趙花，韋相才。，鐘興明，苗竹林＊，秦衛(wèi)兵

（1．暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510632；2．廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，廣州 510600）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是指連續(xù)發(fā)生3次或3次以上自然流產(chǎn)［1］，其在育齡夫婦中的發(fā)病率約1%～5%。目前仍有50%以上的患者病因不明，稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA），臨床上治療困難。而淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫療法（lymphocyte immunotherapy，LIT）是目前臨床上為URSA患者最常用的治療方法之一，其治療成功率約76%～90%［2－4］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，但仍未完全明確。如何對(duì)LIT效果進(jìn)行評(píng)估國(guó)內(nèi)外尚無定論，目前臨床上主要以封閉抗體（blocking antibody，BA）作為主動(dòng)免疫療效的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，雖然具有一定的指導(dǎo)意義，但BA轉(zhuǎn)陽的患者再次妊娠后仍可發(fā)生流產(chǎn)。能否探尋一些更有價(jià)值的指標(biāo)來評(píng)估治療效果、指導(dǎo)治療，這也是國(guó)內(nèi)外學(xué)者正積極探討的問題之一。本文通過分析URSA患者LIT前后BA及其外周血淋巴細(xì)胞免疫表型的變化，隨訪其妊娠結(jié)局，探討其可能的作用機(jī)制，并為臨床療效評(píng)價(jià)尋找新的參考指標(biāo)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選自2012年2月至2013年8月廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所生殖免疫門診URSA患者，年齡21～38歲，經(jīng)夫婦雙方簽字知情同意書后行主動(dòng)免疫治療。經(jīng)過詳細(xì)的病因篩查，排除解剖、感染、遺傳、生殖內(nèi)分泌及自身免疫異常，所有病例均為BA陰性者，診斷為URSA。所有入選對(duì)象半年內(nèi)均未接受過激素及免疫調(diào)節(jié)治療，治療過程中妊娠者及未完成一療程治療者予以剔除，最終納入25例。

二、研究方法

1．主動(dòng)免疫治療方法：（1）淋巴細(xì)胞來源：URSA患者丈夫需經(jīng)乙肝、丙肝病毒系列檢查以及肝功能、人類免疫缺陷病毒（HIV）、梅毒螺旋體、生化、血脂等篩查，正常者方可供血；異常者重新挑選健康第三方提供血源。（2）治療方法：抽取URSA患者丈夫或健康的無關(guān)第三者空腹血30ml，與等量生理鹽水混合，在無菌條件下常規(guī)分離提取淋巴細(xì)胞，用生理鹽水洗滌3次后，調(diào)整淋巴細(xì)胞混懸液約0．7ml。于患者前臂內(nèi)側(cè)分3點(diǎn)皮內(nèi)注射，每2周治療1次，4次為1個(gè)療程。分別于治療前及1個(gè)療程結(jié)束后2周，用真空肝素鈉抗凝管或乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集外周靜脈血2ml，室溫放置。檢測(cè)患者淋巴細(xì)胞免疫表型，同時(shí)復(fù)查BA。

2．BA檢測(cè)方法：抽取患者外周血2ml，分離血清于－20℃保存?zhèn)溆?。用酶?lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行測(cè)定，按ELISA試劑盒（One lambda，美國(guó)）說明書進(jìn)行操作。

3．實(shí)驗(yàn)試劑及步驟：采用FACS calibur流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，美國(guó)），F(xiàn)ACS lysing solution、Tritest CD4FITC／CD8PE／CD3Per-CP鼠抗人 三 色 熒 光 抗 體、Anti-HLA-DR APC、CD16 FITC、CD56PE、CD3PerCP、CD69APC、CD25 FITC、CD127PE、CD4APC、CD5PerCP-CY5．5、CD19FITC鼠抗人熒光抗體（BD，美國(guó)）。分設(shè)試驗(yàn)管和對(duì)照管，各取50μl外周血，按試劑說明書加入相應(yīng)抗體，混勻，室溫（20～25℃）避光孵育15min。加入450μl 1×FACS lysing solution輕輕混勻，室溫（20～25℃）避光孵育15min，加入2ml PBS，混勻，1 200r／min離心5min，去上清。300μl PBS重懸，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

4．?dāng)?shù)據(jù)獲?。菏褂妹绹?guó)CELLQuest軟件，用前向角散射（forward scatter，F(xiàn)SC）設(shè)閾值，排除碎片干擾；在散點(diǎn)圖SSC／FSC中圈出淋巴細(xì)胞作為分析對(duì)象，然后在散點(diǎn)圖中分析各淋巴細(xì)胞亞群的比例。使用CELLQuest軟件分析結(jié)果。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、BA變化及妊娠結(jié)局

治療前25例患者BA均呈陰性，LIT一療程后21例陽性，陽性率84%。其余4例未轉(zhuǎn)為陽性的患者經(jīng)過繼續(xù)加強(qiáng)治療后均轉(zhuǎn)為陽性。25例患者成功妊娠16例（已正常分娩或妊娠至孕20周后），4例再次流產(chǎn)。

二、治療前后T細(xì)胞及Treg細(xì)胞表型變化

治療后CD3＋T細(xì)胞的比例增加，CD4＋T細(xì)胞的比例明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；治療前后表面活化標(biāo)志HLA-DR在CD3＋、CD8＋T細(xì)胞中的表達(dá)并無顯著性差異，但CD4＋T細(xì)胞活化的比例顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。而CD4＋CD25＋CD127dimTreg細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞比例治療前后并無明顯變化（P＞0．05）（表1，表2）。

三、治療前后B淋巴細(xì)胞表型變化

主動(dòng)免疫治療后外周血CD19＋B細(xì)胞的比例及CD5＋B、CD5－B細(xì)胞在淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞中的比例均無顯著變化（P＞0．05）（表3）。

四、治療前后NK細(xì)胞表型變化

主動(dòng)免疫治療后URSA患者外周血CD3－CD56＋NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例顯著下降（P＜0．01）（表4）。

五、妊娠成功組治療前后淋巴細(xì)胞免疫表型變化

妊娠成功組治療前后CD3－CD56＋NK細(xì)胞、CD3＋T、CD4＋T及CD4＋HLA-DR＋T細(xì)胞比例均有顯著變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）（表5）。

表1 主動(dòng)免疫治療前后外周血T淋巴細(xì)胞表型變化［（±s）%］

表1 主動(dòng)免疫治療前后外周血T淋巴細(xì)胞表型變化［（±s）%］

注：與治療前比較，＊P＜0．05

組 別 例數(shù) CD3＋T CD4＋T CD8＋T CD4＋／CD8＋治療前 25 62．56±9．72 49．21±11．37 34．84±9．81 1．38±0．44治療后 25 68．44±8．61＊ 44．35±12．63＊37．63±12．95 1．17±0．46

表2 主動(dòng)免疫治療前后外周血活化T淋巴細(xì)胞及Treg細(xì)胞變化［（±s）%］

表2 主動(dòng)免疫治療前后外周血活化T淋巴細(xì)胞及Treg細(xì)胞變化［（±s）%］

注：與治療前比較，＊P＜0．05

組 別 例數(shù) CD3＋HLA-DR＋／CD3＋ CD4＋HLA-DR＋／CD4＋ CD8＋HLA-DR＋／CD8＋ CD4＋CD25＋CD127dimTreg治療前 25 25．52±9．87 12．03±5．96 30．00±12．11 6．21±1．78治療后 25 27．32±11．55 16．33±7．01＊29．10±14．61 6．67±1．70

表3 主動(dòng)免疫治療前后B淋巴細(xì)胞表型變化［（±s）%］

表3 主動(dòng)免疫治療前后B淋巴細(xì)胞表型變化［（±s）%］

注：治療前后比較，P均＞0．05

組 別 例數(shù) CD19＋B CD5＋CD19＋B CD5－CD19＋B CD5＋CD19＋／B CD5－CD19＋／B治療前 25 11．13±4．10 3．96±1．86 7．43±2．72 32．85±9．06 66．66±9．17治療后 25 10．81±3．30 3．73±1．65 7．41±2．88 29．66±8．00 70．34±8．00

表4 主動(dòng)免疫治療前后NK細(xì)胞表型變化［（±s）%］

表4 主動(dòng)免疫治療前后NK細(xì)胞表型變化［（±s）%］

注：與治療前比較，＊＊P＜0．01

組 別 例數(shù) CD3－CD56＋NK CD3＋CD56＋NKT CD56dimCD16＋NK CD56bright CD16－NK CD56＋CD69＋NK治療前 25 13．48±3．00 5．20±4．19 87．40±7．72 3．92±2．64 3．83±0．78治療后 25 10．09±2．42＊＊5．17±4．58 89．19±6．46 3．81±1．94 3．67±0．83

表5 主動(dòng)免疫治療前后妊娠成功組淋巴細(xì)胞表型變化［（±s）%］

表5 主動(dòng)免疫治療前后妊娠成功組淋巴細(xì)胞表型變化［（±s）%］

注：與治療前比較，＊＊P＜0．01

組 別 例數(shù) CD3＋T CD4＋T CD4＋HLA-DR＋／CD4＋ CD3－CD56＋NK治療前 16 50．06±8．88 50．86±10．96 10．91±5．79 15．18±2．25治療后 16 68．47±8．59＊＊ 43．13±12．89＊＊ 16．93±5．61＊＊ 10．15±2．63＊＊

討 論

主動(dòng)免疫治療應(yīng)用于臨床多年，國(guó)內(nèi)外對(duì)其療效一直存在爭(zhēng)議［5－6］，尚無明確的療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究通過LIT前后患者外周血T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（natural killer，NK）和Treg細(xì)胞免疫表型的變化進(jìn)行觀察，探討了LIT可能的作用機(jī)制，并為主動(dòng)免疫療效評(píng)價(jià)探尋了新的參考指標(biāo)。

本文25例URSA患者經(jīng)LIT后21例BA轉(zhuǎn)陽，陽性率為84%（21／25），與國(guó)內(nèi)報(bào)道［7－8］結(jié)果相似。楊寧等［9］報(bào)道BA陰性的URSA患者經(jīng)同樣的方法治療1療程后BA陽性率為78．59%（359／444），而妊娠成功率達(dá)85．58%（267／312），較傳統(tǒng)保胎組26．67%（4／15）明顯升高。這說明LIT能誘導(dǎo)大部分患者產(chǎn)生BA，明顯提高妊娠成功率。近年來BA一直被認(rèn)為是LIT療效和成功妊娠的預(yù)測(cè)指標(biāo)。然而臨床上一些BA陽性的患者仍會(huì)發(fā)生流產(chǎn)，如何更加準(zhǔn)確地進(jìn)行療效監(jiān)測(cè)和病情評(píng)估，仍是國(guó)內(nèi)外的研究重點(diǎn)，也是本研究的方向。

T淋巴細(xì)胞作為外周血中最主要的淋巴細(xì)胞，在免疫刺激、免疫調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)中起著重要作用，因此，T細(xì)胞亞群的變化也是免疫治療重要的觀察指標(biāo)之一。在正常妊娠早期，CD8＋T細(xì)胞數(shù)量增多，CD4＋／CD8＋比值的降低，有利于胚胎免遭母體免疫系統(tǒng)的排斥。而URSA患者外周血CD4＋T細(xì)胞比例及CD4＋／CD8＋比值明顯升高，有效治療后則可逆轉(zhuǎn)［10］。國(guó)內(nèi)外的研究均顯示，URSA患者存在外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例異常，而主動(dòng)免疫治療可使T淋巴細(xì)胞亞群比例和功能發(fā)生明顯的有利變化。本研究發(fā)現(xiàn)，LIT后CD3＋T細(xì)胞比例明顯增加（P＜0．05），與國(guó)外研究［11］結(jié)果一致。本研究組前期研究［12］發(fā)現(xiàn)，URSA患者外周血CD4＋T細(xì)胞比例較正常婦女明顯升高，而本研究中妊娠成功組CD4＋T細(xì)胞比例為（43．13±12．89）%，較治療前［（50．86±10．96）%］明顯下降（P＜0．05），可見LIT能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫紊亂，CD4＋T細(xì)胞的降低有利于妊娠。但本研究中CD4＋／CD8＋比率并無明顯變化，由于本研究選取的樣本量有限，可能導(dǎo)致了部分結(jié)果的偏差。此外，URSA患者CD4＋HLADR＋細(xì)胞比例較治療前顯著增加。這亦提示，LIT可能主要通過抗原刺激CD4＋T細(xì)胞發(fā)揮作用，但其具體作用方式則取決于CD4＋T細(xì)胞的分化及其分泌的細(xì)胞因子，所以其對(duì)妊娠的維持是否有利尚無法定論，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

NK細(xì)胞有細(xì)胞毒性效應(yīng)，占外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量的10%～15%，無需抗原預(yù)先致敏就自發(fā)殺傷靶細(xì)胞，還可以通過分泌細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。已有研究表明，NK細(xì)胞毒性和數(shù)量增加與流產(chǎn)有關(guān)［13］，外周血高水平的NK細(xì)胞預(yù)示染色體核型正常的妊娠可能發(fā)生生化妊娠或自然流產(chǎn)，并發(fā)現(xiàn)早孕期NK細(xì)胞活性較未孕時(shí)明顯降低，表明減少NK細(xì)胞的比例和抑制其活性也許能阻止母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒抗原的攻擊，維持妊娠。本研究中16例成功妊娠患者治療前NK細(xì)胞比例為（15．18±2．25）%，治療后明顯降低［（10．15±2．63）%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）?？梢姡琇IT能明顯降低NK細(xì)胞的比例，有利于妊娠。國(guó)外有人建議將CD3＋CD56＋NKT細(xì)胞的數(shù)量作為靜脈注射用免疫球蛋白（IVIG）治療對(duì)象的篩選指標(biāo)，他們發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞升高的患者經(jīng)IVIG治療后其數(shù)量可明顯降低，并且能顯著提高妊娠成功率［14］。本文對(duì)NK細(xì)胞亞群進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，治療前后CD56dim、CD56brightNK亞群在NK細(xì)胞中的比例及NK細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD69、CD3＋CD56＋NKT細(xì)胞的比例并無明顯改變，可能與樣本量有關(guān)。因此，檢測(cè)NK細(xì)胞免疫表型變化有助于URSA婦女病情及預(yù)后的監(jiān)測(cè)，但人類NK細(xì)胞包括許多不同的亞群，很有必要對(duì)不同的亞群進(jìn)行更深入研究分析。

LIT對(duì)B淋巴細(xì)胞有何影響，至今仍未完全明確。有研究表明，LIT前后CD19＋B、CD5＋CD19＋B細(xì)胞比例均無明顯變化［15］，本研究結(jié)果與其一致。但他們發(fā)現(xiàn)URSA患者LIT后妊娠成功組CD19＋B細(xì)胞明顯增加，提示CD19＋B細(xì)胞可能有利于維持妊娠。但其具體作用機(jī)制目前仍不明確，是否有利于某些保護(hù)性抗體的產(chǎn)生仍需進(jìn)一步研究。

Treg細(xì)胞對(duì)免疫耐受具有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，妊娠期間Treg細(xì)胞出現(xiàn)系統(tǒng)擴(kuò)增，有利于維持正常妊娠。業(yè)已證實(shí)，Treg細(xì)胞減少可能與URSA密切相關(guān)，而LIT能上調(diào)CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞的比例。但Treg細(xì)胞缺乏特異的表面標(biāo)志，有研究發(fā)現(xiàn)CD127的低表達(dá)與叉頭蛋白3（FOXP3）的高表達(dá)及 CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞的抑制功能相關(guān)［16］。現(xiàn)已證實(shí)CD4＋CD25bright細(xì)胞才是人體內(nèi)真正具有調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞，所以本文聯(lián)合檢測(cè)了CD25＋和CD127dim的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25例URSA患者和16例成功妊娠患者免疫治療前后CD4＋CD25＋CD127dimTreg細(xì)胞的比例均無明顯變化，可能與個(gè)體免疫反應(yīng)低下有關(guān)，也提示LIT可能并不是通過調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的水平發(fā)揮療效，但仍需增大樣本進(jìn)一步證實(shí)。

本研究表明，LIT后外周血淋巴細(xì)胞免疫表型發(fā)生了明顯的改變，CD3－CD56＋NK 細(xì)胞和CD4＋T細(xì)胞比例的降低、CD3＋T細(xì)胞和活化的CD4＋T細(xì)胞的增加也許有利于維持妊娠，檢查T細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例變化有助于URSA婦女病情和療效的監(jiān)測(cè)，本文對(duì)LIT可能的作用機(jī)制進(jìn)行了深入的探討，也為L(zhǎng)IT療效監(jiān)測(cè)探尋了新的指標(biāo)，但仍需要增大樣本量，對(duì)妊娠失敗患者進(jìn)行更深入的對(duì)比研究。

［1］ 林其德 ．復(fù)發(fā)性流產(chǎn)免疫學(xué)診斷和治療共識(shí)［J］．生殖醫(yī)學(xué)雜志，2008，17：4-5．

［2］ 陸碧玉，嚴(yán)提珍，唐寧 ．免疫治療反復(fù)自然流產(chǎn)效果分析［J］．中外醫(yī)學(xué)研究，2013，35：139．

［3］ 朱玉蓉，魏麗娜，吳曉云，等 ．淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)143例分析［J］．中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2012，12：90-91．

［4］ 張建平 ．復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷和治療［J］．現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2006，15：481-492．

［5］ Nonaka T，Takakuwa K，Ooki I，et al．Results of immunotherapy for patients with unexplained primary recurrent abortions－－prospective non-randomized cohort study［J］．Am J Reprod Immunol，2007，58：530-536．

［6］ Porter TF，LaCoursiere Y，Scott JR．Immunotherapy for recurrent miscarriage［J／CD］．Cochrane Database Syst Rev，2006，19：CD000112．

［7］ 羅曉紅，張金華，李曉園，等 ．反復(fù)自然流產(chǎn)患者免疫治療前后封閉抗體的變化及其意義［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17：1897-1898．

［8］ 丁克文，宋燕，劉娟，等 ．反復(fù)自然流產(chǎn)患者經(jīng)配偶淋巴細(xì)胞免疫治療后外周封閉抗體水平變化［J］．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009，25：157-158．

［9］ 楊寧，秦衛(wèi)兵，王一峰，等 ．復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療效果觀察［J］．中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2013，21：51-53．

［10］ 胡道琴，梁寶珠，陳敏，等 ．復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者主動(dòng)免疫治療前后T淋巴細(xì)胞亞群的變化［J］．中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2013，21：76-77．

［11］ Szpakowski A，Malinowski A，Ciesla KJ，et al．Influence of paternal lymphocyte immunization on the selected subpopulations of peripheral blood lymphocytes in women with recurrent spontaneous abortions of unknown etiology［J］．Ginekol Pol，2003，74：288-296．

［12］ 趙花，韋相才，秦衛(wèi)兵，等 ．原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表型研究［J］．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29：2637-2639．

［13］ Yamada H，Morikawa M，Kato EH，et al．Preconceptional natural killer cell activity and percentages predictors of biochemical pregnancy and spontaneous abortion with normal chromosome karyotype［J］．Am J Reprod Immunol，2003，50：351-354．

［14］ Van den Heuvel MJ，Peralta CG，Hata K，er al．Decline in number of elevated blood CD3＋CD56＋NKT cells in response to intravenous immunoglobulin treatment correlates with successful pregnancy［J］．Am J Reprod Immunol，2007，58：447-459

［15］ Liang P，Mo M，Li GG，et al．Comprehensive analysis of peripheral blood lymphocytes in 76women with recurrent miscarriage before and after lymphocyte immunotherapy［J］．Am J Reprod Immunol，2012，68：164-174．

［16］ Liu WH，Putnam AL，Zhou XY，et al．CD127expression inversely correlates with FoxP3and suppressive function of human CD4＋Treg cells ［J］．J Exp Med，2006，203：1701-1711．