陸華，程道海，雷小光，何云燕，萬瑞融，蘇明，吳克婕，羅建明

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1．藥學(xué)部；2．兒科，南寧 530021；3．桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)本科2009級，桂林 541004)

高效液相色譜法測定人血漿中去鐵酮含量*

陸華1，程道海1，雷小光1，何云燕2，萬瑞融1，蘇明1，吳克婕3，羅建明2

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1．藥學(xué)部；2．兒科，南寧 530021；3．桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)本科2009級，桂林 541004)

目的建立高效液相色譜法測定人血漿中去鐵酮(DFP)含量。方法Kromasil C18色譜柱(4.6 mm× 200 mm,5μm),流動相:乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氫鉀(含5 mmol·L-1庚烷磺酸鈉,1%三乙胺)＝11∶89(用磷酸調(diào)至pH1.3),檢測波長:278 nm,柱溫:25℃,進樣量:20μL,流速:1mL·min-1。結(jié)果DFP在0.5～80.0 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性良好(r＝0.996 5),最低檢出濃度為0.5 mg·L-1。高、中、低3種濃度樣品絕對回收率>85.6%,方法回收率>89.9%,日內(nèi)精密度RSD在1.61%～3.70%,日間精密度RSD在1.84%～4.81%。結(jié)論該方法操作簡便易行,快速準(zhǔn)確,靈敏度高,專屬性強,適用于DFP的人體血漿濃度測定。

去鐵酮；人體血漿；色譜法,高效液相；含量測定

去鐵酮(deferiprone,DFP),化學(xué)名稱3-羥基-1,2-二甲基-4-(1H)-吡啶酮(3-hydroxy-1,2-dimethylpyridin-4(1H)-one),分子式:C7H9NO2,為口服的二齒狀金屬螯合劑,臨床上常用于治療耐受或不愿意接受現(xiàn)有螯合劑治療的鐵負(fù)荷過多的β地中海貧血［1］。β地中海貧血為廣西常見的兒童遺傳性血液病,臨床上表現(xiàn)為慢性血管外溶血,重型死于貧血及含鐵血黃素沉著癥［2］。因此有必要通過檢測患兒體內(nèi)去鐵酮血藥濃度來指導(dǎo)臨床合理用藥。目前,國內(nèi)文獻只有采用高效液相色譜法測定動物血漿中DFP含量的報道［3-6］,筆者尚未見有關(guān)建立人體血漿的DFP含量測定方法的報道。本實驗建立適用于人體血漿DFP藥物濃度檢測的高效液相色譜-紫外檢測法,方法具有操作簡便、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性強的特點,并在服藥患者身上得到驗證。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 DFP對照品(海南希源化工科技有限公司,批號:1101002,規(guī)格:5 g,含量99.1%)；內(nèi)標(biāo)物:替硝唑(中國食品藥品檢定研究院,批號:100336-200402,純度:100%)；健康人空白血漿(南寧市中心血站)；乙腈(色譜純,天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心)；磷酸二氫鉀(分析純,成都市科龍化工試劑廠)；庚烷磺酸鈉(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)；三乙胺(分析純,成都市科龍化工試劑廠)；磷酸(分析純,汕頭市光華化學(xué)廠)。硫酸鋅(分析純,廣州化學(xué)試劑廠)；甲醇(色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

1.2 儀器 LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-6AV UV-VIS檢測器(日本島津公司)；N2000雙通道色譜工作站(浙江大學(xué)智達信息工程有限公司)；DF110電子分析天平(江蘇常熟衡器廠)；PHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠)；XW-80A渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；H.H.S電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)；TDXFLX75003530/02高速離心機(美國雅培公司)；TF-50溶劑過濾器(天津市津騰實驗設(shè)備有限公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；SB2200超聲儀(上海BRANSON公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(4.6 mm× 200 mm,5μm)；流動相:乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氫鉀(含5 mmol·L-1庚烷磺酸鈉、1%三乙胺)＝11∶89 (用磷酸調(diào)pH至1.30)；檢測波長278 nm；柱溫25℃；進樣體積20μL；流速1.0 mL·min-1。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照溶液制備 精密稱取DFP對照品(含量99.1%)0.100 6 g置于50 mL量瓶,用去離子水溶解并稀釋至刻度,配制成濃度為1 994 mg·L-1的DFP對照品儲備液。配制成的溶液置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液制備 精密稱取內(nèi)標(biāo)物替硝唑0.008 4 g置于5 mL量瓶,用去離子水溶解并稀釋至刻度,配制成濃度為1 680 mg·L-1的替硝唑內(nèi)標(biāo)溶液。配制成的溶液置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 沉淀劑制備 稱取硫酸鋅30.0 g于100 mL量瓶,用去離子水溶解并稀釋至刻度,配制成30%硫酸鋅溶液作沉淀劑。配制成的溶液置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血樣處理 取血漿425μL,加內(nèi)標(biāo)儲備液25μL,混勻后加入沉淀劑50μL,置于1.5 mL離心管,渦旋振搖1 min,置50℃水浴鍋中保溫10 min,冷卻,10 900 r·min-1離心5 min,取上清液按“2.1”項進樣,記錄色譜圖。

2.4 方法驗證 取DFP對照溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各25μL,加適量純化水混勻,配制成A液500μL；取DFP對照溶液、內(nèi)標(biāo)溶液各25μL,沉淀劑50μL,加適量純化水混勻,配制成B液500μL；取沉淀劑50μL,加適量健康人空白血漿混勻,配制成C液500μL；取DFP對照溶液、內(nèi)標(biāo)溶液各25μL,沉淀劑50μL,加適量健康人空白血漿混勻,配制成D液500μL。A、B、C、D液按“2.3”項的“渦旋振搖1 min,置50℃水浴鍋中保溫10 min,冷卻,10 900 r·min-1離心5 min,取上清液按“2.1”項進樣得色譜圖(圖1)。結(jié)果圖1A顯示DFP和內(nèi)標(biāo)在該色譜條件下峰形良好,能有效分離,保留時間控制在10 min內(nèi)；圖1C,圖1D顯示血漿中成分對DFP和內(nèi)標(biāo)測定無干擾；比較圖1A、圖1B的DFP的峰面積,以及與內(nèi)標(biāo)峰面積進行比值,無明顯差異,說明加入的沉淀劑(30%硫酸鋅)對含量測定結(jié)果無干擾。

圖1 DFP高效液相色譜圖A.純化水加DFP、內(nèi)標(biāo)(替硝唑);B.純化水加DFP、內(nèi)標(biāo)、沉淀劑;C.空白血漿加沉淀劑;D.空白血漿加DFP、內(nèi)標(biāo)、沉淀劑;1.DFP;2.替硝唑Fig.1 HPLC Ch romatogramof DeferiproneA.distilled water spiked with deferiprone and reference substance(tinidazole);B.distilled water spiked with deferiprone、reference substance and precipitant;C.blank plasma spiked with precipitant;D.blank plasma spiked with deferiprone、reference substance and precipitant;1.deferiprone;2.tinidazole

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 按“2.3”項操作取DFP對照品儲備液(濃度為1 994 mg·L-1),用健康人空白血漿稀釋成含0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,40.0,80.0 mg·L-1的各系列濃度,進樣并記錄DFP和內(nèi)標(biāo)峰面積,并將其比值(Y)與各對應(yīng)的DFP濃度(X,mg·L-1)作線性回歸分析,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y＝0.027 7X+0.019 3,r＝0.996 5,結(jié)果表明,DFP濃度在0.5～80.0 mg·L-1范圍內(nèi)線性良好,定量下限為0.5 mg·L-1。

2.6 準(zhǔn)確度與回收率實驗 分別取濃度為1.0, 20.0,80.0mg·L-1的DFP對照品系列水溶液(含定量內(nèi)標(biāo)替硝唑84.0 mg·L-1)直接進樣,得低、中、高濃度對照品的DFP與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y0)；再按“2.3”項操作取DFP對照品儲備液用健康人空白血漿稀釋成濃度為1.0,20.0,80.0 mg·L-1(C0)的對照品系列血漿,上清液按“2.1”進樣,得DFP和內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Yt),比值Yt代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算DFP的濃度Ct,以Yt/Y0×100%計算即得血漿樣本處理的絕對回收率,以Ct/C0×100%計算即得血樣處理的方法回收率。結(jié)果見表1。

表1 DFP回收率實驗結(jié)果(n=5)Tab.1 Recovery of Deferiprone(n=5) %,±s

表1 DFP回收率實驗結(jié)果(n=5)Tab.1 Recovery of Deferiprone(n=5) %,±s

濃度/ (mg·L-1)絕對回收率RSD方法回收率RSD 1.0 93.6±5.24 5.60 107.2±3.22 3.00 20.0 85.6±1.61 1.88 89.9±1.43 1.59 80.0 90.8±1.88 2.07 96.9±2.37 2.45

2.7 精密度實驗 按“2.3”項下操作取DFP對照品儲備液用健康人空白血漿稀釋成濃度為1.0,20.0, 80.0 mg·L-1的對照系列血漿,上清液按“2.1”項色譜條件進樣,各濃度于1 d內(nèi)測定5次和每日測定1次,連續(xù)測定5 d。結(jié)果見表2。

表2 DFP精密度實驗結(jié)果 (n=5)Tab.2 Precision of Deferiprone (n=5)

2.8 專屬性 分別取含有丙戊酸鈉、卡馬西平、環(huán)孢素A、甲氨蝶呤的患兒血漿,按“2.3”項血樣處理操作后按照色譜條件進樣；之后平行加入DFP溶液(濃度為399.2 mg·L-1)25μL,按“2.3”項血樣處理操作后按照色譜條件進樣,考察4種臨床兒科常用藥物對DFP含量測定的色譜條件影響,結(jié)果表明這些藥物在該色譜條件下對人體血漿DFP含量測定無干擾。

2.9 β-地中海貧血患兒服用DFP 2 h后測定DFP血藥濃度 患兒(男)按25 mg·kg-1一次頓服去鐵酮片(加拿大Apotex公司,規(guī)格:每片0.5 g),服藥后2 h取血漿,按“2.3”項血樣處理操作,得色譜圖(圖2),測得患兒DFP血漿濃度為4.8 mg·L-1。

3 討論

圖2 患者血漿高效液相色譜圖1.DFP;2.替硝唑Fig.2 HPLC chromatography of patient plasma1.deferiprone;2.tinidazole

對于流動相的篩選,參考文獻［3-8］并結(jié)合實驗,最終確定以乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氫鉀(含5 mmol·L-1庚烷磺酸鈉、1%三乙胺)＝11∶89為流動相,其中選擇的庚烷磺酸鈉能與DFP形成離子對形式,消除DFP峰拖尾現(xiàn)象［3］；文獻提供的流動相中加入乙二胺四乙酸試劑［3-8］,筆者在本研究也實驗過,但均產(chǎn)生峰形拖尾,最后更換為三乙胺；流動相的pH為3［3-8］條件下,峰形拖尾較嚴(yán)重,當(dāng)在酸性更高條件下,特別調(diào)整到pH為1.3時,能較好地解決DFP峰拖尾問題,且血漿雜峰對測定無干擾,內(nèi)標(biāo)峰與DFP峰均獲得理想的保留時間,所以本實驗流動相pH確定為1.3,色譜柱選用耐酸性好的Kromasil C18柱。

根據(jù)文獻［3-6］報道DFP在紫外波長278 nm處有強的吸收峰,且能減少流動相和血漿對DFP峰的干擾,所以本研究采用該波長作為檢測波長；通過篩選咖啡因［9］、甲硝唑［5］等化合物,最終確定峰形良好、保留時間適合的替硝唑作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

實驗過程選擇乙腈作為蛋白沉淀劑,但處理后DFP峰形仍出現(xiàn)拖尾。改用30%硫酸鋅做蛋白沉淀劑,DFP峰和內(nèi)標(biāo)峰峰形理想,對測定結(jié)果無影響。

通過測定1例β-地中海貧血患兒服用DFP后的血藥濃度證實該方法的可行性。本方法操作簡便易行,快速準(zhǔn)確,靈敏度高,專屬性強,適合用于臨床上測定人體血漿中DFP的含量。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.008

High Performance Liquid Chromatography Method for Determination of Deferiprone in Human Plasma

LU Hua1,CHENG Dao-hai1,LEI Xiao-guang1,HE Yun-yan2,WAN Rui-rong1,SU Ming1,WU Ke-jie3, LUO Jian-ming2
(1.Department of Pharmacy;2.Department of Paediatrics,the First Hospital of Guangχi Medical University,Nanning 530021,China;3.Grade of 2009,Department of Pharmacy,Guilin Medical College,Guilin 541004,China)

Objective To establish a high performance liquid chromatography(HPLC)method for the determination of deferiprone in human plasma.MethodsThe analytical column was a Kromasil C18column(4.6 mm×200 mm,5μm).The mobile phase was amixture of acetonitrile and buffer of50 mmol·L-1potassiumdihydrogen phosphate(containing 5 mmol·L-1sodiumheptanesulfonate and 1%triethylamine)(11∶89,pH adjusted to 1.3 with phosphoric acid).Detection wave-length was set at 278 nm.The column temperature was25℃.The injected volume was20μL.Flow rate was1 mL·min-1.ResultsThe calibration curve of deferiprone were linear in the range of0.5-80.0mg·L-1(r＝0.996 5),and the lower limit of detection was 0.5 mg·L-1.The absolute recoveries of deferiprone at low,mediumand high concentrations weremore than 85.6%,and the method recoveries were more than 89.9%.The intraday coefficients of variation were 1.61%-3.70%,and the interday coefficients of variation were 1.84%-4.81%.ConclusionThemethod is simple,quick,accurate,sensitive,and specific, and can be used in detecting deferiprone concentration in human p lasma.

Deferiprone;Human plasma;High performance liquid chromatography;Content determination

R969.1

A

1004-0781(2014)02-0164-04

2013-03-21

2013-06-30

*廣西科技廳自然科學(xué)基金面上項目(2012GXNSFAA053145)；廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費科研課題(Z2011347)

陸華(1970-),男,廣西南寧人,副主任藥師,學(xué)士,研究臨床合理用藥。電話:0771-5356379,E-mail：hualude@sina.com。

羅建明(1958-),男,廣西貴港人,主任醫(yī)師,教授,博士,兒童血液病專業(yè)。電話:(0)13517667021,E-mail：luojm06@yahoo.com.cn。