié)果As2O3對SHG44細胞增殖具有明顯抑制作用,隨著As2O3濃度的升高和作用時間的延長,細胞的增殖抑制率升高,12μmol·L-1As2O3對SHG44細胞增殖的抑制率可達63.8%;As2O3可以明顯提高SHG44細胞內(nèi)ROS水平,其ROS水平隨As2O3作用濃度的增高明顯增高,具有濃度依賴關(guān)系。結(jié)論As2O3能明顯抑制SHG44細胞的增殖,抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性和時間依賴性,其機制與升高細胞內(nèi)活性氧水平有關(guān)。

三氧化二砷；膠質(zhì)瘤；SHG44細胞；抑制作用

三氧化二砷(As2O3)是砒霜的有效成分,對急性早幼粒細胞白血病的療效已得到肯定［1-2］。近年來臨床醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)中藥砷劑具有廣泛的抗癌譜,并且不良反應(yīng)少,As2O3對實體瘤,如結(jié)腸癌、肝癌等也有誘導(dǎo)凋亡和抑制生長作用［3-4］。筆者在本研究中探討了As2O3對人腦膠質(zhì)瘤SHG44細胞體外增殖的影響,同時探討其可能的作用機制,為其臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 激光共聚焦顯微鏡(TCS-SP2型, Leica Co,Germany)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；5 mg·mL-1噻唑藍(thiazolyl blue,MTT)液25 mg,加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saling,PBS, 0.01 mol·L-1,pH7.4)5 m L攪拌充分溶解后,經(jīng)孔徑0.22μm濾膜過濾除菌,-20℃保存；RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibcol):按說明用雙蒸水配制,加青霉素、鏈霉素各100 U·m L-1,碳酸氫鈉(NaHCO3)2 g,經(jīng)孔徑0.22μm濾過器除菌,小瓶分裝,-20℃儲存,臨用前加滅活新生小牛血清配成含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液；As2O3,亞砷酸氯化鈉注射液(哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司)。10 mL亞砷酸氯化鈉注射液含As2O310 mg與氯化鈉90 mg。

1.2 細胞培養(yǎng) SHG44細胞(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供)為單層貼壁生長的細胞,培養(yǎng)在含10%新生小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液、37℃、5%二氧化碳(CO2)飽和濕度孵箱中。

1.3 As2O3對SHG44細胞的增殖抑制作用 參照文獻方法［5］,取對數(shù)生長期細胞加入0.25%胰酶消化,用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,配成5×104個·mL-1細胞懸液,接種于96孔板的6×8孔中,每孔細胞懸液100μL。處理組每孔再加入含不同濃度As2O3完全培養(yǎng)液100μL,使As2O3終濃度分別為1,2,4,6,8, 10,12μmol·L-1,對照組加入等體積10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,各濃度設(shè)6個復(fù)孔,37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)3 d(根據(jù)細胞生長曲線實驗結(jié)果)。取4塊96孔板,每板2×6孔加入細胞懸液,每孔細胞0.5×104個,其中每塊板1×6孔加入As2O3,終濃度為4μmol·L-1,分別培養(yǎng)1,2,3,4 d后取出。各孔分別加入MTT 20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出培養(yǎng)液,加入二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)200μL振蕩溶解10min,空白對照調(diào)零,酶聯(lián)免疫檢測儀上測波長570 nm處吸光度(A)值。計算細胞增殖抑制率,抑制率(%)=［(陰性對照組A值-處理組A值)］/陰性對照組A值］× 100%,繪制細胞增殖抑制曲線。實驗重復(fù)3次。

1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測細胞凋亡 對數(shù)生長期SHG44細胞0.25%胰酶消化成單細胞懸液,50 mL培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)24 h后換液,處理組每瓶加入含不同濃度As2O3和10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液8 mL,使As2O3終濃度分別為2,4,6μmol·L-1,對照組加入等體積10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,每組設(shè)3個平行樣品。培養(yǎng)終止,0.25%胰酶消化成單細胞懸液,1 000 r·min-1離心5 min,棄上層液,PBS 100μL混勻細胞沉淀,加吖啶橙(acridine orange,AO))/溴化乙啶(ethidium bromide,EB)染液,使終濃度為5μg·mL-1,37℃孵育5～10 min,激光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色及形態(tài)(AO激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長500～520 nm；EB激發(fā)波長543 nm,發(fā)射波長600～700 nm)。

1.5 激光共聚焦顯微鏡測定 活性氧(reactive oxygen species,ROS)釋放:①樣品的制備:實驗分對照組,1,2,4,6μmol·L-1As2O3處理組,SHG44細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液,培養(yǎng)于直徑25 mm的培養(yǎng)皿中,貼壁2 d,各實驗組均換成不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,其中處理組分別加入As2O3使終濃度為1,2,4,6μmol·L-1,繼續(xù)培養(yǎng)2 h。②染色:各組分別2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA,終濃度為10μmol·L-1)標(biāo)記細胞,37℃保溫30 min。③激光共聚焦顯微鏡掃描:將培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。檢測選用的激發(fā)光波長為488 nm,發(fā)射光波長為520 nm,用40倍物鏡進行觀察,利用含有圖像處理系統(tǒng)和自動攝像裝置選取不同視野拍攝圖像,所有掃描圖像存入計算機硬盤內(nèi)以便分析備用。④激光共聚焦顯微鏡掃描數(shù)據(jù)處理:利用Leica自帶的軟件對存入計算機的圖片進行熒光強度分析,使用ROI (Region of Interest)功能對細胞發(fā)射的熒光單獨獲得數(shù)值,扣除細胞周邊的本底熒光數(shù)值,每個劑量點選取3個不同視野進行分析,將不同視野的值匯總以進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 As2O3對SHG44細胞的增殖抑制作用 各濃度組As2O3對SHG44細胞均有明顯增殖抑制作用,抑制率隨濃度升高而明顯增加,呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系,并發(fā)現(xiàn)As2O3濃度為1μmol·L-1時,對SHG44細胞抑制作用已十分明顯。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明,細胞增殖抑制率(Y)與As2O3濃度(X)呈線性相關(guān),回歸方程為:Y= 0.056 57X-0.015 3。從回歸方程求得本實驗條件下, As2O3的半數(shù)抑制濃度為9μmol·L-1。見表1。

單因素方差分析:1和2μmol·L-1As2O3組A值比較,P<0.05,其余各組之間A值比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)

應(yīng)用SPSS13.0版統(tǒng)計軟件包以As2O3濃度為自變量(X),增殖抑制率為因變量(Y),進行曲線估計,得出直線方程模型擬合的決定系數(shù)為0.989 3,輸出的圖形與實際數(shù)據(jù)的趨勢吻合。隨后進行線性回歸分析,系統(tǒng)輸出的模型方差分析結(jié)果顯示模型的P<0. 01,說明回歸方程有效,系統(tǒng)輸出回歸系數(shù)為0.056 57,P<0.01,說明方程中As2O3濃度變量差異有統(tǒng)計學(xué)意義?；貧w方程為:Y=5.657×10-2X-1.530×10-2。

從前面實驗得出4μmol·L-1As2O3作用于SHG44細胞后,具有明顯的增殖抑制作用(P<0.01),故選用此濃度觀察As2O3對SHG44細胞的增殖抑制作用的時間依賴關(guān)系。結(jié)果4μmol·L-1As2O3第1～4天對SHG44細胞的增殖抑制率分別為(5±2)%,(13±2)%,(20± 3)%,(21±4)%。在第1～3天隨作用時間的延長,細胞的抑制率逐漸升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。第4天和第3天抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,是因為本實驗條件下,細胞培養(yǎng)于96孔板中,第3天細胞已貼滿板底,生長處于停滯期。實驗表明,As2O3對SHG44細胞的增殖抑制作用具有時間依賴關(guān)系。

表1 不同濃度As2O3作用后各組MTT吸光度(A)值和SHG44細胞增殖抑制率Tab.1 Absorbance values(A)of MTT and inhibition rate on SHG44 cell proliferation after treatment with different concentrations of As2O3 ±s

表1 不同濃度As2O3作用后各組MTT吸光度(A)值和SHG44細胞增殖抑制率Tab.1 Absorbance values(A)of MTT and inhibition rate on SHG44 cell proliferation after treatment with different concentrations of As2O3 ±s

As2O3濃度/ (μmol·L-1)A值抑制率/ % 0 1.05±0.03 0.0 1 0.99±0.02 5.7 2 0.97±0.02 7.6 4 0.85±0.05 19.0 6 0.71±0.04 32.4 8 0.55±0.02 47.6 10 0.44±0.01 58.1 12 0.38±0.02 63.8

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察As2O3誘導(dǎo)的細胞凋亡 對照組,2,4,6μmol·L-1As2O3實驗組細胞AO/EB染色后激光共聚焦顯微鏡觀察,出現(xiàn):①對照組大部分為活細胞,核染色質(zhì)著綠色,核呈正常結(jié)構(gòu)(圖1-A)；②早期凋亡細胞,核染色質(zhì)著綠色,胞核呈固縮狀或碎裂狀(圖1-B)；③中期凋亡細胞,核染色質(zhì)著黃綠色,胞核呈固縮狀或碎裂狀(圖1-C)；④晚期凋亡細胞,核染色質(zhì)著橘紅色,胞核呈固縮狀或碎裂狀(圖1-D)；⑤壞死細胞,核染色質(zhì)著橘紅色,胞核結(jié)構(gòu)正常(圖1-D)。

2.3 As2O3提高SHG44細胞內(nèi)ROS水平 細胞內(nèi)ROS測定參照方法［6］進行,DCFH-DA自由擴散進入細胞后被酯酶催化變成DCFH,在ROS存在下被氧化成DCF, DCF熒光強度與細胞內(nèi)ROS水平呈正比。細胞經(jīng)0,1, 2,4,6μmol·L-1As2O3處理后,SHG44細胞內(nèi)熒光強度值分別為51.41±4.83,85.06±9.86,149.98±10.03, 188.33±10.65,244.47±6.46。細胞內(nèi)熒光強度反映細胞內(nèi)ROS水平?？梢钥闯?細胞內(nèi)的ROS水平與As2O3在0～6μmol·L-1的濃度內(nèi)有明確的濃度依賴關(guān)系, ROS的含量隨As2O3作用濃度的增高明顯增高,對照組和各作用組及各作用組間比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2:細胞內(nèi)熒光強度隨As2O3作用濃度的增高明顯增強)。

3 討論

As2O3是中藥砒霜的主要成分,砷與蛋白質(zhì)氨基酸中的巰基具有強效的親和性,可直接影響細胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)的功能。As2O3注射液已成功用于治療急性早幼粒細胞白血?。?］。近年來,研究表明,As2O3對多種實體瘤也有抑制作用,其機制為誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡［8］。國內(nèi)外的流行病學(xué)調(diào)查和實驗研究均表明,As2O3對胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、白血病等多種腫瘤也均有明顯抑制作用［9-14］。也有研究表明As2O3對人宮頸癌Hela細胞、口腔鱗狀細胞癌等有明顯的放射增敏作用［15-17］。本實驗研究As2O3對人腦膠質(zhì)瘤SHG44細胞的增殖抑制作用,結(jié)果表明,As2O3能抑制SHG44細胞的生長,并呈劑量依賴性和時間依賴性,即隨As2O3作用濃度的增加、As2O3作用時間的延長,其抑制作用越明顯,其半數(shù)抑制濃度為9μmol·L-1?？梢詮腁s2O3對SHG44細胞的增殖抑制作用看出,當(dāng)As2O3濃度為1μmol·L-1時,對SHG44細胞已有抑制增殖作用(P<0.01),在1～4μmol·L-1濃度時,抑制作用呈遞增關(guān)系,這個濃度是臨床治療劑量的砷濃度。

圖1 4組細胞激光共聚焦顯微鏡掃描凋亡圖(×40)A.對照組;B.2μmol·L-1As2O3組;C.4μmol·L-1As2O3組;D.6μmol·L-1As2O3組Fig.1 Apoptosis images by laser scanning confocalm icroscope of 4 groups of cells(×40)A.control group;B.2μmol·L-1As2O3group;C.4μmol·L-1As2O3group;D.6μmol·L-1As2O3group

圖2 5組細胞內(nèi)熒光強度圖(×40)A.對照組;B.1μmol·L-1As2O3組;C.2μmol·L-1As2O3組;D.4μmol·L-1As2O3組;E.6μmol·L-1As2O3組Fig.2 Intracellular fluorescence intensity images of five groups of cells(×40)A.control group;B.1μmol·L-1As2O3group;C.2μmol·L-1As2O3group;D.4μmol·L-1As2O3group;E.6μmol·L-1As2O3group

有關(guān)As2O3對細胞殺傷機制的基礎(chǔ)研究報道甚多,筆者從ROS的氧化損傷角度來研究其細胞殺傷機制。As2O3在0～6μmol·L-1的濃度作用于SHG44細胞,激光共聚焦顯微鏡測定細胞內(nèi)的熒光強度,熒光強度與細胞內(nèi)ROS水平成正比,間接反映細胞內(nèi)的ROS水平,當(dāng)加入As2O3后,SHG44細胞內(nèi)熒光強度值明顯升高,ROS的含量隨As2O3作用濃度的加大明顯提高,具有一定的濃度依賴關(guān)系。As2O3是一種原漿毒物質(zhì),與巰基(-SH)有高度親和力?？梢耘c細胞內(nèi)含巰基的抗氧化劑和抗氧化酶結(jié)合,細胞清除和拮抗氧化能力降低,打破細胞內(nèi)抗氧化的動態(tài)平衡,致使細胞內(nèi)ROS增多。過高的ROS對細胞生長不利,可以導(dǎo)致包括脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷等有害變化。DNA是生命信息的載體,是細胞中最重要的生物大分子之一。細胞DNA分子中的堿基、核糖和磷酸二酯鍵都可能遭受自由基的攻擊,造成堿基與核糖氧化、鏈斷裂與蛋白質(zhì)交聯(lián)等多種類型的損傷。

綜上所述,As2O3在體外具有抗膠質(zhì)瘤細胞增殖作用。這為臨床應(yīng)用As2O3治療膠質(zhì)瘤提供較可靠的實驗依據(jù)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.010

Inhibition Effects of Arsenic Trioxide on SHG44 Human Glioma Cells

HUANG Hui1,JIANG Hong-ling2,LIU Fen-ju3,BAI Xue1,HE Zhuo-kai1,CAI Rui1,ZHANG Rong-jun1, ZHAO Bo1,LIU Mei-lian1
(1.Department of Radiation Oncology,Affiliated Hospital to Guilin Medical College, Guilin 541001,China;2.Department of Rehabilitation,Affiliated Hospital to Guilin Medical College,Guilin 541001,China;3.School of Radiation Medicine and Public Health,Suzhou University,Suzhou 215007, China)

Objective To investigate the anti-proliferation effects of arsenic trioxide(As2O3)on human glioma cells-44 (SHG44)in vitro and itsmechanism.MethodsThe inhibitory ratio of the cells by As2O3wasmeasured by MTT assay.The intracellular ROSwere determined by a probe(DCFH-DA)under a laser scanning confocalmicroscopy.ResultsAs2O3significantly inhibited SHG44 cells proliferation.The proliferation inhibition rate was dose-dependent and time-dependent.The proliferation inhibition by 12μmol·L-1As2O3on SHG44 cells was as high as 63.8%.After treatment with As2O3,the intracellular ROS was increased markedly in a concentration-dependent manner.ConclusionAs2O3can inhibit the proliferation of SHG44 cells in both dose-dependent and time-dependentmanners.The inhibition was associated with elevation of intracellular ROS.

Arsenic trioxide;Glioma;SHG44 cells;Inhibition effects

R979.1;R969

A

1004-0781(2014)01-0034-05

2013-04-01

2013-07-11

*廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題基金資助項目(Z2011185)

黃輝(1974-),男,湖南安化人,副主任醫(yī)師,碩士,研究方向:腫瘤放射治療和綜合治療。電話：(0) 15878398556,E-mail：huanghui25002@163.com。

蔣宏玲(1978-),女,湖南衡陽人,主管護師,學(xué)士,從事腫瘤康復(fù)工作。電話：(0)13977312871,E-mail：1037039186@qq.com。