韓萬(wàn)春，李銘鋒，田 兵，華躍進(jìn)，盧振蘭

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，吉林長(zhǎng)春， 130118;2.浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310029;3.山東省東營(yíng)市環(huán)境保護(hù)局，山東東營(yíng) 257000)

耐輻射球菌對(duì)Cu2+的去除效率

韓萬(wàn)春1，李銘鋒2，3，田 兵2，華躍進(jìn)2，盧振蘭1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，吉林長(zhǎng)春， 130118;2.浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310029;3.山東省東營(yíng)市環(huán)境保護(hù)局，山東東營(yíng) 257000)

耐輻射球菌是一種非致病菌，擁有極強(qiáng)的抗輻射、抗氧化特性，具有成為工程菌處理Cu2+的潛力。采用酶標(biāo)儀測(cè)定Cu2+對(duì)耐輻射球菌的生長(zhǎng)速度的影響，用電感耦合等離子光譜法測(cè)定菌液離心后得到的上清液Cu2+濃度。結(jié)果表明，當(dāng)Cu2+初始質(zhì)量濃度為1.36 mg/L時(shí)，耐輻射球菌對(duì)其清除效率為57.3%;當(dāng)Cu2+初始質(zhì)量濃度為6.28mg/L時(shí)，對(duì)其清除效率為35.4%。此外，用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察受到Cu2+脅迫的耐輻射球菌，發(fā)現(xiàn)球菌具有明顯的聚集效應(yīng)。

耐輻射球菌;Cu2+;電感耦合等離子光譜法;去除效率

Cu2+污染存在于電鍍、冶金、化工等行業(yè)已早為人熟知。人體攝入過(guò)量Cu2+會(huì)引起一系列病變，急性Cu2+中毒可引起胃腸道黏膜刺激癥狀，惡心、嘔吐、腹瀉，甚至溶血性貧血、肝功能衰竭、休克、昏迷或死亡，慢性攝入過(guò)高的Cu2+，可引起兒童肝硬化;土壤中過(guò)量的Cu2+可間接污染農(nóng)產(chǎn)品，Cu2+對(duì)水培青菜幼苗生長(zhǎng)影響很大［1］;Cu2+對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響同樣嚴(yán)重，當(dāng)c(Cu2+)=50 μmol/L時(shí)，邊緣細(xì)胞的死細(xì)胞數(shù)量達(dá)758個(gè)(存活率為24.8%)，當(dāng)c(Cu2+)=100 μmol/L 時(shí)，存活率降低了17.54%［2］;Cu2+對(duì)鯽魚(yú)紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血紅蛋白影響較大［3］，它通過(guò)食物鏈威脅人體健康，并造成環(huán)境的二次污染［4］。

目前，人們已經(jīng)提出了眾多去除Cu2+的方法。董靜［5］采用吸附法去除 Cu2+，左鳴等［6］提出用鐵氧體法去除廢水中的Cu2+，劉泊良等［7］采用改性碳納米管對(duì)水中Cu2+的去除作用，朱一民等［8］采用海藻酸鈉吸附Cu2+，滕洪輝等［9］采用納米光催化還原去除水中Cu2+。

耐輻射球菌(Deinococcusradiodurans)是Anderson等人于1956年在用x射線(xiàn)給腐敗的灌裝食品滅菌時(shí)發(fā)現(xiàn)的非致病性紅色球菌［10］，被譽(yù)為地球上最頑強(qiáng)的細(xì)菌之一［11］，該細(xì)菌具有驚人的電離輻射抗性和DNA修復(fù)能力，其輻射耐受劑量是大腸桿菌的幾百倍，是人類(lèi)的幾千倍，具有耐輻射、抗氧化、非致病菌的優(yōu)良特性［12-13］。本研究正是基于耐輻射球菌如此多的優(yōu)良特性的基礎(chǔ)上而展開(kāi)的。GB 25467-2010《銅、鎳、鈷工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，企業(yè)廢水總排放二級(jí)處理后的Cu2+質(zhì)量濃度不超過(guò)2.0 mg/L，如果將耐輻射球菌作為廢水排放中Cu2+二級(jí)處理的工程菌株，可為微生物清除Cu2+污染提供條件［14］，將在環(huán)境修復(fù)方面上具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選用耐輻射球菌作為工程菌、大腸桿菌作為對(duì)照菌株;TGY培養(yǎng)基(TRYPTONE 0.5%、YEAST 0.3%、D-glucose 0.1%，pH=6.4±0.2)用于培養(yǎng)耐輻射球菌;LB(TRYPTONE 0.1%、YEAST 0.5%、NaCL 0.10%，pH=7.5±0.2)用于培養(yǎng)大腸桿菌;用Spectra Max M5測(cè)定OD600值;用PerkinElmer公司生產(chǎn)的 OpticalEmission Spectrometer optima 7300DV測(cè)定Cu2+濃度。

1.2 試驗(yàn)方法

a.樣本前處理時(shí)，將耐輻射球菌劃平板，挑單菌落到5mL TGY培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)，試驗(yàn)在無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行。

b.取1 mL培養(yǎng)好的菌液加入到200 mL的TGY培養(yǎng)基中，為保證初始培養(yǎng)基中菌體濃度相等，菌液培養(yǎng)到OD600=0.57。把搖好的菌分裝到20 cm滅菌試管中，每管5 mL。再分別加入10μL、50 μL Cu2+(c(Cu2+)=10mmol/L)到試管中，每樣品做3次重復(fù)，利用酶標(biāo)儀測(cè)定不同時(shí)間下的OD600的值。

c.用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察Cu2+處理后的耐輻射球菌的細(xì)胞聚集情況［15］。

d.利用電感耦合等離子光譜法(ICP-OES)測(cè)定培養(yǎng)基中Cu2+濃度，以計(jì)算耐輻射球菌對(duì)Cu2+的去除效率［16］。

初始樣測(cè)定:①將10 μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5 mL的TGY培養(yǎng)基中，ICP-OES檢測(cè)出Cu2+質(zhì)量濃度為1.36 mg/mL。②將50 μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5mL的TGY培養(yǎng)基中，ICP-OES檢測(cè)出Cu2+質(zhì)量濃度為6.28 mg/mL。

處理樣測(cè)定:① 將10 μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5 mL的TGY培養(yǎng)基中，加入2 μL耐輻射球菌，生長(zhǎng)到衰亡期，經(jīng)處理后，ICP-OES檢測(cè)出Cu2+質(zhì)量濃度為0.58mg/mL。②將50μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5 mL的TGY培養(yǎng)基中，加入2 μL耐輻射球菌，生長(zhǎng)到衰亡期，經(jīng)處理后，ICP-OES檢測(cè)出Cu2+質(zhì)量濃度為4.06mg/mL。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

分析初始樣與處理樣Cu2+濃度之間的關(guān)系，并計(jì)算出耐輻射球菌對(duì)Cu2+的去除效率。用origin 75軟件繪制出不同Cu2+濃度對(duì)耐輻射球菌生長(zhǎng)影響的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2.1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

向試管中加入Cu2+在一定程度上會(huì)影響耐輻射球菌的生長(zhǎng)。為此利用酶標(biāo)儀測(cè)定Cu2+脅迫下的耐輻射球菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)，以了解耐輻射球菌的生長(zhǎng)狀況，如圖1所示。

圖1 Cu2+對(duì)耐輻射球菌生長(zhǎng)的影響

耐輻射球菌初始透光度(OD600)為0.57時(shí)，加入不同濃度的Cu2+30℃培養(yǎng)。由空白樣本與Cu2+作用生長(zhǎng)曲線(xiàn)可以看出，Cu2+用量對(duì)耐輻射球菌的生長(zhǎng)影響小。重復(fù)多次試驗(yàn)后用平板計(jì)數(shù)方法統(tǒng)計(jì)出，當(dāng)OD600值為1.0時(shí)，1 mL菌液中耐輻射球菌的個(gè)數(shù)為108個(gè)。

為了說(shuō)明Cu2+濃度對(duì)其他菌體的影響，測(cè)定Cu2+濃度對(duì)模式生物大腸桿菌的生長(zhǎng)影響:當(dāng)大腸桿菌在37℃LB培養(yǎng)基中，其OD600為0.24時(shí)，不同濃度的Cu2+對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)影響如圖2所示。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在大腸桿菌的生長(zhǎng)過(guò)程中，Cu2+濃度對(duì)其生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。換言之，大腸桿菌對(duì)Cu2+濃度不敏感。但GB3838-2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中明確提出了對(duì)糞大腸桿菌群的規(guī)定，因?yàn)槠溆幸欢ǖ闹虏⌒裕圆荒茏鳛槲鬯幚淼墓こ叹?/p>

圖2 Cu2+對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)影響

2.2 耐輻射球菌的聚集效應(yīng)

在Cu2+的作用下，耐輻射球菌出現(xiàn)了聚集現(xiàn)象(圖3)。

圖3 耐輻射球菌聚集現(xiàn)象

由于Cu2+的脅迫，耐輻射球菌出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。這可能是因?yàn)槟洼椛淝蚓嬖谌后w感應(yīng)機(jī)制，以抵抗外來(lái)的脅迫。有文獻(xiàn)表明，這可能與某種金屬離子通道有關(guān)［4］。

2.3 不同濃度Cu2+作用下的菌體質(zhì)量變化

試驗(yàn)結(jié)果表明，耐輻射球菌對(duì)Cu2+有很強(qiáng)的耐受能力。按照表1數(shù)據(jù)向200 mL TGY培養(yǎng)基中加入各種濃度的Cu2+，培養(yǎng)48 h，精確量取100 mL菌液，離心30 min后(10000 r/min)收集菌體，把收集到的菌體用真空冷凍干燥儀干燥，稱(chēng)取質(zhì)量。

表1 不同濃度Cu2+加入后得到的菌體干質(zhì)量

隨著Cu2+質(zhì)量濃度的不斷增加，耐輻射球菌的菌體干質(zhì)量不斷減少。Cu2+質(zhì)量濃度低時(shí)，對(duì)耐輻射球菌的生長(zhǎng)影響不大，但Cu2+質(zhì)量濃度達(dá)到5.12 mg/L 時(shí)，即1600 μL Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)加入時(shí)，耐輻射球菌菌量開(kāi)始快速下降。用SPSS18.0軟件進(jìn)行顯著性分析，P值為9.06×10-7，遠(yuǎn)小于0.5，效果顯著。

2.4 耐輻射球菌對(duì)Cu2+的去除效率

計(jì)算耐輻射球菌對(duì)Cu2+的去除率:

式中:ρ0為Cu2+初始質(zhì)量濃度，mg/L;ρ為加入耐輻射球菌后的Cu2+質(zhì)量濃度，mg/L。

當(dāng)10μL Cu2+(c(Cu2+)=10mmol/L)加入培養(yǎng)基中時(shí)，Cu2+質(zhì)量濃度為1.36mg/L，加入700μL耐輻射球菌處理后，經(jīng)ICP-OES測(cè)得Cu2+質(zhì)量濃度為0.58 mg/L，則去除率r1=(1-0.58/1.36)×100%=57.3%。

當(dāng)50μL Cu2+(c(Cu2+)=10mmol/L)加入培養(yǎng)基中時(shí)，Cu2+質(zhì)量濃度為6.28mg/L，加入700μL耐輻射球菌處理后，經(jīng)ICP-OES測(cè)得Cu2+質(zhì)量濃度為4.06 mg/L，則去除率r2=(1-4.06/6.28)×100%=35.4%。

由去除率可知，Cu2+的初始濃度越高，耐輻射球菌對(duì)Cu2+去除效率越低。

3 結(jié)語(yǔ)

采用酶標(biāo)儀及ICP-OES等方法測(cè)定耐輻射球菌在Cu2+脅迫下生長(zhǎng)曲線(xiàn)變化狀況及耐輻射球菌對(duì)Cu2+去除效率的研究。結(jié)果表明，耐輻射球菌對(duì)Cu2+具有很強(qiáng)的耐受能力;在Cu2+作用下耐輻射球菌有聚集現(xiàn)象;當(dāng)Cu2+初始質(zhì)量濃度為1.36 mg/L時(shí)，耐輻射球菌對(duì)Cu2+的去除率為57.3%;Cu2+初始質(zhì)量濃度為6.28 mg/L時(shí)，耐輻射球菌對(duì)Cu2+的去除率為35.4%;耐輻射球菌具有作為企業(yè)二級(jí)處理時(shí)的工程菌的能力。企業(yè)可將耐輻射球菌作為處理含Cu2+廢水的工程菌，使處理后的水質(zhì)達(dá)到GB25467-2010《銅、鎳、鈷工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》的要求。今后，將用分子生物學(xué)手段進(jìn)一步對(duì)Cu2+作用下耐輻射球菌的聚集現(xiàn)象進(jìn)行研究，從而揭示其產(chǎn)生機(jī)理。

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Removal efficiency of Cu2+by Deinococcus radiodurans

HAN Wanchun1，LI Mingfeng2，3，TIAN Bing2，HUA Yuejin2，LU Zhenlan1
(1.College of Resources and Environment，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China;2.Institute of Nuclear Agricultural Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China;3.Dongying Environmental Protection Agency of Shandong Province，Dongying 257000，China)

As a non-pathogenic bacteria，Deinococcus radiodurans is extremely resistant to ionizing radiation and oxidative stress and shows great potential in remediation of Cu2+pollution.In this study，we used the ELIASA plate reader and the ICP-OES，respectively，to monitor the growth rate of Deinococcus radiodurans and the Cu2+concentration in the supernatant after the bacterial solution was centrifuged.The results show that the removal efficiency of Cu2+by Deinococcus radiodurans reached 57.3%when the initial concentration of Cu2+was 1.36mg/L，and the removal efficiency dropped to 35.4%when the initial concentration of Cu2+increased to 6.28 mg/L.Meanwhile，using confocal laser scanning microscopy(CLSM)，we observed that Deinococcus radiodurans assembled at a high concentration of Cu2+.

Deinococcus radiodurans;Cu2+;ICP-OES;removal efficiency

X703.1

A

1004-6933(2014)01-0064-04

10.3969/j.issn.1004-6933.2014.01.013

國(guó)家自然科學(xué)基金(30830006，31170079)

韓萬(wàn)春(1988—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境管理與規(guī)劃。E-mail:hs19880208@163.com

盧振蘭，教授。E-mail:zhenlan0431@163.com

(收稿日期:2013-06-21 編輯:高渭文)