陳豫,褚倩,郭娟,黃玉,李文雯,田逸俊,夏曙,于世英

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院腫瘤科,武漢 430030)

·藥物研究·

依維莫司對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549放射增敏作用*

陳豫,褚倩,郭娟,黃玉,李文雯,田逸俊,夏曙,于世英

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院腫瘤科,武漢 430030)

目的 通過使用哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR抑制藥依維莫司抑制A549細(xì)胞mTOR信號通路,研究依維莫司是否具有放射增敏作用。方法單純放射治療(放療)或聯(lián)合依維莫司作用于人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,采用噻唑藍(lán)(MTT)法測定依維莫司對A549細(xì)胞抑制率并計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。應(yīng)用藥物20%抑制濃度(IC20)作用24 h后X線2,4,6,8 Gy照射。計算細(xì)胞克隆存活分?jǐn)?shù)及多靶單擊模型擬合生存曲線,并計算平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)、照射劑量2 Gy下細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF2)和放射增敏比(SER)。采用Western blot方法檢測γ-H2AX蛋白的表達(dá),并分析相對灰度值。結(jié)果依維莫司聯(lián)合放療可明顯提高A549細(xì)胞對射線的敏感性,依維莫司+照射組D0、Dq及SF2均明顯低于單純照射組,SER為1.36。依維莫司+照射組X線照射后24 h點γ-H2AX蛋白殘余量明顯高于單純照射組。結(jié)論依維莫司抑制mTOR信號通路能夠提高A549細(xì)胞的放射敏感性。

依維莫司;癌,非小細(xì)胞肺;放射增敏;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

放射治療(radiotherapy,放療)是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治療的重要手段。近年來,各種分子靶向藥物運用于放射增敏的基礎(chǔ)研究,以期提高放療效果,但目前臨床上尚無一種小分子抑制劑類藥物運用于肺癌放射增敏治療[1]。依維莫司(everolimus,RAD001)作為口服的小分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)抑制藥,已獲得美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性腎癌的治療。在NSCLC中,也已開展依維莫司單藥治療ⅢB/Ⅳ期NSCLC患者的Ⅱ期臨床實驗[2]。因此,筆者以人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系為研究對象,使用依維莫司抑制mTOR通路,以期提高A549細(xì)胞放射敏感性,并探討mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在放射增敏中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 依維莫司由諾華公司提供;H2AX抗體購自Cell Signaling Technology;γ-H2AX抗體(pS139)購自EPITOMICS;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG均購自武漢博士德生物工程有限公司;噻唑藍(lán)(thiazolyl blue, MTT)試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司; RS2000型實驗用生物學(xué)X線輻照儀(美國RAD SOURCE公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549為人肺腺癌細(xì)胞株,為本實驗室保存的單層貼壁生長細(xì)胞,使用含10%胎牛血清的Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640)培養(yǎng)液,于37℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 依維莫司對A549細(xì)胞的增殖抑制作用 采用MTT法測定依維莫司對A549細(xì)胞抑制率。確定放射增敏濃度。將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞以適當(dāng)濃度接種于96孔板,培養(yǎng)過夜貼壁后,加入依維莫司濃度分別為0.1,1,10,100,1 000 nmol·L-1的培養(yǎng)液。藥物作用72 h后,吸去含藥物的培養(yǎng)液,每孔更換新鮮無血清培養(yǎng)液100μL并加入MTT 10μL,37℃避光培養(yǎng)4 h,去掉MTT加入二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)每孔100μL,水平搖床上搖動15 min,酶標(biāo)儀波長492 nm測定吸光度(A)值,計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(加藥組A值-空白組A值)/(未加藥組A值-空白組A值)。按藥物效應(yīng)中效方程式法計算藥物半數(shù)抑制濃度(50%inhibition concentration,IC50)。

1.4 細(xì)胞照射 對數(shù)生長期細(xì)胞置于生物學(xué)X線輻照儀樣品箱中,設(shè)備常用輸出劑量為1 Gy·min-1,根據(jù)所需劑量設(shè)置照射時間。

1.5 克隆形成法測定依維莫司對A549細(xì)胞的放射增敏作用 取依維莫司的20%細(xì)胞抑制濃度(20% inhibition concentration,IC20)為藥物增敏濃度[3]。實驗分組為:單純照射組、依維莫司+照射組,每組設(shè)置復(fù)皿3個。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿,加入含有藥物的培養(yǎng)液作用24 h,0,2,4,6,8 Gy X線照射細(xì)胞后更換不含藥物培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)14 d。每皿加入甲醇溶液1 mL固定細(xì)胞20 min,結(jié)晶紫染色15 min。自然干燥后計數(shù)細(xì)胞克隆(50個/克隆),計算集落形成率(plating efficiency,PE)及細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(surviving fraction,SF)。PE(%)=空白對照組集落數(shù)/空白對照組接種細(xì)胞數(shù)×100%;SF=某一劑量照射實驗組的集落數(shù)/該組細(xì)胞接種數(shù)×PE。加藥照射組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均用單純給藥組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)校正,以消除藥物作用對SF的影響。

1.6 細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞按上述分組給藥作用24 h,X線4 Gy照射細(xì)胞后,于0,30, 60 min和4,12,24 h時間點進行處理。細(xì)胞裂解液(50 mmol·L-1Tris-鹽酸,150 mmol·L-1氯化鈉,1% NP-40,0.5%去氧膽酸鈉,0.02%疊氮鈉,0.1%十二烷基硫酸鈉,100μg·mL-1苯甲基磺酰氟,1μg·mL-1抑肽酶,1%磷酸化酶抑制劑)提取細(xì)胞總蛋白,聚氰基丙烯酸正丁酯法測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液,加熱變性后分裝保存于-80℃冰箱。取60μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)電泳,將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,室溫封閉液(TBS+5%脫脂奶粉+0.5%聚山梨酯-20)封閉1 h,加入相應(yīng)濃度一抗(H2AX 1∶1 000,γ-H2AX 1∶5 000)4℃孵育過夜, TBS-T洗膜后加入1∶5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育1 h,采用增強化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescene,ECL)曝光膠片,顯像。使用AlphaEaseFC系統(tǒng)對結(jié)果進行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 由SPSS18.0版統(tǒng)計軟件完成數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,t檢驗比較兩組差異。以P＜0.05表示有差異有統(tǒng)計學(xué)意義。GraphPad Prism 5進行克隆形成實驗數(shù)據(jù)分析及多靶單擊模型曲線擬合,計算平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)、照射劑量2 Gy下細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction at 2 Gy, SF2)和放射增敏比(sensitivity enhancement ratio,SER)。

2 結(jié)果

2.1 依維莫司對A549細(xì)胞抑制作用 依維莫司對A549細(xì)胞有明顯地抑制作用,且該作用存在劑量依賴性。根據(jù)藥物效應(yīng)中效方程式法計算藥物IC50,依維莫司的IC50為(74.6±1.1)nmol·L-1。通過中效作圖法,依維莫司的IC20約為0.8 nmol·L-1,取IC20為放射增敏濃度。

2.2 抑制mTOR提高A549細(xì)胞對射線的敏感性通過多靶單擊模型擬合細(xì)胞生存曲線發(fā)現(xiàn),依維莫司+照射組的D0、Dq及SF2均明顯低于單純照射組,且SER值為1.36。抑制mTOR后可明顯地提高A549細(xì)胞對射線的敏感性。結(jié)果見表1,圖1。

2.3 DNA雙鏈斷裂標(biāo)志γ-H2AX及H2AX蛋白表達(dá)變化 Western blot檢測兩組0,0.5,1,4,12及24 h點γ-H2AX蛋白表達(dá)。與單純照射組比較,依維莫司+照射組γ-H2AX蛋白表達(dá)持續(xù)時間延長,在24 h點殘余量增高。結(jié)果見圖2,3。

表1 兩組多靶單擊模型擬合實驗參數(shù)Tab.1 Fitted parameters ofmultitarget one-hitmodel in two groups

圖1 兩組A549細(xì)胞生存曲線圖Fig.1 Survival curves of A549 cells in two groups

圖2 兩組γ-H2AX蛋白表達(dá)變化電泳圖Fig.2 Electrophotogram ofγ-H2AX protein expression in two groups

圖3 兩組A549細(xì)胞γ-H2AX蛋白灰度值變化柱狀圖Fig.3 Histograms of the gray values ofγ-H2AX protein in A549 cells in two groups

3 討論

PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞一系列重要的生理活動,包括細(xì)胞生長、增殖及生存[4],抑制這條通路治療腫瘤成為研究熱點之一[5]。絲氨酸-蘇氨酸激酶mTOR是蛋白質(zhì)合成的主要調(diào)節(jié)因子,在與細(xì)胞生長及生存相關(guān)的其他重要進程如血管發(fā)生及自噬中也起到關(guān)鍵作用[6]。mTOR在細(xì)胞中存在兩種不同功能的復(fù)合體,分別是mTORC1和mTORC2。mTORC1復(fù)合體由mTOR、Raptor、mLST8和PRAS40蛋白組成,對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素雷帕霉素及其類似物敏感[7]。作為雷帕霉素類似物,與前者相比,依維莫司在分子結(jié)構(gòu)上增加了羥乙基,使其水溶性更好,提高了口服吸收效率,因此具有更好的藥動學(xué)效應(yīng)[8]。與雷帕霉素一樣,依維莫司在細(xì)胞內(nèi)與FK506結(jié)合蛋白-12(FKBP-12)形成復(fù)合體后被mTOR識別并抑制其活性[9]。其抑制作用也主要針對mTORC1,通過抑制mTOR的非正常激活可抑制腫瘤細(xì)胞的生長、代謝、生存及血管生成等[10]。

放射線可直接或間接作用于DNA,導(dǎo)致DNA損傷,其中DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break, DSBs)是最致命的。研究顯示當(dāng)DSBs產(chǎn)生后,人組蛋白H2A家族成員H2AX蛋白C端Ser殘基可被DNAPK及ATM等PI3K家族成員磷酸化。ROGAKOU等[11]通過研究首次發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象并將磷酸化的H2AX定名為γ-H2AX。隨后的研究發(fā)現(xiàn),電離輻射后細(xì)胞中殘存的γ-H2AX的數(shù)量可代表未被修復(fù)的DNA雙鏈斷裂損傷的數(shù)量。如果損傷不能被及時正確地修復(fù)便可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,暴露后24 h殘存的γ-H2AX的數(shù)量越多則表示此腫瘤細(xì)胞對放療越敏感[12]。因此,筆者在本實驗中選擇γ-H2AX作為檢測DSBs的指標(biāo),測定放療后腫瘤細(xì)胞損傷程度,評估依維莫司對人肺非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549放射增敏作用。

本研究結(jié)果顯示,依維莫司對A549細(xì)胞的IC50為(74.6±1.1)nmol·L-1,提示單用依維莫司具有藥物濃度依賴的抗腫瘤作用,相關(guān)機制可能是由于細(xì)胞周期蛋白(cyclins)尤其是cyclin D的減少抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinases, CDKs)的活化相關(guān)[13]。取IC20作為增敏濃度,研究結(jié)果顯示,在mTOR上游調(diào)控基因PIK3CA野生型的人肺非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中,依維莫司具有明顯的增敏效果(SER=1.36)。相關(guān)機制可能是抑制mTOR后進行照射,阻斷了mTOR依賴途徑的激活,抑制下游細(xì)胞修復(fù)相關(guān)基因的啟動,促進細(xì)胞凋亡,并抑制細(xì)胞增殖,增大了放射線引起的損傷效應(yīng)[14]。這一結(jié)果與KIM等[6]在張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)缺失的非小細(xì)胞肺癌中的研究結(jié)論一致,mTOR抑制劑可抑制同源重組及非同源斷端鏈接兩種DNA損傷主要的修復(fù)方式,從而起到放射增敏作用。進一步的蛋白研究顯示,依維莫司+照射組放療后24 h點,γ-H2AX殘留量較單純照射組明顯增加,證實了前面克隆形成的結(jié)果。CHEN等[15]在使用雷帕霉素抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF7 mTOR通路的研究中,也觀察到了類似現(xiàn)象。推測與抑制mTOR通路后,下調(diào)了染色體完整性相關(guān)的蛋白表達(dá),阻止DNA損傷修復(fù)等機制相關(guān)[16]。

綜上所述,依維莫司抑制mTOR通路聯(lián)合放療可增強非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549對射線的敏感性,說明mTOR通路在肺癌細(xì)胞損傷修復(fù)中具有一定作用。但本研究目前僅限于mTOR上游調(diào)控基因PIK3CA基因野生型的細(xì)胞系中,若PIK3CA基因存在突變, mTOR處于持續(xù)激活狀態(tài),依維莫司是否具有放射增敏作用,仍有待進一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.001

Effect of Everolimus on Radiosensitivity of Human Non-small Cell Lung Cancer Cell Line A549

CHEN Yu,CHU Qian,GUO Juan,HUANG Yu,LIWen-wen,TIAN Yi-jun,XIA Shu,YU Shi-ying
(Department ofOncology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To explore the effect of mammalian target of rapamycin(mTOR)inhibitor everolimus on radiosensitivity of human non-small cell lung cancer cell line in vitro by using everolimus to inhibit mTOR signaling pathway of A549.MethodsHuman non-small cell lung cancer cell line A549 was subjected to radiation alone or in combination with everolimus treatment.The50%inhibition concentration(IC50)of everolimus in A549 cellswas detected bymethylthiazol tetrazolium (MTT)assay in vitro.Everolimus at the 20%inhibition concentration(IC20)was used to pretreat A549 cells for 24 h.Cells were then irradiated by X-ray with 2,4,6,8 Gy.The cell survival fraction was computed by clone formation.Cell survival curvewas fitted bymultitarget one-hit model,and mean lethal dose(D0),dose quasithreshold(Dq),survival fraction at 2 Gy(SF2),and sensitization enhancement ratio(SER)were calculated.The expression ofγ-H2AX was determined byWestern blotting and then the relative gray values were analyzed.ResultsEverolimus significantly improved the sensitivity of A549 cells to radiation.The D0, Dqand SF2of everolimus+irradiation group were significantly lower than those of irradiation group.The SER was1.36.The residual amount ofγ-H2AX protein in the everolimus+irradiation group was significantly higher than that of the irradiation group.ConclusionEverolimus inhibitingmTOR signaling pathway can increase the radiosensitivity of A549 cells.

Everolimus;Cancer,non-small cell lung;Radiosensitization;Signal transduction pathway

R979.1;R734.2

A

1004-0781(2014)12-1541-04

2014-04-15

2014-07-08

*吳階平醫(yī)學(xué)基金資助項目(320.6720. 10010);國家自然科學(xué)基金資助項目(81301929,81372664)

陳豫(1984-),女,湖北武漢人,實習(xí)研究員,碩士,研究方向:腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及腫瘤放射生物學(xué)。電話: 027-83663476,E-mail:veta.chen@163.com。

于世英(1955-),女,四川綿陽人,教授,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,研究方向:腫瘤診斷與綜合治療。電話:027-83663676,E-mail:syyu@tjh.tjmu.edu.cn。