郭蔚華,錢建偉,吳玉龍,楊誠(chéng)

重慶大學(xué)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400045

急性毒性藻紅外測(cè)試中聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法是新技術(shù)急性毒性藻紅外測(cè)法的核心技術(shù)[1],該技術(shù)的穩(wěn)定性將影響其應(yīng)用前景,在應(yīng)用之前必須認(rèn)識(shí)其穩(wěn)定性,而測(cè)試其重現(xiàn)性就是評(píng)價(jià)該技術(shù)穩(wěn)定性的重要依據(jù),因此開(kāi)展急性毒性藻紅外測(cè)試聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法的重現(xiàn)性研究非常必要。目前,國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了急性毒性藻紅外測(cè)試中敏感藻的確定方法[2]、藻紅外輻射測(cè)試環(huán)境重金屬急性毒性[3]、藻紅外輻射測(cè)試環(huán)境農(nóng)藥殘留急性毒性[4]、藻紅外輻射測(cè)試環(huán)境有機(jī)毒害物急性毒性[5]、急性毒性藻紅外測(cè)試中聯(lián)合作用的評(píng)價(jià)方法[1]、藻紅外測(cè)試多元有機(jī)毒物急性毒性的初步分析[6]等研究,有關(guān)藻紅外測(cè)試聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法的重現(xiàn)性研究尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道。為此,開(kāi)展了藻紅外測(cè)試聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法的重現(xiàn)性研究實(shí)驗(yàn)。

本文通過(guò)測(cè)試敏感藻(月牙藻[2])對(duì)5種有機(jī)藥品不同組合的響應(yīng)溫差,用聯(lián)合偏差系數(shù)法[1]分析聯(lián)合作用類型的重現(xiàn)性,評(píng)價(jià)藻紅外測(cè)試聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試藻:羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)[2]作為測(cè)試用的敏感藻,由中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所提供。

供試藥品:苯(C6H6)、甲苯(C7H8)、二甲苯(C8H10)、氯苯(C6H5Cl)、三氯甲烷(CHCl3),均為國(guó)產(chǎn)分析純藥品。

儀器設(shè)備:紅外線測(cè)溫儀,型號(hào)ST60,靈敏度0.1℃;LRH-250A生化培養(yǎng)箱;MOTIC BA200數(shù)碼顯微鏡;80-2臺(tái)式電動(dòng)離心機(jī);DR/5000U分光光度計(jì)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

測(cè)試原理:微型藻類具有光合磷酸化和氧化磷酸化的能量代謝系統(tǒng),對(duì)毒害物質(zhì)急性毒性響應(yīng)的能量變化強(qiáng)于非光合微生物,微量毒物滴入藻液引起的藻能量變化可被紅外測(cè)溫儀測(cè)試。

重現(xiàn)性:用相同方法,同一試驗(yàn)材料,在不同的條件下獲得的單個(gè)結(jié)果之間的一致程度。不同的條件指不同操作者,不同設(shè)備,不同實(shí)驗(yàn)室,不同或相同的時(shí)間[7]。

測(cè)試藻量標(biāo)準(zhǔn)及用量:葉綠素a作為測(cè)試藻量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期供試藻液葉綠素a≥4.0 mg·L-1,此時(shí)藻液用于測(cè)試[8],供試藻液5 mL。

測(cè)試環(huán)境:室內(nèi),自然光照,20～28℃。

測(cè)試容器:直徑4 cm、高3 cm、厚0.2 cm的透明絕熱塑杯。

測(cè)試用藻液量:當(dāng)羊角月牙藻液處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,且葉綠素a≥4.0 mg·L-1時(shí),取藻液5 mL用于測(cè)試。

實(shí)驗(yàn)組設(shè)計(jì):設(shè)加藥組和對(duì)照組,各組3個(gè)重復(fù),加藥組所加藥品分別為5種有機(jī)試劑按二元、三元、四元、五元等量混合的26個(gè)組合,各組合總藥品量10 g·L-1。

藥液配制:各加藥組藥液的單藥量以總藥品量除以元數(shù)計(jì)算得出:二元為5.0 g·L-1,三元為3.3 g·L-1,四元為 2.5 g·L-1,五元為 2.0 g·L-1。

測(cè)試方法:取培養(yǎng)好的藻液按每個(gè)容器5 mL,分別加入加藥組和對(duì)照組的測(cè)試容器中,待藻液溫度穩(wěn)定后用紅外測(cè)溫儀對(duì)準(zhǔn)藻液面中部測(cè)溫記錄,然后加藥組、對(duì)照組分別滴加配制藥液、蒸餾水各0.05 mL,立即對(duì)各藻液測(cè)溫記錄,每1.5 min測(cè)一次,連測(cè)8次,至10.5 min結(jié)束測(cè)溫,取最大響應(yīng)溫差進(jìn)行分析。

溫差分析:根據(jù)每組測(cè)試溫度,先計(jì)算出加藥組和對(duì)照組的平均測(cè)試溫度,再計(jì)算其最大響應(yīng)溫差(試驗(yàn)藻對(duì)毒物的響應(yīng)溫差)。

式中:Tp—加藥組加藥后測(cè)試的平均溫度,Tp0—加藥組加藥前測(cè)試的平均溫度,Tw—對(duì)照組加空白水后測(cè)試的平均溫度,Tw0—對(duì)照組加空白水前測(cè)試的平均溫度。

聯(lián)合作用分析:用聯(lián)合偏差系數(shù)法評(píng)價(jià)聯(lián)合作用類型[5],即:

式中:θ—混合毒物引起敏感藻響應(yīng)溫差的聯(lián)合作用系數(shù);T—混合毒物引起敏感藻產(chǎn)生的絕對(duì)平均溫差;TA、TB、TC…—混合毒物中單一毒物引起敏感藻產(chǎn)生的絕對(duì)平均最大溫差。

(θi—聯(lián)合偏差系數(shù);f—總均偏差系數(shù),f=0.06;TФ—毒性效應(yīng)最強(qiáng)藥品產(chǎn)生的溫差;Tβ—聯(lián)合作用溫差;Tλ—相加作用的溫差;f·Tλ—偏差溫差)

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 重現(xiàn)性閾值

將溫差偏差實(shí)驗(yàn)測(cè)試分析結(jié)果整理成表1[5],相加作用在1±f內(nèi)的重現(xiàn)性為67%,以該數(shù)值作為藻紅外聯(lián)合作用重現(xiàn)性評(píng)價(jià)的閾值(Q)。

表1 溫差偏差實(shí)驗(yàn)測(cè)試分析結(jié)果［5］Table 1 Experiments of temperature difference test and analysis

實(shí)驗(yàn)用苯(C6H6)、甲苯(C6H8)、二甲苯(C8H10)、氯苯(C6H5Cl)、三氯甲烷(CHCl3)和羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)進(jìn)行重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn),以藻紅外聯(lián)合聯(lián)合偏差系數(shù)法評(píng)價(jià)5種有機(jī)物對(duì)于羊角月牙藻的聯(lián)合作用類型,并分析其重現(xiàn)性,重現(xiàn)性≥Q,穩(wěn)定性好,重現(xiàn)性＜Q,穩(wěn)定性差。分析結(jié)果整理為表2。

2.2 不同組合的平均重現(xiàn)性

二元組合的重現(xiàn)性:5種藥品10個(gè)二元組合中,平均重現(xiàn)性為62.5%,小于閾值Q,表明二元聯(lián)合作用的重現(xiàn)性差。其中,2-2、2-4、2-5、2-6、2-7 組合的重現(xiàn)性較好,2-1、2-3、2-8、2-9、2-10 組合的重現(xiàn)性差,較好與差各占50%。

三元組合的重現(xiàn)性:5種藥品10個(gè)三元組合中,平均重現(xiàn)性為75%,大于Q,表明三元聯(lián)合作用的重現(xiàn)性較好。其中,3-10組合的重現(xiàn)性差,3-6組合的重現(xiàn)性很好,其余組合的重現(xiàn)性較好,差、很好、較好的比例為10%、10%、80%。

四元的重現(xiàn)性:5種藥品5個(gè)四元組合中,平均重現(xiàn)性為85%,大于Q,表明四元聯(lián)合作用的重現(xiàn)性好。其中,4-3組合的重現(xiàn)性差,4-1組合的重現(xiàn)性較好,4-2、4-4、4-5組合的重現(xiàn)性很好,差、較好、很好的比例為20%、20%、60%。

五元的重現(xiàn)性:5種藥品1個(gè)五元組合中,重現(xiàn)性為100%,大于Q,表明五元聯(lián)合作用的重現(xiàn)性很好。

表2 5種有機(jī)毒物對(duì)羊角月牙藻的聯(lián)合作用Table 2 Toxicity effects of five organic matters to Selenastrum capricornutum

上述分析中,重現(xiàn)性大于閾值的組合有19個(gè),占26組合的73.1%。

2.3 聯(lián)合作用的重現(xiàn)性變化

二元的重現(xiàn)性變化:由圖1可知,拮抗的重現(xiàn)性在50% ～75%之間。其中,2-2、2-4、2-5、2-6、2-7 的拮抗重現(xiàn)性為75%,較好,其獨(dú)立、相加的重現(xiàn)性為25%,較差;2-10拮抗的重現(xiàn)性是50%,其獨(dú)立、協(xié)同的重現(xiàn)性各為25%;2-1、2-3、2-8、2-9、2-10 的拮抗或獨(dú)立或相加的重現(xiàn)性各為為50%。

三元的重現(xiàn)性變化:由圖2可知,拮抗的重現(xiàn)性50% ～100%之間,獨(dú)立的重現(xiàn)性在0% ～50%之間。其中,3-10拮抗的重現(xiàn)性50%,3-6拮抗的重現(xiàn)性100%,其余8組合拮抗的重現(xiàn)性為75%。

四元的重現(xiàn)性變化:由圖3可知,拮抗的重現(xiàn)性在50%～100%之間,獨(dú)立的重現(xiàn)性在0% ～50%之間。其中,拮抗的重現(xiàn)性4-3為50%,4-1為75%,4-2、4-4、4-5 為100%。

五元藥品的重現(xiàn)性變化:拮抗的重現(xiàn)性為100%。

上述分析可知,①二元組合中,盡管拮抗的重現(xiàn)性較好,但聯(lián)合作用類型多樣,②三元、四元、五元組合中,盡管拮抗的重現(xiàn)性較好,但聯(lián)合作用類型減少。聯(lián)合作用類型多樣化與混合藥品的元數(shù)高低成反相關(guān)的情況,尚待進(jìn)一步分析。

2.4 藥品組合元數(shù)增減的重現(xiàn)性變化

根據(jù)表2所作圖4可知,聯(lián)合偏差系數(shù)法評(píng)價(jià)平均重現(xiàn)性分別是,二元62.5% ＜三元75% ＜四元85%＜五元100%,表明藥品組合元數(shù)的增減與聯(lián)合作用的平均重現(xiàn)性正相關(guān)。

2.5 聯(lián)合作用類型數(shù)的變化

5種藥品的26個(gè)組合中,除了2-10出現(xiàn)3種聯(lián)合作用類型(表2),其余每種組合4次測(cè)試出現(xiàn)兩種聯(lián)合作用類型,聯(lián)合作用的4種類型未在同一組合同時(shí)出現(xiàn),聯(lián)合作用3種類型只在1個(gè)組合(2-10)中同時(shí)出現(xiàn),表明聯(lián)合作用類型的重現(xiàn)性是相對(duì)的。

從以上結(jié)果分析可以得到:

(1)在實(shí)驗(yàn)藥液濃度測(cè)試中,重現(xiàn)性大于閾值的組合19個(gè),占26組合的73.1%,聯(lián)合作用的重現(xiàn)性較好,總平均藻紅外聯(lián)合作用評(píng)價(jià)法用于有毒有害物聯(lián)合作用分析具有較好的穩(wěn)定性。

(2)藥品組合元數(shù)高低與聯(lián)合作用的重現(xiàn)性正相關(guān),即藥品組合元數(shù)增加,聯(lián)合作用的重現(xiàn)性增加,而與聯(lián)合作用類型多樣化反相關(guān),其原因有待進(jìn)一步研究。

(3)聯(lián)合作用多種類型可在同組合的不同測(cè)試中出現(xiàn),表明較好聯(lián)合作用類型的重現(xiàn)性(總平均重現(xiàn)性73.1%)是相對(duì)的,急性毒性藻紅外測(cè)試中聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性也是相對(duì)的。

圖1 二元組合重現(xiàn)性Fig.1 Reproducibility in combinations of two drugs

圖2 三元組合重現(xiàn)性Fig.2 Reproducibility of the combinations of four drugs

圖3 四元組合重現(xiàn)性Fig.3 Reproducibility of the combinations of four drugs

圖4 各元組合的平均重現(xiàn)性Fig.4 Average reproducibility of the combinations

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