朋玲龍,楊永堅(jiān),王先良,王菲菲,呂占祿,錢巖,滿江紅

1.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生系,安徽230032

2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100012

環(huán)境污染物不僅可以通過損傷人體的遺傳物質(zhì)導(dǎo)致基因序列改變或染色體畸形,影響重要功能性蛋白的表達(dá)進(jìn)而產(chǎn)生各種健康損傷效應(yīng),還可以通過改變受體重要基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平來調(diào)節(jié)功能性蛋白的表達(dá),進(jìn)而產(chǎn)生腫瘤等各種不良效應(yīng),也就是說污染物可以通過下調(diào)/上調(diào)基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平影響關(guān)鍵基因表達(dá)進(jìn)而產(chǎn)生人體健康損害[1-3]。當(dāng)一種化合物可以導(dǎo)致人類受體DNA中基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平等化學(xué)修飾改變,但不伴有基因突變等其他遺傳物質(zhì)損傷時(shí),就可以被認(rèn)為是一種表觀遺傳毒物[4]。研究發(fā)現(xiàn),環(huán)境中存在這樣一大類化學(xué)物質(zhì),目前被認(rèn)為是無毒或無害的,卻通過調(diào)節(jié)DNA甲基化水平對(duì)人類產(chǎn)生潛移默化的深遠(yuǎn)影響[5],因此,評(píng)估化學(xué)污染物去甲基化能力是化學(xué)品安全性評(píng)價(jià)的新問題,有專家已經(jīng)開始認(rèn)識(shí)到定量檢測(cè)去甲基化表觀遺傳毒性重要性[6-7],但目前為止還沒有形成比較成熟的方法。

DNA甲基化通過調(diào)控基因表達(dá)在污染物毒性損害過程中扮演重要角色。不管是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還是體外實(shí)驗(yàn),了解化學(xué)物對(duì)于人類甲基化水平的作用,可以為評(píng)估化學(xué)物潛在毒性提供更全面的評(píng)價(jià)信息。近幾年研究顯示,暴露于重金屬等可引起DNA甲基化的改變,如長(zhǎng)期低濃度砷暴露所致健康損害與其導(dǎo)致受體遺傳物質(zhì)DNA去甲基化等表觀遺傳機(jī)制有密切聯(lián)系[8]。另外鎳、鉻的毒性也與表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)[9]。而環(huán)境樣品如地表水、地下水以及土壤等都含有這類物質(zhì),那么我們考慮環(huán)境樣品是否也具有去甲基化表觀遺傳毒性,因此選取淮河流域局部癌癥發(fā)病關(guān)注地區(qū)采集的地表水、地下水、土壤和底泥樣品為代表性環(huán)境樣品,以其中的2個(gè)地表水、3個(gè)地下水、2個(gè)土壤、2個(gè)底泥樣品重金屬提取液為測(cè)試樣,通過EGFP方法[10]檢測(cè)其去甲基化表觀遺傳毒性,評(píng)價(jià)結(jié)果以去甲基化藥物5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)的濃度當(dāng)量表示,5-Aza-CdR是醫(yī)學(xué)上明確的具有較強(qiáng)去甲基化能力的藥物[11]。該方法是基于EGFP報(bào)告基因的分子生物學(xué)構(gòu)建,采用高甲基化的EGFP報(bào)告基因受試細(xì)胞重組載體,以此為基礎(chǔ)采用評(píng)價(jià)去甲基化能力的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)新方法,是對(duì)污染物表觀遺傳毒性評(píng)價(jià)技術(shù)的新探索。同時(shí)通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP/MS)[12]對(duì)提取液的成分進(jìn)行掃描檢測(cè)分析,探索影響樣品綜合去甲基化能力的主要組成成分。環(huán)境樣品中具有去甲基化能力的物質(zhì)很多,前期研究顯示采集樣品地區(qū)存在一定程度的重金屬污染,如Cd、Mn,故這次在探索影響樣品綜合去甲基化能力的主要組成成分時(shí)只針對(duì)重金屬成分。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

主要儀器:STD型冷凍干燥機(jī)(FTS公司,美國(guó));FED115型電子烘箱(Binder公司,德國(guó));漩渦振蕩器(賽唯斯科技公司,中國(guó));Agilent 7500c型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(安捷倫公司,美國(guó));水平電泳儀(Biometra,德國(guó));凝膠成像系統(tǒng)(Vilberlo urmat,法國(guó));PCR儀(Biometra,德國(guó));高速離心機(jī)(Sigma 3K30,Sigma,美國(guó));流式細(xì)胞儀(Bechman Coμlter Altra,美國(guó));CO2培養(yǎng)箱(Thermo,美國(guó))。

主要試劑:HNO3優(yōu)級(jí)純;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、pEGFP-C3質(zhì)粒由北京工業(yè)大學(xué)楊怡姝教授饋贈(zèng);HepG-2細(xì)胞由協(xié)和細(xì)胞庫提供;Plasid maxi kit試劑盒(QIAGEN,美國(guó));DNA Fragment Purification KitVer.2.0(TaKaRa,中國(guó));CpG甲基化酶(M.SssⅠ),核酸內(nèi)切酶 HpaⅡ,EcoRⅠ,ApaLⅠ,MspⅠ(New England Biolabs公司,美國(guó));T4 DNA ligase(New England Biolabs,美國(guó));RNeasy Mini Kit試劑盒(QIAGEN,美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 環(huán)境樣品的預(yù)處理

地表水、地下水、土壤、底泥等環(huán)境樣品均按照標(biāo)準(zhǔn)操作采樣,4℃運(yùn)輸和保存。具體點(diǎn)位信息見表1。

水體樣品的前處理方法:取1 mL的水樣,濾膜過濾后直接烘干,再加純水1 mL定容,以該溶液為測(cè)試樣分別進(jìn)行去甲基化毒性測(cè)試和ICP/MS檢測(cè);土壤和底泥樣品前處理方法:將土壤和底泥自然風(fēng)干,后研磨成細(xì)粉。取1 g的土壤和底泥細(xì)粉分別加入10 mL的10%稀硝酸溶液,漩渦振蕩器混勻3 min,過濾收集濾液,烘干后加入純水1 mL定容,以該溶液為測(cè)試樣分別進(jìn)行去甲基化毒性測(cè)試和ICP/MS檢測(cè)。

1.2.2 環(huán)境樣品去甲基化表觀遺傳毒性檢測(cè)

環(huán)境樣品表觀遺傳毒性檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[10]采用EGFP方法,該方法主要研究化學(xué)物去甲基化能力方面的綜合表觀遺傳毒性,基本原理為將pEGFP-C3質(zhì)粒通過人工甲基化處理獲得熒光蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)處于高甲基化狀態(tài)的C3質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)染進(jìn)人類HepG-2肝癌細(xì)胞株,隨后以該改造細(xì)胞株(EGFPHepG2)為主要工具載體,與受試化學(xué)物進(jìn)行共培養(yǎng),依據(jù)細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度來定量評(píng)價(jià)化學(xué)物的去甲基化功能的強(qiáng)弱。

其主要步驟如下:

(1)C3質(zhì)粒大量制備與甲基化處理

依據(jù)常規(guī)方法擴(kuò)增環(huán)狀C3質(zhì)粒,借助核酸內(nèi)切酶ApaL I和EcoR I雙酶切將C3質(zhì)粒切割為長(zhǎng)片段L和短片段S,其中短片段S中含有GFP蛋白基因的啟動(dòng)子序列,利用甲基化酶MSss.Ⅰ對(duì)短片段S進(jìn)行人工甲基化處理[13]。反應(yīng)體系為:10×NE緩沖液2,4 μL;100 × SAM,4 μL;DNA(1.7 μmol·L-1),8 μL;M.SssⅠ,6 μL;ddH2O,18 μL;總量 40 μL;混勻,37 ℃,3 h 溫育。產(chǎn)物 DNA 濃度為 0.36 μmol·L-1。65℃,20 min 滅活M.SssⅠCpG甲基化酶,分裝冷藏保存。利用T4DNA連接酶把成功甲基化的C3質(zhì)粒短片段S和長(zhǎng)片段L重新連接成環(huán),利用DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0對(duì)重組C3質(zhì)粒進(jìn)行純化備用。

(2)甲基化C3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞

快速將所凍存HepG-2細(xì)胞40℃水浴搖床60 r·min-1慢搖至其溶解,溶解后馬上轉(zhuǎn)入37℃水浴箱,手工慢搖恒溫2～3 min復(fù)蘇。復(fù)蘇后800 r·min-1離心5 min,吸去上清加入10 mL含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基,混勻后加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔0.5 mL,5%CO2溫箱37℃培養(yǎng)。在豐度達(dá)到95% ～100%時(shí)在4個(gè)24孔板上進(jìn)行細(xì)胞傳代,24 h后細(xì)胞貼壁,依據(jù)說明書加入Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑和甲基化C3質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染[14]。

(3)改造細(xì)胞株(EGFPHepG2)與受試物進(jìn)行共培養(yǎng)

轉(zhuǎn)染6 h后,開始進(jìn)行受試物染毒,受試物即在淮河流域局部癌癥發(fā)病關(guān)注地區(qū)采集的2個(gè)地表水、3個(gè)地下水、2個(gè)土壤、2個(gè)底泥樣品重金屬提取液。并以5-Aza-CdR為陽性受試物進(jìn)行細(xì)胞梯度劑量共培養(yǎng)染毒處理,通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的梯度濃度為0、0.00016、0.0008、0.004、0.02 μmol·L-1,每個(gè)梯度設(shè)3 個(gè)平行孔,每孔依次加入相應(yīng)梯度的應(yīng)用液,以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在染毒過程中為減小5-AZA應(yīng)用液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)影響,配制的5-AZA 應(yīng)用液的濃度分別為0.008、0.04、0.2、1 μmol·L-1,其培養(yǎng)的終體積為1 mL,故每孔只需加相應(yīng)濃度的5-AZA應(yīng)用液20 μL。

表1 環(huán)境樣品具體點(diǎn)位信息Table 1 Information of the specific point of environmental samples

(4)共培養(yǎng)細(xì)胞綠色熒光檢測(cè)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)24 h后細(xì)胞可以穩(wěn)定地發(fā)出較強(qiáng)的熒光,故對(duì)處理后的24孔板進(jìn)行攝片,每孔隨機(jī)取10個(gè)視野,拍攝10張熒光照片,攝片于半小時(shí)內(nèi)完成。

(5)流式細(xì)胞儀熒光檢測(cè)

拍攝完成后收集24孔板內(nèi)細(xì)胞,加入200 μL消化液消化1 min,加入0.5 mL PBS吹打均勻,吸取到離心管中離心1 200 r·min-14 min,小心去上清液。1 mL PBS重懸細(xì)胞沉淀,輕輕吹打均勻,過300目濾網(wǎng)到流式專用管中,放入流式細(xì)胞儀測(cè)量檢測(cè),獲取其熒光強(qiáng)度。

(6)樣品重金屬提取液去甲基化毒性評(píng)價(jià)

基于每個(gè)受試樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)后流式細(xì)胞儀檢測(cè)數(shù)據(jù),依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)受試樣品的去甲基化表觀遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià),每個(gè)受試樣品取5個(gè)同步平行樣,評(píng)價(jià)結(jié)果以5-Aza-CdR的濃度當(dāng)量表示。

1.2.3 基于5-Aza-CdR染毒標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

對(duì)梯度終濃度為 0、0.00016、0.0008、0.004、0.02 μmol·L-1的5-Aza-CdR溶液對(duì)受試細(xì)胞體系進(jìn)行了染毒處理,依據(jù)上述方案進(jìn)行了流式熒光檢測(cè),每個(gè)濃度梯度設(shè)置4個(gè)平行測(cè)試樣,同時(shí)設(shè)置了2個(gè)完全無甲基化的 C3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞孔。以5-Aza-CdR溶液濃度為自變量,以熒光陽性細(xì)胞百分比為因變量進(jìn)行擬合,得出甲基化能力測(cè)試曲線方程為y=0.136Ln(x)+7.691,其曲線擬合情況見圖1。

1.2.4 環(huán)境樣品重金屬提取液成分檢測(cè)

重金屬提取液成分檢測(cè)參照文獻(xiàn)[12]采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP/MS)進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS for windows 10.0進(jìn)行均數(shù)檢驗(yàn)、相關(guān)分析等統(tǒng)計(jì)處理,細(xì)胞熒光圖片處理采用Image-Pro Plus圖像分析處理軟件,曲線擬合采用Excel軟件。

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同樣品測(cè)試組細(xì)胞熒光

通過熒光顯微鏡對(duì)染毒細(xì)胞進(jìn)行攝片,發(fā)現(xiàn)不同樣品組之間細(xì)胞存在明顯的熒光差異,代表性熒光圖如圖2所示;流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)顯示不同樣品的熒光強(qiáng)度也不同,代表性的綠色熒光流式細(xì)胞檢測(cè)效果如圖2所示。

圖1 5-Aza-CdR染毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 5-Aza-CdR exposure standard curve

圖2 代表性顯微鏡綠色熒光攝片及流式細(xì)胞綠色熒光檢測(cè)效果Fig.2 Representative radiograph by green fluorescence and detection effect on green fluorescence of flow cytometry

2.2 環(huán)境樣品的表觀遺傳毒性檢測(cè)結(jié)果

通過檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在9個(gè)測(cè)試樣中,有7個(gè)顯示出可以觀察到的去甲基化表觀遺傳毒性,占測(cè)試樣品78%。其去甲基化表觀遺傳毒性當(dāng)量介于0.065～0.257 μmol·L-1的 5-Aza-CdR 之間。來自安徽宿州涌橋的一個(gè)底泥樣品毒性最高,毒性當(dāng)量為0.257 μmol·L-1的5-Aza-CdR;并且其一個(gè)地下水樣品的毒性較高,毒性當(dāng)量為 0.142 μmol·L-1的 5-Aza-CdR;在 4 個(gè)土壤或底泥樣品中,有3個(gè)被檢測(cè)出具有可以觀察到的去甲基化表觀遺傳毒性,詳見表2。

2.3 環(huán)境樣品重金屬提取液成分檢測(cè)結(jié)果

環(huán)境樣品重金屬提取液成分檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),共檢測(cè)到18種元素,在9個(gè)測(cè)試樣中錳、鋇、硼、鈦、鈷的檢出率為100%,4個(gè)土壤或底泥樣品中除了硒和鈹未檢出外(其中一底泥樣品對(duì)硒也有檢出),其余16中元素均有檢出;毒性當(dāng)量最高的為0.257 μmol·L-1的5-Aza-CdR的安徽宿州涌橋的底泥樣品重金屬檢測(cè)發(fā)現(xiàn),這個(gè)樣品中Cd的濃度為1.62 mg·Kg-1,超過土壤中的標(biāo)準(zhǔn)限值1.00 mg·Kg-1;其中毒性較高毒性當(dāng)量為0.142 μmol·L-1的5-Aza-CdR的地下水樣品,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中的Mn的濃度為4868.87 μg·L-1,超過土壤中的標(biāo)準(zhǔn)限值300 μg·L-1;在3個(gè)被檢測(cè)出具有可以觀察到的去甲基化表觀遺傳毒性土壤或底泥樣品中,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在不同程度的Cd超標(biāo)。環(huán)境樣品表觀遺傳毒性檢測(cè)結(jié)果也與環(huán)境分析結(jié)果具有基本一致的趨勢(shì),詳見表3。

表2 典型環(huán)境樣品相關(guān)信息及重金屬提取液的表觀遺傳毒性評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Related information on typical environmental samples and evaluation on epigenetic toxicity of extraction of heavy metals

表3 環(huán)境樣品重金屬提取液成分檢測(cè)結(jié)果Table 3 The test result on ingredients of heavy metals extraction in environmental samples

3 討論(Discussion)

環(huán)境保護(hù)的終極目標(biāo)是優(yōu)化環(huán)境質(zhì)量,規(guī)避人群健康風(fēng)險(xiǎn)。到目前為止,我們采取了環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)的策略來保護(hù)環(huán)境質(zhì)量。但是,單項(xiàng)因子的達(dá)標(biāo)能否為我們安全的生活環(huán)境提供切實(shí)的保障,是當(dāng)前很難做出明確回答的科學(xué)問題。由于污染物的生物富集和放大,低濃度污染的復(fù)合效應(yīng)存在,即使單項(xiàng)因子達(dá)標(biāo),也不能保障暴露人群免于受到環(huán)境污染的健康危害。開展環(huán)境介質(zhì)的毒性效應(yīng)綜合評(píng)價(jià)是未來環(huán)境污染管理不可避免的關(guān)鍵科學(xué)問題。到目前為止,已經(jīng)開展的健康危害評(píng)價(jià)涵蓋急性毒性評(píng)價(jià)、慢性毒性評(píng)價(jià)等方面。慢性毒性評(píng)價(jià)包括致突變、致畸性、致癌等,其與環(huán)境污染更為密切,對(duì)于環(huán)境保護(hù)和環(huán)境管理的意義更為重要。新近研究發(fā)現(xiàn),在傳統(tǒng)關(guān)注的“三致”等健康危害之外,以去甲基化能力為代表的表觀遺傳毒性更應(yīng)該得到足夠重視,因?yàn)檫@種新型的表觀遺傳毒性在環(huán)境中更為廣泛,比“三致”毒性更容易出現(xiàn)[15]。事實(shí)上,國(guó)際上有專家已經(jīng)開始認(rèn)為以去甲基化能力為代表的表觀遺傳毒性成為了環(huán)境污染物對(duì)人體健康危害的最前沿,是環(huán)境與人體交互作用的第一站[16]。

淮河流域地跨河南、安徽、江蘇、山東四省,既往污染嚴(yán)重[17],當(dāng)?shù)鼐植咳巳旱陌┌Y發(fā)病較多[18],當(dāng)?shù)厝罕妼?duì)淺層地下水系安全也非常關(guān)注。我們的表觀遺傳毒性檢測(cè)結(jié)果顯示淮河流域局部癌癥發(fā)病關(guān)注地區(qū)的環(huán)境樣品去甲基化能力值得關(guān)注,就本研究采集的環(huán)境樣品而言,大多數(shù)環(huán)境樣品去甲基化能力較強(qiáng),具有不容忽視的表觀遺傳毒性。樣品提取液成分掃描檢測(cè)結(jié)果顯示,一個(gè)地下水樣品Mn超標(biāo),4個(gè)土壤或底泥樣品不同程度的Cd超標(biāo),當(dāng)?shù)鼐植康貐^(qū)確實(shí)存在一定程度的污染,這與表觀遺傳毒性檢測(cè)結(jié)果相符,且隨著污染物濃度的提高其去甲基化表觀遺傳毒性有上升的趨勢(shì),運(yùn)用EGFP方法能夠快速檢測(cè)出具有可觀察到去甲基化表觀遺傳毒性的環(huán)境樣品。那么多種污染物的復(fù)合健康效應(yīng)是否嚴(yán)重,長(zhǎng)期生活在這種環(huán)境下是否能導(dǎo)致人體關(guān)鍵基因啟動(dòng)子DNA的顯著去甲基化都不清楚,而這種毒性對(duì)人體健康有多大影響也尚不清楚,有待我們?nèi)ミM(jìn)一步研究。

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