王天嬌，唐傳紅，張勁松，徐凱，劉艷芳，楊焱，唐慶九，賈薇，劉方

1(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海，201306)2(國家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海，201403)

靈芝是中醫(yī)藥中的一種珍貴的傳統(tǒng)藥用真菌［1］。靈芝中的三萜類化合物具有保肝、抗腫瘤、消炎抗菌、抗衰老、降低膽固醇等多種生理功能［2－5］，成為近年研究熱點(diǎn)之一。

孢子雜交育種是經(jīng)典的食用菌雜交育種模式，靈芝擔(dān)孢子由于難以萌發(fā)而使這種方法難以用于靈芝的育種工作。利用原生質(zhì)體單核化雜交育種技術(shù)可以克服靈芝孢子難以萌發(fā)這一瓶頸［6］。林俊華等［7］研究對(duì)比分析了3個(gè)靈芝原生質(zhì)體單核化雜交子及其親本的菌絲生長速度、產(chǎn)量、出菇期、有效成分含量等參數(shù)，發(fā)現(xiàn)雜交子表現(xiàn)出明顯的雜交優(yōu)勢，說明靈芝原生質(zhì)體單核化雜交育種技術(shù)有實(shí)用價(jià)值。

目前，已從靈芝子實(shí)體中分離純化出三萜類化合物160多種［8］，由于靈芝子實(shí)體中所含靈芝酸的種類多，難于大量的獲得靈芝中的三萜化合物，因此關(guān)于其生物活性的研究往往由于樣品難以準(zhǔn)備而無法深入研究其生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，靈芝發(fā)酵菌絲體中含有的三萜成分比子實(shí)體少，也具有多種生物活性，且液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)三萜類化合物具有生產(chǎn)周期短、成本低、含量穩(wěn)定、適于工廠化生產(chǎn)等特點(diǎn)［9－10］，因此液體發(fā)酵技術(shù)已成為獲取靈芝三萜類化合物的有效手段之一。國內(nèi)外有關(guān)靈芝深層發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究的報(bào)道已有很多［9］，主要集中在靈芝多糖方面，而關(guān)于利用雜交育種手段獲得高產(chǎn)靈芝三萜菌株并研究其三萜類化合物深層發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究鮮有報(bào)道。

本文利用原生質(zhì)體單核化技術(shù)，獲得靈芝單核菌株，以這些單核菌株作為雜交育種材料，得到雜交菌株，并通過拮抗反應(yīng)驗(yàn)證是否雜交成功。進(jìn)一步用Logistic模型對(duì)靈芝雜交菌株菌絲體生長、葡萄糖消耗和總?cè)坪铣傻谋人俾蔬M(jìn)行分析，篩選出有高產(chǎn)靈芝三萜的菌株，為進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

3株靈芝供試菌株 G0119(滬農(nóng)靈芝1號(hào))，G0130(滬農(nóng)靈芝4號(hào))和G0154(滬農(nóng)靈芝2號(hào))均用于靈芝的栽培生產(chǎn)，具有優(yōu)異的農(nóng)藝現(xiàn)狀和較好的生物活性，由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心上海食用菌分中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，加1 000 mL水煮沸后過濾，加入葡萄糖20 g，瓊脂粉25 g，補(bǔ)加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌15 min后備用。

種子培養(yǎng)基:除不添加瓊脂粉外其他成分同斜面培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):豆餅粉 30，可溶性淀粉 20，MgSO4·7H2O 2.25，KH2PO41.5，自然 pH，121 ℃滅菌15 min后備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek公司BioTek-Synergy HT多功能酶標(biāo)儀;離心機(jī)，美國Beckman公司Allegratm25R Centrifuge離心機(jī);搖床，上海杜科自動(dòng)化設(shè)備有限公司DKY-Ⅱ恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床;生化培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司LRH-250生化培養(yǎng)箱。

1.4 分析方法

原生質(zhì)體單核體的制備:見參照文獻(xiàn)［11］。

生物量的測定:取搖瓶發(fā)酵液100 mL，在9 000 g下離心10 min后，棄上清液，取沉淀用去離子水洗滌2次，收集后放在60℃的烘箱中烘干至恒重，精確稱重。

還原糖的測定:DNS比色法［12］。

總?cè)坪康臏y定:齊墩果酸比色法［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝單核體菌株的獲得

選取3株用于靈芝栽培生產(chǎn)上親本菌株G0119，G0130和G0154作為出發(fā)菌株，根據(jù)原生質(zhì)體單核體的制備方法制備3株親本菌株的單核體，結(jié)果見表1。

表1 單核菌株的數(shù)量以及單核獲得比例Table 1 The quantity of monocytic strains and the rate of monokaryogenesis

由表1可以看出，靈芝親本菌株G0119的單核菌株得率是比較低的，為 18.01%，而 G0130和G0154獲得單核菌株的幾率是比較高的，單核得率分別為40.22%和33.67%。

不同靈芝菌株獲得的單核體的交配型的分類結(jié)果如表2所示。由表2結(jié)果可知，同一菌株2種交配型單核菌株獲得的比例是不同的。

表2 交配型測定結(jié)果Table 2 The results of mating type

2.2 靈芝雜交菌株

將篩選出的來自3株不同靈芝親本的單核菌株進(jìn)行兩兩配對(duì)，配對(duì)時(shí)挑取2塊不同的單核菌株接種到PDA平板上，當(dāng)2菌塊的前端菌絲交錯(cuò)在一起時(shí)，制片在顯微鏡下觀察菌絲是否有鎖狀聯(lián)合，有鎖狀聯(lián)合者，即為雜交菌株［14－16］。初步鑒定出的雜交菌株63株的編號(hào)和親本信息如表3所示。

2.3 靈芝雜交菌株的驗(yàn)證

取某一菌株與其2個(gè)親本菌株接種于同一培養(yǎng)皿中，觀察三者間拮抗反應(yīng)以判斷菌種雜交是否成功。圖1為雜交菌株與其親本間的拮抗實(shí)驗(yàn)的圖片，圖1顯示雜交菌株雜1(圖1中G1)與親本G0019，G0130，雜交菌株雜50(圖1中 Z3)與親本 G0130，G0154以及雜交菌株雜 53(圖 1中 Z6)與親本G0130，G0154的拮抗試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示:雜交菌株與2個(gè)親本均能形成明顯的拮抗線，說明雜交菌株與2個(gè)親本都不同，產(chǎn)生了新的菌株。63株雜交菌株分別與其2個(gè)親本均有拮抗反應(yīng)，說明獲得的63株雜交菌株確實(shí)是雜交菌株。

2.4 靈芝雜交菌株液態(tài)深層發(fā)酵菌絲生物量的測定

以雜交獲得的63株菌株為研究基礎(chǔ)，對(duì)其在發(fā)酵搖瓶中最終的菌絲體生物量進(jìn)行分析，對(duì)獲得的63株菌株的生物量進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示。

表3 雜交菌株編號(hào)Table 3 The number of hybrid

圖1 雜交種與親本的拮抗實(shí)驗(yàn)Fig.1 Antagonistic test of hybrids and parents

圖2 供試雜交菌株搖瓶發(fā)酵生物量Fig.2 Biomass of Ganoderma lucium hybrid strains from shaking flask fermentation

由圖2可知，在63株雜交菌株中，搖瓶發(fā)酵中菌絲體生物量最高的分別是雜29和雜62，生物量分別達(dá)1.85和1.83 g/L，較親本菌株G0119的1.55 g/L分別提高19.35%和18.06%，較親本菌株G0130的1.54 g/L分別提高20.12%和18.83%，較親本菌株G0154的1.39 g/L分別提高33.09%和31.65%。

2.5 雜29和雜62發(fā)酵特性的研究

雜29，雜62和親本菌株發(fā)酵特性的比較結(jié)果如圖3所示。圖3所示的是雜交菌株雜29和雜62發(fā)酵生產(chǎn)三萜過程中菌絲體生長、還原糖消耗、三萜合成，菌絲體比生長速率，葡萄糖比消耗速率和三萜比合成速率的變化曲線。

圖3 靈芝菌株菌絲體生長、底物消耗、三萜合成，比生長速率、比消耗速率和比合成速率的變化Fig.3 Time-courses of cell growth，glucose consumption，triterpenes formation，specific rate of cell growth，specific rate of glucose consumption and specific rate of triterpenes formation of Ganoderma lucidum

由圖3分析可知，在菌株生長過程中，雜29，雜62和親本菌株生長過程可以分為3個(gè)階段，發(fā)酵開始至20 h為靈芝菌株生長的初始階段;在20 h后菌株生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期，其中G0119和G0130的生長速度較快;在100至120 h菌株生長趨于穩(wěn)定，G0119、G0130、G0154、雜29和雜62的菌絲體含量分別為12.88，11.72，5.82，7.57 和5.26 g/L(如表4 所示)。在還原糖利用上，雜62對(duì)于還原糖的利用較差，G0119對(duì)還原糖的利用率最高。在發(fā)酵至120 h時(shí)，G0119、G0130、G0154、雜29 和雜62 對(duì)于還原糖底物的利用率分別為 99.73%，86.45%，58.70%，64.87%和11.09%(如表4所示)。在三萜產(chǎn)量上，在發(fā)酵至120 h 時(shí)，G0119、G0130、G0154、雜 29 和雜62合成三萜的含量分別為 17.88，27.46，15.44，37.02和33.83 mg/L，而其合成產(chǎn)物對(duì)菌絲體得率分別為0.340，0.363，0.265，0.316 和0.263 mg/100 mg(如表4所示)。

表4 靈芝菌株生產(chǎn)指標(biāo)比較(120 h)Table 4 Results of production indexes of Ganoderma lucidum in 120 h

再由圖3分析可知，親本菌株 G0119、G0130、G0154以及雜交菌株雜29和雜62的比生長速率、比消耗速率和比合成速率利用Origin 8.5軟件中的Logistic模型進(jìn)行擬合并求得其相對(duì)應(yīng)的比速率曲線，結(jié)合表5中的擬合度(R2值)值分析可知，擬合的效果很好，均在95%置信區(qū)間以內(nèi)，因此，利用Logistic模型進(jìn)行擬合是有效和可行的。與親本菌株G0119、G0130和G0154比較可知，雜29和雜62菌絲三萜產(chǎn)量高于親本菌株，而其比合成速率也高于親本菌株G0130;但是，雜29和雜62菌絲體產(chǎn)量在發(fā)酵培養(yǎng)基中卻低于親本菌株，雜29比生長速率卻高于親本菌株，雜29和雜62對(duì)于碳源的利用率也不如親本菌株，其中雜29的比消耗速率也較低，可能原因是本實(shí)驗(yàn)所用的發(fā)酵培養(yǎng)基不是雜29和雜62雜交菌株的最適培養(yǎng)基，導(dǎo)致其對(duì)碳源的利用不高，也導(dǎo)致其菌絲體產(chǎn)量低于親本菌株，但是其菌絲體中三萜含量高于親本菌株，如對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源進(jìn)行優(yōu)化篩選，在適宜的條件下雜交菌株雜29和雜62的三萜產(chǎn)量可能更高。下一步試驗(yàn)我們將對(duì)雜29和雜62的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

表5 靈芝菌株比生長速率、比消耗速率和比合成速率的擬合度Table 5 Fitting degree of specific rate of cell growth，specific rate of glucose consumption and specific rate of triterpenes formation of Ganoderma lucidum

3 結(jié)論

本文通過原生質(zhì)體單核化技術(shù)，獲得靈芝單核菌株。以單核菌株作為雜交育種材料，將篩選出的單核菌株進(jìn)行兩兩配對(duì)，得到雜交菌株，并通過拮抗反應(yīng)驗(yàn)證。其中，針對(duì)同一菌株2種交配型單核菌株獲得比例的不同，香港中文大學(xué)的張樹庭［17］教授也報(bào)道了類似的情況，原生質(zhì)體2種交配型非等比例分配的原因，張教授認(rèn)為是由于2種基因型的再生率的不同。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)朱朝輝［18］教授在研究香菇原生質(zhì)體單核體再生與交配型的關(guān)系中進(jìn)一步證實(shí)是不同原生質(zhì)體交配型再生能力的不同，而且發(fā)現(xiàn)2種交配型再生出來的時(shí)間會(huì)有較大的差異，一種集中在前期，另一種集中在后期。為了同時(shí)獲得2種交配型單核菌株應(yīng)該加大挑取的數(shù)量并且注意挑取時(shí)間段的間隔性選擇。

用Logistic模型對(duì)靈芝雜交菌株菌絲體生長、葡萄糖消耗和三萜合成的比速率進(jìn)行了計(jì)算與分析，主要結(jié)論總結(jié)如下:(1)通過雜交育種獲得了不同于親本的具有代表性的雜交菌株63株;(2)通過對(duì)雜交菌株的拮抗實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了雜交菌株不同于親本菌株;(3)通過液態(tài)深層發(fā)酵手段對(duì)雜交菌株產(chǎn)三萜活性物質(zhì)進(jìn)行分析，比較于傳統(tǒng)的栽培方法更有效，更快捷;(4)通過動(dòng)力學(xué)手段對(duì)其比生成速率，比消耗速率和比合成速率的分析，從理論上進(jìn)一步說明了得到的雜交菌株雜29和雜62不同于且優(yōu)于親本菌株的性狀。

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