趙永明,王金,石紅,劉紅彬,鄭麗卿,董曉華

(1.河北北方學(xué)院藥學(xué)系,張家口 075000;2.浙江九旭藥業(yè)有限公司,金華 321016)

蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用*

趙永明1,王金1,石紅2,劉紅彬1,鄭麗卿1,董曉華1

(1.河北北方學(xué)院藥學(xué)系,張家口 075000;2.浙江九旭藥業(yè)有限公司,金華 321016)

目的 觀察蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用。方法采用線栓法制備局灶性腦缺血-再灌注模型,在腦缺血2 h再灌注24 h后,對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分,并測定腦梗死體積;同時(shí)測定腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)及線粒體中ATP酶的含量。結(jié)果與模型對照組比較,蛇床子素能降低腦梗死體積、改善腦缺血-再灌注大鼠神經(jīng)功能,升高SOD活性、增加GSH含量,同時(shí)降低MDA含量。結(jié)論蛇床子素對大鼠腦缺血-再灌注損傷有保護(hù)作用。

蛇床子素;缺血-再灌注,腦;自由基

缺血性腦血管疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病,由于發(fā)病率高、容易致殘而嚴(yán)重影響公眾健康,探索有效的預(yù)防與治療措施具有積極的社會(huì)意義。蛇床子素(Osthole),化學(xué)名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素,分子式C15H16O3,是傘形科植物蛇床子中提取得到的一種香豆素類單體。目前研究證實(shí)蛇床子素具有改善學(xué)習(xí)記憶[1-2]、清除自由基[3]、抑制血細(xì)胞聚集和血栓形成[4]等作用。本實(shí)驗(yàn)制備與臨床發(fā)病情況相似的大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型,進(jìn)一步研究蛇床子素對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley, SD)大鼠72只,體質(zhì)量260～290 g,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京) 2006-0008)。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中。

1.2 藥物及試劑 蛇床子素(西安開來生物工程有限公司,純度＞98%),尼莫地平(拜耳醫(yī)藥保健有限公司,批號(hào):122514);氯代三苯基四氮唑(TTC,天津巴斯夫化工有限公司,分析純);丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所,Na+-K+-ATP ase、Ca2+-Mg2+-ATP ase試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 分組與模型構(gòu)建 大鼠隨機(jī)分為6組,即假手術(shù)組、模型對照組、蛇床子素小、中、大劑量組(4,8, 16 mg·kg-1)和尼莫地平組(4 mg·kg-1),每組12只。缺血后1 h分別腹腔注射蛇床子素和尼莫地平, qd,連續(xù)給藥14 d,假手術(shù)組和模型對照組腹腔注射等體積的溶劑。給藥劑量參照文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]。采用Longa法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery occlusion,MCAO)局灶性腦缺血-再灌注損傷模型[7]。在腦缺血2 h再灌注24 h后,每組取6只大鼠迅速斷頭處死,取腦,去除腦膜和血液,用磷酸鹽緩沖溶液制備10%腦組織勻漿。部分勻漿液經(jīng)1 000 r·min-1離心10 min后,取上清液繼續(xù)12 000 r·min-1離心15 min,沉淀物加0.9%氯化鈉溶液即為線粒體懸液。

1.4 神經(jīng)功能行為評(píng)分 按Longa評(píng)分法,于缺血2 h、再灌注22 h對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,標(biāo)準(zhǔn)如下:0分,無神經(jīng)功能缺失;1分,輕微局灶性神經(jīng)缺陷(左側(cè)前爪不能完全伸直);2分,中度局灶性神經(jīng)缺陷(向左側(cè)旋轉(zhuǎn));3分,嚴(yán)重的局灶性神經(jīng)缺陷(行走時(shí)向左側(cè)傾斜);4分,不能行走[7]。

1.5 大鼠腦組織勻漿SOD、MDA、GSH的測定 分別取腦組織勻漿和線粒體懸液,其余操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,分別測定SOD、MDA和GSH含量。

1.6 線粒體組分ATP酶的測定 取線粒體懸液,按試劑盒操作說明測定Na+-K+-ATP ase,Ca2+-Mg2+-ATP ase活性。

1.7 腦梗死體積測定 在腦缺血2 h再灌注24 h后,迅速斷頭處死大鼠,取腦,用腦切片器間隔2 mm連續(xù)切片,共做冠狀切片6個(gè),置2%TTC溶液中,37℃水浴孵育30 min,然后用10%甲醛固定。染色后由于TTC被還原,最終正常腦組織呈紅色,而缺血區(qū)呈白色;拍照后用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測定梗死面積,最后計(jì)算總梗死體積,以缺血損傷區(qū)占全腦體積的百分比評(píng)價(jià)腦損傷程度[8-9]。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 各組大鼠于MCAO術(shù)后,除假手術(shù)組外,其余各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙,主要表現(xiàn)為前肢肌張力降低、活動(dòng)時(shí)步態(tài)不穩(wěn)(向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈)、提尾懸空時(shí)前肢內(nèi)收等。蛇床子素小、中、大劑量組,尼莫地平組對缺血-再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能障礙均有改善作用,與模型對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

2.2 蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠線粒體組分ATP酶的影響 腦缺血-再灌注24 h,與假手術(shù)組比較,模型對照組大鼠線粒體中Na+-K+-ATP ase,Ca2+-Mg2+-ATP ase活性明顯降低;而蛇床子素藥物組和尼莫地平組Na+-K+-ATP ase,Ca2+-Mg2+-ATP ase活性則明顯升高。見表2。

2.3 蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織SOD、MDA、GSH的影響 與假手術(shù)組大鼠比較,模型對照組大鼠SOD活性明顯降低,MDA含量明顯升高,而GSH含量則顯著降低。小、中、大劑量蛇床子素和尼莫地平可在一定程度上逆轉(zhuǎn)上述作用,能升高SOD活性、增加GSH含量,同時(shí)降低MDA含量。見表3。

表1 6組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較Tab.1 Comparison of neurological scores among six groups of rats 分±s

表1 6組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較Tab.1 Comparison of neurological scores among six groups of rats 分±s

與模型對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

神經(jīng)功能評(píng)分假手術(shù)組12…組別大鼠/只劑量/ (mg·kg-1) 0.00±0.00模型對照組12…3.48±0.57尼莫地平組12 4 1.93±0.46*1蛇床子素小劑量組12 4 2.75±0.39*2中劑量組12 8 1.62±0.34*1大劑量組12 16 1.33±0.28*1

表2 6組大鼠腦組織線粒體ATP酶活性比較Tab.2 Comparison of m itochondrial ATPase activity in brain among six groups of rats ±s

表2 6組大鼠腦組織線粒體ATP酶活性比較Tab.2 Comparison of m itochondrial ATPase activity in brain among six groups of rats ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared withmodel control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別大鼠/只劑量/ (mg·kg-1) Na+-K+-ATP Ca2+-Mg2+-ATP (mmol·g-1·h-1)假手術(shù)組6…? 6.02±0.77 6.84±1.37模型對照組6…3.34±0.53 3.97±0.81尼莫地平組6 4 5.25±0.42*16.01±0.63*1蛇床子素小劑量組6 4 3.65±0.61 4.68±0.66中劑量組6 8 4.42±0.76*25.32±1.01*2大劑量組6 16 4.73±0.88*15.66±1.13*1

2.4 蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響 腦缺血-再灌注24 h,發(fā)現(xiàn)除假手術(shù)組外,模型對照組、蛇床子素組和尼莫地平組大鼠腦組織均有不同程度梗死。與模型對照組比較,蛇床子素小劑量、中劑量、大劑量組和尼莫地平組腦梗死體積顯著降低。見圖1,表4。

3 討論

腦缺血-再灌注時(shí),毛細(xì)血管周圍會(huì)產(chǎn)生大量自由基。自由基進(jìn)一步攻擊神經(jīng)細(xì)胞膜,損傷血-腦脊液屏障,引發(fā)脂質(zhì)過氧化,促進(jìn)腦水腫形成,最終導(dǎo)致細(xì)胞膜功能缺失、線粒體受損或者神經(jīng)元死亡[10]。MDA作為脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物,能夠反映體內(nèi)自由基的數(shù)量及脂質(zhì)過氧化程度;SOD的活性變化則表達(dá)機(jī)體清除自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)觀察到,大鼠腦缺血2 h,再灌注24 h后,與假手術(shù)組比較,模型對照組腦組織勻漿SOD活性、GSH含量明顯降低,MDA含量明顯升高;與模型對照組比較,藥物組腦組織勻漿中SOD活性增強(qiáng)、MDA含量降低,表明蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷時(shí)產(chǎn)生的自由基具有清除作用。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的主要產(chǎn)能部位,當(dāng)腦缺血缺氧發(fā)生時(shí),線粒體功能降低,ATP量減少,使Na+-K+-ATP ase和Ca2+-Mg2+-ATP ase活性降低,最終細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+超載,進(jìn)一步加重腦缺血-再灌注損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛇床子素能抑制腦缺血-再灌注大鼠線粒體ATP ase活性降低,增強(qiáng)自由基清除能力,減少脂質(zhì)過氧化物的生成,從而起到保護(hù)線粒體作用。

綜上所述,蛇床子素對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠有明顯的線粒體保護(hù)作用和自由基清除作用,這可能是其保護(hù)缺血腦組織的作用機(jī)制之一。

表3 6組大鼠腦組織SOD、MDA、GSH水平比較Tab.3 Comparison of the content of SOD,MDA and GSH in brain among six groups of rats ±s

表3 6組大鼠腦組織SOD、MDA、GSH水平比較Tab.3 Comparison of the content of SOD,MDA and GSH in brain among six groups of rats ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別大鼠/只劑量/ (mg·kg-1) SOD/ (U·mg-1) MDA/ (μmol·g-1) GSH/ (mg·g-1)假手術(shù)組6…202.49±12.37 20.35±4.69 85.24±14.83模型對照組6…118.17±20.74 47.53±7.94 53.67±15.94尼莫地平組6 4 176.24±4.57*128.83±5.17*170.22±17.34*1蛇床子素小劑量組6 4 136.52±28.73*242.35±3.69 58.14±13.66中劑量組6 8 158.32±20.15*135.12±4.07*166.28±12.83*1大劑量組6 16 181.36±22.48*131.63±5.74*168.39±13.43*1

A.假手術(shù)組;B.模型對照組;C.尼莫地平組;D.蛇床子素小劑量組;E.蛇床子素中劑量組;F.蛇床子素大劑量組圖1 6組大鼠腦組織TTC染色圖A.sham group;B.model control group;C.nimodipine group;D.low-dose osthole group;E.medium-dose osthole group;F.high-dose osthole groupFig.1 TTC staining on brain of six groups of rats

表4 6組大鼠腦梗死體積比較Tab.4 Effect of osthole on the infarct volum e of six groups of rats ±s

表4 6組大鼠腦梗死體積比較Tab.4 Effect of osthole on the infarct volum e of six groups of rats ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.01Compared withmodel control group,*1P＜0.01

組別大鼠/劑量/相對腦梗死只(mg·kg-1)體積/%假手術(shù)組6…0.00±0.00模型對照組6…35.34±4.52尼莫地平組6 4 12.66±1.94*1蛇床子素小劑量組6 4 27.33±3.89*1中劑量組6 8 22.15±3.76*1大劑量組6 16 16.78±3.46*1

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.005

Protective Effects of Osthole on Rats with Focal Cerebral Ischem ia-reperfusion Injury

ZHAO Yong-ming1,WANG Jin1,SHI Hong2,LIU Hong-bin1,ZHENG Li-qing1,DONG Xiao-hua1
(1. Department ofPharmacy,HebeiNorth University,Zhangjiakou 075000,China;2.Zhejiang Jiuxu Pharmaceutical Co.,Ltd,Jinhua 321016,China)

Objective To investigate the potential mechanism and protective effects of osthole on rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury.MethodsMiddle cerebral artery occlusion was induced by the suture-occluded method. After 2 h of cerebral ischemia and 24 h of reperfusion,scores ofneurological deficits and infarct volumewere evaluated.The levels of SOD,MDA,GSH and ATPase were also determined.ResultsScores of neurological deficits and infarct volume were lower in the osthole groups than in themodel group.Meanwhile,the activity of SOD and GSH content were increased,while the MDA contentwas decreased in osthole groups.ConclusionOsthole exerts protective effects on rats with focal cerebral ischemiareperfusion injury.

Osthole;Ischemia-reperfusion,brain;Free radical

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)12-1558-04

2013-11-26

2014-02-22

*河北省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(20110173, 20120155);河北省教育廳資助項(xiàng)目(Z2011304);河北省科技廳資助項(xiàng)目(13272704D)

趙永明(1978-),女,河南汝南人,講師,碩士,從事中藥新藥開發(fā)研究。電話:0313-4029305,E-mail:zym2167 @163.com。