吳艷霞，李秀娟，馬威

(武漢市第一醫(yī)院 1．老年病科；2．中心實(shí)驗(yàn)室，武漢 430022)

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)處理對(duì)大腦中動(dòng)脈梗死大鼠腦組織ET-1和AQP4及AQP9表達(dá)的影響*

吳艷霞1，李秀娟1，馬威2

(武漢市第一醫(yī)院 1．老年病科；2．中心實(shí)驗(yàn)室，武漢 430022)

目的通過(guò)檢測(cè)大腦中動(dòng)脈梗死(MCAO)大鼠腦組織的內(nèi)皮素(ET)-1、水通道蛋白4(AQP4)及水通道蛋白9(AQP9)含量的變化來(lái)研究鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能生物學(xué)基礎(chǔ)。方法MCAO術(shù)前給予大、小劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯(3.0,1.5 g·mL-1)灌胃14 d,采用線栓法制備MCAO。評(píng)價(jià)鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)處理對(duì)MCAO大鼠腦缺血后行為障礙及腦水腫程度的影響;應(yīng)用免疫組化方法研究鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)處理對(duì)MCAO大鼠腦組織ET-1的影響;采用western blot技術(shù)分析MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4與AQP9表達(dá)量的變化和鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)處理對(duì)其的影響。結(jié)果預(yù)先使用鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯14 d,可明顯改善MCAO大鼠行為學(xué)障礙,減輕腦水腫程度;MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織中ET-1蛋白表達(dá)量均有不同程度下降;明顯增加MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4與AQP9蛋白表達(dá)量。結(jié)論鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)處理可抑制ET-1表達(dá),增加AQP4與AQP9表達(dá),減輕腦水腫程度。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯；梗死,中動(dòng)脈,大腦；內(nèi)皮素-1；水通道蛋白

傳統(tǒng)中藥在過(guò)去的幾千年中積累豐富的治療腦卒中的臨床經(jīng)驗(yàn)［1］。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯是治療中風(fēng)的常用方劑,臨床上也常用于高血壓病屬肝腎陰虧、肝陽(yáng)上亢者,在治療原發(fā)性高血壓及缺血性腦卒中方面有著確切的療效。筆者對(duì)鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的前期研究結(jié)果顯示,該方具有減輕原發(fā)性高血壓大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的作用［2］。既往研究顯示鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)先使用具有良好的對(duì)抗缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用［3］。由此,筆者推測(cè)應(yīng)用鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)缺血性腦卒中個(gè)體進(jìn)行早期干預(yù),可能會(huì)有著較好的治療效果。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一種細(xì)胞快速調(diào)節(jié)自身體積和內(nèi)部滲透壓的水分子通道,其在腦水腫病理生理學(xué)機(jī)制中起到重要的作用。在腦內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的AQPs中,AQP4與AQP9是腦內(nèi)表達(dá)量最多、與缺血性腦損傷發(fā)生后腦組織含水量增加密切相關(guān)的水通道蛋白［4-5］。內(nèi)皮素(endothelin,ET)是一類生物活性多肽,主要分布于心血管、腦、肝等組織器官的內(nèi)皮細(xì)胞中,具有強(qiáng)大的縮血管作用［6］。研究表明ET-1過(guò)量表達(dá)是導(dǎo)致缺血性腦損傷后AQP4與AQP9表達(dá)、腦組織含水量增加的重要因素［7］,故本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)處理干預(yù)大腦中動(dòng)脈梗死(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠后,對(duì)腦組織ET-1表達(dá)的影響,同時(shí)觀察MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4與AQP9表達(dá)量的變化和不同劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)其的影響,以探討鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯減輕局部腦水腫、改善神經(jīng)功能的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)Wistar大鼠96只,體質(zhì)量260～300 g,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2011-0002,雌雄不限,由華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。ET-1免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(SABC,武漢博士德生物工程有限公司),兔抗大鼠AQP4多克隆抗體(Chemico, US),兔抗大鼠AQP9多克隆抗體(Chemico,US),兔抗大鼠β-actin多克隆抗體(Santa Cruz,US),蛋白雜交膜(Schleicher and Schuell)。

1.2 方法

1.2.1 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯制備 處方:懷牛膝、代赭石各30 g,生龍骨、生牡礪、生龜甲、生杭芍、玄參、天冬各15 g,川楝子、生麥芽、茵陳各6 g,甘草4.5 g。藥物由湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥系提供,代赭石、生龍骨、生牡礪、生龜板先煎2 h,然后和其余藥物用8倍純化水常規(guī)煎煮3次,過(guò)濾,濃縮至生藥1.5和3.0 g·mL-1,4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物分組與模型建立 模型制作參照Pantoni的線栓法制備大腦MCAO大鼠模型［8］。線栓法制備大腦中動(dòng)脈梗塞的栓塞時(shí)間為1 h。假手術(shù)組除僅分離頸內(nèi)外動(dòng)脈,不閉塞大腦中動(dòng)脈,其余手術(shù)步驟同模型組。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組,低劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組,高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組,每組24只。其中低、高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組大鼠于MCAO術(shù)前14 d灌胃給予相當(dāng)于生藥1.5,3.0 g.mL-1鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯,假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃給予純化水,每100 g體質(zhì)量給予1 mL,bid,共14 d。

1.2.3 行為學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在術(shù)后6 h被隨機(jī)分為4組,每組8只,參照SLAVIANKA等［9］方法進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):①提鼠尾觀察前肢屈曲情況,如雙側(cè)前肢對(duì)稱伸向地面,計(jì)為0分；如手術(shù)的對(duì)側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈、肘屈曲、肩內(nèi)旋或既有腕肘屈曲又有肩內(nèi)旋者,分別計(jì)為1,2,3,4分。②將動(dòng)物置于平地面上,分別推雙肩向?qū)?cè)移動(dòng),檢查阻力,如雙側(cè)阻力對(duì)等且有力,計(jì)為0分；如向手術(shù)的對(duì)側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降者,根據(jù)下降程度的不同分為輕、中、重三度,分別計(jì)為1,2, 3分。③將動(dòng)物雙前肢置于一金屬網(wǎng)上觀察雙前肢的肌張力,雙前肢肌張力對(duì)等且有力者計(jì)為0分；同樣根據(jù)手術(shù)對(duì)側(cè)肌張力下降程度不同計(jì)為1,2,3分；④動(dòng)物有不停向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者,計(jì)為1分。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分,滿分為11分,分?jǐn)?shù)越高,動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。

1.2.4 稱質(zhì)量法檢測(cè)腦組織含水量 各組取8只大鼠斷頭取腦,左右分開(kāi),分別稱定左右腦濕質(zhì)量。105℃烘烤48 h至恒重,精確稱定干質(zhì)量,計(jì)算含水量［9］。含水量(%)＝(濕重-干重/濕重)×100%。

1.2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ET-1分布及表達(dá) 收集各組8只大鼠缺血腦組織,切除部分端腦組織,置4%多聚甲醛固定、脫水、包埋后進(jìn)行切片,采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(streptavidin-biotincomplex,SABC)法,以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。ET-1蛋白檢測(cè)一抗(兔抗大鼠ET-1),二抗(生物素標(biāo)記山羊抗兔lgG)。染色步驟按照免疫組化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。結(jié)果判定:陽(yáng)性反應(yīng)為深棕色顆粒,計(jì)算ET-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。陰性對(duì)照,染色時(shí)不加入一抗,結(jié)果為陰性。

1.2.6 Western blot檢測(cè)AQP4與AQP9蛋白表達(dá)量 取缺血側(cè)腦組織100 mg,用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次后加入適量細(xì)胞裂解液勻漿,吹勻于4℃放置30 min,12 000 r·min-1離心20min,留取上清液,取少量上清液采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)濃度,將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度,-70℃保存。12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)膜后以電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)發(fā)光試劑盒檢測(cè)AQP4和AQP9蛋白的表達(dá)。兔抗大鼠AQP4多克隆抗體、兔抗大鼠AQP9多克隆抗體(1∶400),兔抗大鼠β-actin多克隆抗體(1∶750)作為內(nèi)參。4℃搖勻過(guò)夜,加入辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔-IgG二抗(1∶1 000),室溫輕搖1 h。HRP-ECL發(fā)光法顯色。結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白條帶相對(duì)吸光度值(即目的片段吸光度值/內(nèi)參照吸光度值),使用BandScan5.0版軟件測(cè)定,每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)檢測(cè) 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組和低、高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組大鼠行為學(xué)積分均顯著增加(P<0.01)；但與模型組比較,不同劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯均可有效改善大鼠行為學(xué)積分(P< 0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 腦組織含水量檢測(cè) 腦組織含水量檢測(cè)結(jié)果顯示,模型組大鼠缺血側(cè)腦組織含水量較假手術(shù)組大鼠有非常顯著的增加(P<0.01)；不同劑量的鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)先使用均可明顯改善MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織含水量(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)缺血腦組織ET-1蛋白表達(dá)的影響 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠缺血側(cè)腦組織中ET-1含量顯著升高(P< 0.01)；高、低劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織中ET-1含量下降,且與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1,圖1。

2.4 缺血側(cè)腦組織AQP4與AQP9蛋白表達(dá)量檢測(cè) Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,模型組大鼠缺血側(cè)腦組織AQP9蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組大鼠有非常顯著的增加(P<0.01),但AQP4蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組大鼠增加無(wú)顯著；低、高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)先使用可明顯增加MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4與AQP9蛋白表達(dá)量(P<0.05),以高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯作用更為顯著。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4與AQP9蛋白表達(dá)量的影響見(jiàn)圖2。

表1 4組大鼠行為學(xué)積分、缺血側(cè)含水量、缺血對(duì)側(cè)含水量及ET-1蛋白表達(dá)的比較Tab.1 Comparison of behavioral integral,water content in ischemic cerebral tissues and contralateral cerebral tissues,as well as ET-1 protein expression among four groups of rats ±s

表1 4組大鼠行為學(xué)積分、缺血側(cè)含水量、缺血對(duì)側(cè)含水量及ET-1蛋白表達(dá)的比較Tab.1 Comparison of behavioral integral,water content in ischemic cerebral tissues and contralateral cerebral tissues,as well as ET-1 protein expression among four groups of rats ±s

與模型組比較,*1P<0.05,*2P<0.01Compared with model group,*1P<0.05,*2P<0.01

組別大鼠/只劑量/ (g·kg-1)行為學(xué)積分/分缺血側(cè)含水量/%缺血對(duì)側(cè)含水量/% ET-1陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)/%鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低劑量組8 15 6.22±1.42*182.05±0.64*177.05±0.59 24.32±6.76*2高劑量組8 30 5.93±2.10*280.27±0.75*176.87±0.48 17.44±5.24*2模型組8…8.44±2.01 89.62±0.77 77.62±0.63 56.24±8.18假手術(shù)組8…0.00±0.00*275.21±0.49*275.15±0.55 6.15±0.94*2

圖1 4組大鼠缺血側(cè)腦組織ET-1蛋白表達(dá)(SABC,×400)A.假手術(shù)組;B.模型組;C.低劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組;D.高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組Fig.1 ET-1 protein expression in ischemic cerebral tissues in four groups of ratsA.shamoperation group;B.model group;C.low-dose zhenganχifeng decoction;D.high-dose zhengan ifeng decoction

圖2 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4與AQP9蛋白的影響A.假手術(shù)組;B.模型組;C.低劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組;D.高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組;與模型組比較,*1P<0.01,*2P<0.05

3 討論

腦組織含水量調(diào)節(jié)對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的生理功能至關(guān)重要。腦水腫是缺血性腦卒中發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要病理現(xiàn)象,是局部腦缺血性損傷、腦梗死面積擴(kuò)大的重要原因。既往研究顯示,一側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞后,病灶側(cè)大腦含水量可顯著增加,腦水腫程度是重要的早期腦損傷指標(biāo),并對(duì)腦損傷的發(fā)展有預(yù)測(cè)作用,而AQPs在腦水腫的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用［10］。AQP4是腦內(nèi)表達(dá)最多的AQP［11］,廣泛存在于腦組織,主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、脈絡(luò)叢等部位［12-13］,參與腦脊液重吸收、滲透壓調(diào)節(jié),并兼有細(xì)胞外滲透壓感受器和水平衡調(diào)節(jié)器的功能［14］,在腦組織水的運(yùn)輸調(diào)節(jié)中起著重要作用。AQP9屬于水甘油通道,在腦組織中含量豐富,主要存在于室管膜細(xì)胞以及下丘腦內(nèi)側(cè)基底部,分布于腦組織星型膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和兒茶酚胺類神經(jīng)元的胞膜上［15-18］,具有相對(duì)選擇通透性,與組織中水的轉(zhuǎn)運(yùn),水電解質(zhì)的平衡調(diào)節(jié)有關(guān),并參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞外間隙與體循環(huán)之間的信號(hào)傳遞［19-22］。由于細(xì)胞水通道蛋白是組織細(xì)胞的水液代謝的重要調(diào)控者,故腦組織中主要水通道蛋白AQP4和AQP9的表達(dá)對(duì)異常的水液代謝有著重要的作用［23］。

本次實(shí)驗(yàn)顯示,阻斷MCA 6 h后,所有動(dòng)物均出現(xiàn)不同程度的運(yùn)動(dòng)障礙。與模型組比較,在MCAO前預(yù)先使用不同劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯均可有效改善大鼠行為學(xué)積分。MCAO大鼠腦組織含水量缺血側(cè)腦組織含水量較假手術(shù)組大鼠有非常顯著的增加,但不同劑量的鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)先使用均可明顯減少M(fèi)CAO大鼠缺血側(cè)腦組織含水量。結(jié)果提示預(yù)先使用鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)局灶性腦缺血引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及相應(yīng)的行為學(xué)變化具有一定的改善作用。與假手術(shù)組比較,MCAO模型組大鼠在腦缺血6 h后,缺血側(cè)腦組織中ET-1蛋白質(zhì)表達(dá)有顯著性升高,并與腦水腫程度呈正比,這與BARONE等［24］研究結(jié)果一致,而鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯高、低劑量干預(yù)組MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織中ET-1表達(dá)量均有不同程度下降。

MCAO模型組大鼠缺血6 h后缺血側(cè)腦組織AQP4蛋白表達(dá)量與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而AQP9蛋白表達(dá)量有非常顯著的增加,這與LO等［7］研究結(jié)果一致,推測(cè)缺血急性期即出現(xiàn)局部組織水代謝障礙,但在腦組織中表達(dá)量最大的AQP4蛋白表達(dá)改變不顯著。因此,AQP9蛋白應(yīng)激性表達(dá)增加并不足以調(diào)節(jié)局部水液代謝障礙,以致腦水腫程度不斷加重。而鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)先使用可明顯增加MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4與AQP9蛋白表達(dá)量。

綜上所述,鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可能通過(guò)下調(diào)急性局部腦缺血性損傷后產(chǎn)生ET-1的作用影響缺血后腦組織AQP4與AQP9表達(dá),發(fā)揮其減輕腦水腫、改善神經(jīng)功能的作用。

［1］唐焜,謝小慧,陳志達(dá),等.仙人掌多糖對(duì)大鼠局灶性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2012,31(9):1109-1112.

［2］孟云輝,凃欣,吳艷霞,等.鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦保護(hù)作用的研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2007,30(2):101-104.

［3］吳艷霞,吳婷玉,葉紅,等.鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯預(yù)處理對(duì)MACO大鼠腦組織病理學(xué)變化和神經(jīng)元凋亡的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(9):224-228.

［4］PAPADOPOULOSMC,MANLEY G T,KRISHNA S,et al. Aquaporin-4 facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema[J].FASEB J,2004,18(11):1291-1293.

［5］BADAUT J,HIRT L,GRANZIERA C,et al.Astrocytespecific expression of aquaporin-9 in mouse brain is increased after transient focal cerebral ischemia[J].Cereb Blood Flow Metab,2001,21(5):477-482.

［6］胡安義,劉莉.丹參注射液對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛患者血管內(nèi)皮功能及炎癥因子的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2011,30 (3):319-321.

［7］LO A C Y,CHEN A Y S,HUNG V K L,et al.Endothelin-1 overexpression leads to furtherwater accumulation and brain edema aftermidd le cerebral artery occlusion via aquaporin 4 expression in astrocytic end-feet[J].Cereb Blood Flow Metab,2005,25(8):998-1011.

［8］PANTONI L,GARCIA J H,GUITIERREZ J A.Cerebral whitematter is highly vulnerable to ischemia[J].Stroke, 1996,27(9):1641-1647.

［9］SLAVIANKA M,ROUMEN K,LIDIA K.Multi-unit activity suppression and sensorimotor deficits after endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion in conscious rats[J].JNeuro Sci,2003,212(1-2):59-67.

［10］MANLEY G T,FUJIMURA M,MA T,et al.Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke[J].NatMed,2000,6(2): 159-163.

［11］PAPADOPOULOS MC,KRISHNA S,VERKMAN A S. Aquaporin water channels and brain edema[J].Mt Sinai J Med,2002,69(4):242-248.

［12］YANG M,GAO F,LIU H,et al.Immunolocalization of aquaporins in rat brain[J].Anat Histol Embryol,2011,40 (4):299-306.

［13］VERKMAN A S.Physiological importance of aquaporin water channels[J].Ann Med,2002,34(3):192-200.

［14］NAKAHAMA K,NAGANO M,FUJIOKA A,et al.Effect of TPA on aquaporin 4 mRNA expression in cultured ratastrocytes[J].Glia,1999,25(3):240-246.

［15］GUERIN C F,REGLIL,BADAUT J.Roles of aquaporins in the brain[J].Medi Sci,2005,21(8-9):747-752.

［16］BADAUT J,PETIT JM,BRUNET JF,et al.Distribution of Aquaporin 9 in the adult rat brain:preferential expression in catecholaminergic neurons and in gial cells[J]. Neuroscience,2004,128(1):27-38.

［17］IANDIEV I,BIEDERMANN B,REICHENBACH A,et al. Expression of aquaporin-9 immuno-reactivity by catecholaminergic amacrine cells in the rat retina[J]. Neurosci Lett,2006,398(3):264-267.

［18］ROJEK A M,SKOWRONSKIMT,FUCHTBAUER E M,et al.Defective glycerol metabolismin aquaporin 9(AQP9) knockoutmice[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104 (9):3609-3614.

［19］BADAUT J,REGLI L.Distribution and possible roles of aqu-aporin 9 in the brain[J].Neuroscience,2004,129 (4):971-981.

［20］WARTH A,MITTELBRONN M,HULPER P,et al.Expression of the water channel protein aquaporin-9 in malignant brain tumors[J].Appl ImmunohistochemMol Morphol, 2007,15(2):193-198.

［21］DIBAS A,YANG MH,BOBICH J,et al.Stress-induced changes in neuronal Aquaporin-9(AQP9)in a retinal ganglion cell-line[J].Pharmacol Res,2007,55(5):378-384.

［22］BADAUT J,HIRT L,GRANZIERA C,et al.Astrocytespecific expression of aquaporin-9 in mouse brain is increased after transient focal cerebral ischemia[J].Cereb Blood Flow Metab,2001,21(5):477-482.

［23］ZELENINA M.Regulation of brain aquaporins[J].NeurochemInt,2010,57(4):468-488.

［24］BARONE F C,OHLSTEIN E H,HUNTER A J,et al. Selective antagonismof endothelin-A-receptors improves outcome in both head trauma and focal stroke in rat[J].J Cardiovas Pharmac,2000,36(5 Suppl 1):357-361.

DOI 10.3870/yydb.2014.02.012

Effect of Zhengan Xifeng Decoction Pretreatment on Endothelin-1 and Aquaporin Expression in Cerebral Tissue of Middle Cerebral Artery Occlusion Rats

WU Yan-xia1,LI Xiu-juan1,MA Wei2
(1.Department of Geriatrics;2.Center of Eχperimental Medicine, Wuhan First Hospital,Wuhan 430022,China)

Objective To study the neuroprotective effect ofzhenganχifengdecoction(ZGXFD),a tranditional Chinese herbal compound,on conscious ratswithmidd le cerebral artery occlusion(MCAO).MethodsThe ratmodel of focalcerebral ischemia was established with the suture-occuluded method and was treated with different doses of ZGXFD(1.5 and 3 g·mL-1,respectively)before MCAO.The effect of ZGXFD on the behavior disorder and extent of cerebral edema of the MCAO rats were detected.ET-1 expression in the rat brain tissues was examined by immunohistochemistry method.The AQP 4 and AQP 9 expression were determined by Western blotting.ResultsA fter MCAO,different degrees of behavior disorder appeared in all rats.Pretreatmentwith ZGXFD improved the grade of behavior disorder of the rats,reduced the extent of cerebral edema,and increased AQP4 and AQP9 obviously.After MCAO,the tissue ET-1 expression was increased obviously but the ZGXFD could reverse it.Compared with the MCAO group,the AQP9 protein expression significantly increased after 6 h of hypoxiawhile the AQP4 did not change.ConclusionThese findings suggest that ZGXFD can directlymodulate ET-1,AQP4 and AQP9 expression and reduce cerebral edema.

Zhenganχifengdecoction;Occlusion,middle artery,cerebral;Endothelin-1;Aquaporin

R285

A

1004-0781(2014)02-0179-05

2013-05-15

2013-08-19

*湖北省科技廳科技攻關(guān)計(jì)劃(2007AA301B09-3)

吳艷霞(1972-),女,湖北武漢人,副主任醫(yī)師,博士,主要從事老年心腦血管疾病方面的研究。電話:(0) 13871557955,E-mail：spring_w@126.com。