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        緩激肽對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細胞遷移的影響*

        2014-05-13 09:55:28馮文靜趙剛徐西振趙俊杰董若蘭凃玲姚濟華
        醫(yī)藥導(dǎo)報 2014年1期
        關(guān)鍵詞:緩激肽跨膜劃痕

        馮文靜,趙剛,徐西振,趙俊杰,董若蘭,凃玲,姚濟華

        (1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,武漢 430030;2.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院心血管內(nèi)科,濟南 250021;3.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢 430030)

        緩激肽對轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細胞遷移的影響*

        馮文靜1,趙剛2,徐西振3,趙俊杰1,董若蘭1,凃玲1,姚濟華1

        (1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,武漢 430030;2.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院心血管內(nèi)科,濟南 250021;3.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢 430030)

        目的 觀察緩激肽對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)遷移的影響及其可能機制。方法原代培養(yǎng)PASMCs,應(yīng)用Transwell小室檢測緩激肽對PASMCs跨膜遷移能力的影響,同時應(yīng)用劃痕修復(fù)實驗檢測緩激肽對PASMCs橫向遷移能力的影響。結(jié)果TGF-β1顯著增加了跨膜遷移的PASMCs數(shù)目(P<0.05),緩激肽顯著減少了PASMCs的跨膜遷移(P<0.05),而B2受體抑制劑(HOE-140)對緩激肽抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的跨膜遷移作用無顯著改變(P>0.05)。緩激肽顯著降低PASMCs的劃痕愈合指數(shù)(P<0.05),而HOE-140對緩激肽抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的橫向遷移能力無顯著改變(P>0.05)。結(jié)論緩激肽可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs跨膜和橫向遷移能力,而這一效應(yīng)可能不通過緩激肽B2受體介導(dǎo)。

        緩激肽;肺動脈平滑肌細胞;轉(zhuǎn)化生長因子-β1;遷移

        肺動脈高壓是一類嚴重的進展性疾病,其主要特征是肺血管阻力進行性升高,持續(xù)發(fā)展可導(dǎo)致患者右心衰竭而死亡[1]。肺血管重構(gòu)是肺血管阻力進行性升高的重要病理生理基礎(chǔ),肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)由中層至內(nèi)膜層的遷移,導(dǎo)致了肺動脈中膜增厚和非肌性血管肌化,最終導(dǎo)致血管硬化和阻塞,從而使肺動脈壓力持續(xù)升高[2]。研究表明,多種肺動脈高壓動物模型均存在PASMCs中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表達增加并刺激PASMCs遷移,促進肺血管重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展[3]。

        緩激肽(bradykinin,BK)是一種血管活性九肽,通過自分泌-旁分泌機制釋放,與受體結(jié)合后發(fā)揮擴張血管、降低血壓、增加局部血流、調(diào)節(jié)平滑肌松弛和收縮、增加血管通透性等多種生物學(xué)效應(yīng)[4]。研究表明,激肽釋放酶可以通過增加緩激肽水平從而抑制血小板源性生長因子誘導(dǎo)的大鼠主動脈平滑肌細胞遷移[5],然而,BK是否能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs遷移及其可能的分子機制尚不清楚。因此,筆者研究肺血管重構(gòu)的病理生理機制,旨在探討B(tài)K對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs遷移的影響,為臨床肺血管重構(gòu)的治療提供新的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試劑 豬肺動脈購自武漢市血清制品廠,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、達爾伯克必需基本培養(yǎng)液(Dulbecco′s minimum essentialmedium,DMEM)、胰酶均購自Hyclone公司。10%DMEM為含有10%胎牛血清、0.146 g·L-1L-谷氨酰胺、1×105U·L-1青霉素和1×105U·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。BK、TGF-β1、緩激肽B2受體抑制劑HOE-140購自美國Sigma公司。牛血清清蛋白購自碧云天生物技術(shù)研究所。Transwell小室購自美國Corning公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

        1.2 方法

        1.2.1 原代培養(yǎng)PASMCs 無菌操作下取豬肺動脈,分離肺組織中的3~4級肺小動脈,鈍性分離法剝除肺動脈外膜后,立即用大量含有雙抗的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)沖洗??v向剪開肺動脈,刮除肺動脈內(nèi)皮細胞,并用PBS清洗掉殘留的肺動脈內(nèi)皮細胞。將肺動脈中膜組織在含有少量10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中剪成1 mm3大小的組織塊后轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)瓶中,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4~6 h。組織塊貼壁后補充適量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液并輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,正置培養(yǎng)5~7 d,可見少量細胞從組織塊邊緣爬出。每2~3 d更換培養(yǎng)液,換液時去除漂浮的組織塊。用0.02%乙二胺四乙酸-0.25%胰蛋白酶消化傳代,實驗采用第2~6代細胞。

        1.2.2 PASMCs鑒定 分別采用倒置相差顯微鏡下觀察和免疫熒光染色檢測抗α-平滑肌肌動蛋白(αsmoothmuscle actin,α-SMA)的方法[6]對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定,從而明確是否為PASMCs。細胞純度在95%以上用于實驗。

        1.2.3 實驗分組 培養(yǎng)板中的細胞隨機分為6組:對照組、溶媒組、TGF-β1組、TGF-β1+HOE-140組、TGF-β1+BK組及TGF-β1+BK+HOE-140組,干預(yù)前換0.4%FBS的DMEM培養(yǎng)液同步化處理12 h。為研究可能機制,給予BK前1 h加用緩激肽B2受體抑制劑HOE-140(10-5mol·L-1)、BK干預(yù)作用30min后,加入TGF-β1(10 ng·mL-1)。每次實驗至少重復(fù)3次。

        1.2.4 Transwell小室檢測PASMCs的跨膜遷移能力細胞跨膜遷移能力按文獻所述的方法進行[7]。常規(guī)胰酶消化收集PASMCs,1 000 r·min-1離心(德國賀利氏Fresco臺式高速離心機)10 min,用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸PASMCs,使細胞密度達到5×105·mL-1,每個Transwell小室均勻滴加細胞懸液200μL(1×105個),下室加入無血清DMEM培養(yǎng)液600μL。按照上述實驗分組和干預(yù)時間點將BK、HOE-140加入Transwell上室,TGF-β1作為誘導(dǎo)遷移的細胞趨化因子加入Transwell下室誘導(dǎo)PASMCs遷移。將24孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h。干預(yù)結(jié)束后用棉簽輕輕擦去上室內(nèi)的細胞,并用4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫室溫下染色10 min,純化水漂洗干凈,顯微鏡下隨機選取5個高倍視野(×200)計數(shù)每個Transwell小室遷移的細胞數(shù)目并攝相。

        1.2.5 劃痕修復(fù)實驗檢測PASMCs的橫向遷移能力 細胞劃痕修復(fù)實驗按文獻所述的方法進行[8]。將PASMCs接種于6孔板,加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),待細胞長至完全融合時,用無菌的200μL槍頭在6孔板的底面上沿直線輕輕進行劃痕,用PBS洗3次將懸浮的細胞洗掉,加入無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)并按分組加入相應(yīng)的藥物干預(yù),分別在0,24 h于倒置顯微鏡下(×100)觀察細胞遷移情況,隨機選擇劃痕區(qū)5個視野攝相,測量不同時間點的劃痕寬度,比較各組間劃痕愈合的差異并計算劃痕愈合指數(shù)。劃痕愈合指數(shù)=(初始劃痕寬度-愈合后劃痕寬度)/初始劃痕寬度。

        2 結(jié)果

        2.1 PASMCs形態(tài)及鑒定 肺動脈中膜組織塊移植于培養(yǎng)瓶后,培養(yǎng)5~7 d可見少量細胞從組織塊邊緣爬出,細胞呈不規(guī)則多角形,并逐漸伸展成梭形或長梭形。部分區(qū)域可見PASMCs融合呈梭形重疊生長,呈現(xiàn)典型的“谷與峰”樣特征。免疫熒光染色結(jié)果見圖1所示,95%以上細胞抗α-SMA陽性,細胞質(zhì)顯示呈綠色熒光標記的肌動蛋白結(jié)構(gòu),細胞核呈橢圓形位于細胞中央被染成藍色。

        2.2 BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs跨膜遷移能力的影響 按上述實驗分組和干預(yù)方法,應(yīng)用Tanswell檢測BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs跨膜遷移能力的影響。如圖2,3所示,與對照組和溶媒組比較,TGF-β1組PASMCs跨膜遷移的細胞數(shù)目顯著增加(P<0.05)。與TGF-β1組比較,TGF-β1+BK組顯著減少了TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs跨膜遷移的細胞數(shù)目(P<0.05)。而合用緩激肽B2受體抑制劑HOE-140后,BK抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的遷移作用無顯著改變。說明BK可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的跨膜遷移能力,而這一效應(yīng)可能不通過緩激肽B2受體介導(dǎo)。

        圖1 PASMCs免疫熒光染色(×200)A.細胞核;B.細胞質(zhì)α-SMA染色陽性;C.PASMCs組合圖Fig.1 Immunofluorescent staining on PASMCs(×200)A.nucleus;B.positiveα-SMA expression in cytoplasm by staining;C.merged PASMCs

        圖2 6組細胞遷移圖(×200)A.對照組;B.溶媒組;C.TGF-β1組;D.TGF-β1+HOE-140組;E.TGF-β1+BK組;F.TGF-β1+BK+HOE-140組Fig.2 Transition diagram of six groups of cells(×200)A.control group;B.vehicle group;C.TGF-β1group;D.TGF-β1plus HOE-140 group;E.TGF-β1plus BK group;F.TGF-β1,BK plus HOE-140 group

        圖3 6組細胞每視野下的平均細胞數(shù)目直方圖A.對照組;B.溶媒組;C.TGF-β1組;D.TGF-β1+HOE-140組;E.TGF-β1+BK組;F.TGF-β1+BK+HOE-140組;與對照組和溶媒組比較,*1P<0.05;與TGF-β1組比較,*2P<0.05Fig.3 Histogram of average cell number under per visual field in six groups of cellsA.control group;B.vehicle group;C.TGF-β1group;D.TGF-β1plus HOE-140 group;E.TGF-β1plus BK group;F.TGF-β1,BK plus HOE-140 group;compared with the control group and vehicle group,*1P<0.05;compared with TGF-β1group,*2P<0.05

        2.3 BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs橫向遷移能力的影響 按上述實驗分組和干預(yù)方法,應(yīng)用劃痕修復(fù)實驗檢測BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs橫向遷移能力的影響。如圖4,5所示,單層細胞劃痕實驗24 h后,與對照組和溶媒相比較,TGF-β1組PASMCs劃痕愈合指數(shù)顯著增加(P<0.05)。與TGF-β1組比較,TGF-β1+ BK組PASMCs劃痕愈合指數(shù)顯著降低(P<0.05)。而合用緩激肽B2受體抑制劑HOE-140后,BK抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的橫向遷移作用無顯著改變。說明BK可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的橫向遷移能力,而這一效應(yīng)可能不通過緩激肽B2受體介導(dǎo)。

        3 討論

        肺血管重構(gòu)主要包括肺動脈內(nèi)膜損害、中膜肥厚和外膜增厚,肺血管內(nèi)皮細胞凋亡參與肺動脈高壓發(fā)病的重要起始環(huán)節(jié)[9]。SAKAO等[10]研究發(fā)現(xiàn),凋亡的肺血管內(nèi)皮細胞可以分泌一系列細胞因子(血管內(nèi)皮生長因子、TGF-β1等)作用于PASMCs,促進肺血管重構(gòu)。STURROCK等[11]研究發(fā)現(xiàn),肺動脈高壓發(fā)病過程中TGF-β1表達顯著增加。多種肺動脈高壓動物模型均存在PASMCs中TGF-β1表達增加并刺激PASMCs遷移,促進肺血管重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展[3]。PASMCs由中層至內(nèi)膜層的遷移,導(dǎo)致肺動脈中膜增厚和非肌性血管肌化,最終導(dǎo)致血管硬化和阻塞[2]。本實驗應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的豬PASMCs遷移,結(jié)果顯示: TGF-β1可以顯著誘導(dǎo)PASMCs遷移,這與文獻[3]報道一致,說明TGF-β1誘導(dǎo)PASMCs遷移模型制作成功,可以用于研究BK對TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的遷移作用。

        本實驗中,Tanswell結(jié)果顯示,TGF-β1顯著增加了跨膜遷移的PASMCs數(shù)目,BK顯著減少了TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的跨膜遷移,而HOE-140對BK抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的跨膜遷移作用無顯著改變。劃痕修復(fù)實驗也顯示,BK顯著降低了TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的劃痕愈合指數(shù),而HOE-140對BK抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的橫向遷移能力無顯著改變。說明BK可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs跨膜和橫向遷移能力,而這一效應(yīng)可能不通過緩激肽B2受體介導(dǎo)。

        圖4 6組細胞劃痕修復(fù)圖(×100)A.對照組;B.溶媒組;C.TGF-β1組;D.TGF-β1+HOE-140組;E.TGF-β1+BK組;F.TGF-β1+BK+HOE-140組Fig.4 Scratch-restoration of six groups of cells(×100)A.control group;B.vehicle group;C.TGF-β1group;D.TGF-β1plus HOE-140 group;E.TGF-β1plus BK group;F.TGF-β1,BK plus HOE-140 group

        圖5 6組細胞愈合指數(shù)直方圖A.對照組;B.溶媒組;C.TGF-β1組;D.TGF-β1+HOE-140組;E.TGF-β1+BK組;F.TGF-β1+BK+HOE-140組;與對照組和溶媒組比較,*1P<0.05;與TGF-β1組比較,*2P<0.05Fig.5 Healing index histogram of six groups of cellsA.control group;B.vehicle group;C.TGF-β1group;D.TGF-β1plus HOE-140 group;E.TGF-β1plus BK group;F.TGF-β1,BK plus HOE-140 group;compared with the control group and vehicle group,*1P<0.05;compared with TGF-β1group,*2P<0.05

        BK是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system,KKS)中的重要活性物質(zhì),主要通過自分泌-旁分泌機制釋放,與受體結(jié)合后發(fā)揮擴張血管、降低血壓、增加局部血流、調(diào)節(jié)平滑肌松弛和收縮、增加血管通透性,改善腎功能等多種生物學(xué)效應(yīng)[4]。B2受體是一種跨膜G-蛋白耦聯(lián)受體,廣泛表達于大多數(shù)組織。已有研究報道,重組腺病毒介導(dǎo)的人組織激肽釋放酶基因轉(zhuǎn)染可明顯抑制血小板源性生長因子誘導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細胞遷移[5]。本研究發(fā)現(xiàn), BK抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的遷移作用,而HOE-140對BK抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的遷移作用不產(chǎn)生影響,因此推測BK抑制PASMCs的遷移作用不通過緩激肽B2受體介導(dǎo)。

        綜上所述,BK可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的PASMCs的遷移作用,這一效應(yīng)不通過緩激肽B2R介導(dǎo)。這可能為肺血管重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展提供了新的理論依據(jù),為預(yù)防和治療肺血管重構(gòu)提供了新的思路,但還有待于進一步對其具體機制進行研究。

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        DOI 10.3870/yydb.2014.01.003

        Effects of Bradykinin on Migration of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells Induced by TGF-β1

        FENGWen-jing1,ZHAO Gang2,XU Xi-zhen3,ZHAO Jun-jie1,DONG Ruo-lan1,TU Ling1,YAO Ji-hua1
        (1.Department of Geriatrics,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;2.Department of Cardiology,Shandong Provincial Hospital,Shandong University,Jinan 250021,China;3.Department of Cardiology,Tongji Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

        Objective To study the effects of bradykinin(BK)on pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs) migration induced by transforming growth factor-β1(TGF-β1)and their possible mechanisms.MethodsThe transmembrane migration of BK on primary PASMCs with TGF-β1treatmentwas exam ined by transwell assay,and the lateralm igration of BK on primary PASMCs with TGF-β1was determined by healing of surface scratch assay.ResultsTGF-β1significantly increased the number of PASMCs migrating across the membrane(P<0.05).BK significantly reduced TGF-β1-induced PASMCs transmembranemigration(P<0.05),which was not prevented by the B2 receptor(B2R)inhibitor HOE-140(P>0.05). Furthermore,BK significantly reduced TGF-β1-induced PASMCs lateralmigration(P<0.05),while the effectwas not blocked by the B2R inhibitor HOE-140(P>0.05).ConclusionBK can significantly inhibit TGF-β1-induced PASMCs transmembrane and lateralmigration.However the inhibitory effects ofmigrationmay notbemediated by bradykinin B2 receptor.

        Bradykinin;Pulmonary artery smoothmuscle cell;Transforming growth factor-β1;Migration

        R972;R965

        A

        1004-0781(2014)01-0008-05

        2013-04-10

        2013-06-27

        *國家自然科學(xué)基金資助項目(30971247, 81170111)

        馮文靜(1986-),女,山東日照人,博士,從事肺動脈高壓的發(fā)病機制及藥物對其保護作用研究。電話:027-83662533,E-mail:wenjing.8687@163.com。

        姚濟華(1965-),男,湖北武漢人,副教授,學(xué)士,研究方向:肺動脈高壓發(fā)病機制與治療。電話:027-83662606,E-mail:jhyaott@hotmail.com。

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