徐書澤，黃麗，滕建文，韋保耀，夏寧

(廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧，530004)

霉豆渣是我國典型的傳統(tǒng)發(fā)酵產品，是以豆渣為原料經自然發(fā)酵而成的一種食品，主要分布在湖北武漢，江西會昌以及廣西梧州等地［1］。其中梧州霉渣是梧州著名小吃，已有幾百年歷史，成品以切口色白、粘實、爽手、富有彈性、表面霉色均勻呈粉紅色為上乘［2］。煮熟爽口，有一股獨特的香味，被港澳稱為廣西豬肝。

豆渣除含有豐富的膳食纖維，還有蛋白質、脂肪、異黃酮和維生素等，具有豐富的營養(yǎng)價值［3－5］，通過微生物發(fā)酵，可以把其中不溶性高分子化合物分解成可溶性低分子化合物，并能去除大豆的苦澀、豆腥味和一些有害物質，粗纖維顆粒微細化，并因這些分解產物的重新組合和微生物的自溶作用產生了豆渣中原來沒有的營養(yǎng)成分，最終產品中的游離氨基酸、水溶性礦物質、水溶性固形物、維生素等顯著提高，使豆渣中營養(yǎng)成份被利用的實際可能性大大提高［6－7］。

目前霉豆渣的制作主要采用自然發(fā)酵的方式，這種制作方式發(fā)酵周期長，易受到雜菌的污染，使產品的品質不穩(wěn)定，安全得不到保障。而且受到環(huán)境溫度，濕度等條件的影響，具有季節(jié)及地域限制。因此篩選合適的菌種在無菌的條件采用菌種直接進行發(fā)酵既可做到衛(wèi)生安全又可縮短發(fā)酵周期滿足工業(yè)化生產的要求。目前已有學者從武漢，江西等地的霉豆渣中分離出毛霉屬，串珠霉屬，根霉屬，枯草芽孢桿菌及運動發(fā)酵單胞菌和雅致放射毛霉等主要發(fā)酵菌株［1，8］。張燕鵬［9］等對江西的豆渣菌進行了菌相分析，結果表明豆渣菌是以真菌和細菌為主的混合型發(fā)酵食品。真菌主要為串珠霉屬、根霉屬和酵母屬;細菌主要為球菌屬、腸桿菌屬，非乳桿菌屬和3株枯草芽孢桿菌。周彥良［8］將分離得到的雅致放射毛霉和運動發(fā)酵單胞菌反接種于豆渣中，優(yōu)化了發(fā)酵條件，表明純菌種混合發(fā)酵生產霉豆渣是可行的，能形成與自然發(fā)酵相似的品質，且可以縮短發(fā)酵時間，避免非目標微生物的污染。目前還沒有關于梧州霉豆渣發(fā)酵菌種的相關報道，且由于自然發(fā)酵霉豆渣的發(fā)酵菌株及感官品質受地域影響，故本文以梧州霉豆渣為研究對象，以期從中篩選出具有較好產酶性的優(yōu)勢菌種。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

霉豆渣，購于廣西梧州農貿市場;

培養(yǎng)基:YPD培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、平板計數培養(yǎng)基、馬鈴薯液體培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基、羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基。

1.2 儀器及設備

電熱鼓風干燥箱、壓力蒸汽滅菌鍋、培養(yǎng)箱、超凈工作臺、光學顯微鏡、電子天平。

1.3 樣品的處理［10］

在超凈工作臺上稱取霉豆渣樣品25 g，研磨，加入含有225 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，浸泡、振搖30 min后，制成樣品菌液備用。

1.4 微生物的分離純化［10］

樣品菌液經適當稀釋后取0.1 mL涂平板，細菌分離采用平板計數瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃下培養(yǎng)24 h，霉菌和酵母菌分別采用YPD和孟加拉紅培養(yǎng)基，置于28℃下培養(yǎng)72 h。微生物長出單菌落后再反復進行平板劃線分離，直至得到純菌株。

1.5 產酶菌株的篩選

1.5.1 蛋白酶產生菌的確定［11］

將從樣品中分離出的菌株接種到酪素培養(yǎng)基平板上，在適宜溫度下培養(yǎng)2 d。測定各菌株的透明圈直徑(H)和的菌落直徑(C)，并計算出每1菌株的H/C值。此值越高，表明蛋白酶活越高。

1.5.2 纖維素酶產生菌的確定［12］

把挑選到的菌株點接到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，放在適宜的溫度下培養(yǎng)2 d，向培養(yǎng)基中加入適量的1 mg/mL剛果紅溶液，染色1h，棄去染液后，加入適量1 mol/L的NaCl溶液，洗滌1 h，通過觀察菌落周圍清晰的透明圈來判定產纖維素酶的活力。

1.6 發(fā)酵試驗

將上述篩選得到的菌種反接種于豆渣中，觀察菌株的生長情況，通過豆渣的外觀及感官特性挑選出發(fā)酵豆渣質量最好的菌株進行鑒定。

1.7 發(fā)酵菌種的鑒定

霉菌菌落觀察和鑒定:對分離的霉菌進行點植培養(yǎng)觀察其菌落特征，并于顯微鏡下觀察其顯微結構。通過對菌落和菌體形態(tài)及菌絲產孢結構的觀察，并參考《常見與常用真菌》［13］和《真菌鑒定手冊》［14］進行鑒定。

1.7.1 DNA提取

真菌DNA的提取采用CTAB法［15］:稱菌絲0.1 g放入研缽中，并加入0.1 g石英砂迅速研磨粉碎。用3 mL CTAB抽提液洗滌粉末，轉入10 mL滅菌離心管中，65℃水浴30 min，冷卻至室溫，加入與上清等體積的氯仿∶苯酚(體積比(1∶1)，混勻，室溫下，10 000×g離心10 min，轉移上清入新的10 mL滅菌離心管中，加入與上清液等體積的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1，v/v)，混勻，4℃條件下，10 000×g離心10 min，轉移上清入新的10 mL滅菌離心管中加入與之等體積的異丙醇，輕輕混勻后放入－20℃冰箱至少1 h以沉淀DNA。然后4℃下10 000×g離心10 min，棄上清液，用冰冷的70%乙醇溶液洗滌沉淀，4℃下10 000×g離心10 min，重復2次。棄去上清液后室溫風干DNA，加入0.2 mL TE溶解DNA及20 μg/mL RNase于37℃溫育30 min以消除RNA。

1.7.2 PCR擴增

選用真菌引物序列，其編號和序列:ITS1(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’)ITS4(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)。PCR 反應體系(25 μL):Template:1 μL;Primer up(10 μmol/L):0.5 μL;Primer down(10 μmol/L):0.5 μL;2 × Taq PCR Master mix:12.5 μL，加水至 25 μL。PCR 程序設定:預變性94℃ 5 mim;循環(huán) 94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán);延伸 8 min。

1.7.3 測序及比對，構建進化樹

將PCR產物送到上海生工測序，將測序得到的序列提交到Genbank，通過blast比對，找到同源性高的菌種進行鑒定。

1.8 菌種生理特征的研究

采用直接干燥法:將振蕩培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)物用預先測定干重的定性濾紙濾得菌體后，水洗2次，然后在連同濾紙一起在105℃下烘干至恒重，測質量，從而算出菌體干重［16］。

1.8.1 菌種最適培養(yǎng)時間的測定

取1 mL孢子懸浮液接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min 下分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后取出，用事先稱量過的濾紙過濾，然后將濾餅在105℃下干燥至恒重，測質量，以菌絲體干重作為菌種生物量的指標，單位為g/100 mL發(fā)酵液。每組為2個平行樣，測量后取平均值。

1.8.2 菌種最適生長溫度的測定

取1 mL孢子懸浮液接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，分別置于16、20、24、28、32 ℃的培養(yǎng)箱中，在 150 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后取出，用事先稱量過的濾紙過濾，然后將濾餅在105℃干燥至恒重，測質量，以菌絲體干重作為菌種生物量的指標，單位為g/100 mL發(fā)酵液。每組為2個平行樣，測量后取平均值。

1.8.3 菌種最適生長pH的測定

取lmL孢子懸浮液接種到不同pH值3、4、5、6、7的馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，在28℃、150 r/min下培養(yǎng)48 h后取出，用事先稱量過的濾紙過濾，然后將濾餅在105℃下干燥至恒重，測其質量，以菌絲體干重作為菌種生物量的指標，單位為g/100 mL發(fā)酵液。每組為2個平行樣，測量后取平均值。

2 結果與討論

2.1 微生物的分離和產酶菌種的篩選

通過平板劃線法共得到8株細菌，4株酵母，2株霉菌。因為豆渣中富含膳食纖維，占豆渣干重的50%以上，但由于纖維素含量高、纖維顆粒大，其口感粗糙，將纖維素適當降解，對提高可溶性膳食纖維和改善豆渣的口感都有重要的意義。因此，篩選出產蛋白酶和纖維素酶的菌株對豆渣發(fā)酵工藝的研究有著重要意義。表1表明，細菌中 X5，X6，X7產生蛋白酶，透明圈和菌與菌落直徑之比依次為1.6、2.8、1.8。產生纖維素酶的有1株酵母J4和1株霉菌M1，而既能產生蛋白酶又能產生纖維素酶的僅有霉菌M1。

表1 分離菌株的蛋白酶和纖維素酶活力Table 1 The proteolytic and cellulose activity of the strain

2.2 發(fā)酵試驗

將上述分離得到的菌株進行反接種實驗，將其接種于豆渣中，于28℃培養(yǎng)3～5 d，結果只有霉菌M1可以將豆渣發(fā)酵形成與霉豆渣相似的感官品質，其外表覆蓋一層橘黃色孢子，質構緊密，且在發(fā)酵過程中有特殊香氣形成。與傳統(tǒng)發(fā)酵的霉豆渣相比，顏色更加均勻鮮艷。接種其他菌株無法形成該種特征，在發(fā)酵后期有異味產生。原料豆渣與霉菌M1發(fā)酵后的豆渣的感官形態(tài)如圖1所示。

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定

將分離得到的霉菌M1接種于PDA培養(yǎng)基，菌落絨毛狀，覆蓋整個培養(yǎng)皿，呈蔓延生長，菌絲開始為白色，后變?yōu)辄S色，菌叢直立，平皿邊緣會有大量橘黃色孢子生成。斜面培養(yǎng)時靠近試管口生長良好，會堆積橙橘黃的的孢子環(huán)。將其置于顯微鏡下觀察，菌絲有分支和橫隔，無假根，孢子呈一節(jié)一節(jié)的橢圓狀或方形，分生孢子為單細胞，呈橘黃色。通過其生理形態(tài)可以確定該菌為脈孢菌屬。

圖1 原料及發(fā)酵豆渣Fig.1 Fermented bean curd

2.3.2 PCR產物電泳圖譜

PCR產物電泳圖譜如圖2所示。

圖2 PCR產物電泳圖譜Fig.2 PCR electrophoretogram

2.3.3 分子鑒定

將得到的測序結果提交到blast與NCBI收錄的DNA序列進行比對，經核酸同源性分析，該菌與Neurospora crassa的同源性達到99%，將同源性97%以上的菌株構建進化樹，如圖3所示。

圖3 分子進化樹Fig.3 Molecular phylogenetic tree

結果表明該菌株 Neurospora sp.與Neurospora crassa的在同一支上，結合形態(tài)學鑒定可確定該菌為粗糙脈孢菌。

2.4 菌種生理特性的研究

2.4.1 不同培養(yǎng)時間下菌種生長量變化

在馬鈴薯液體培養(yǎng)基上(100 mL/瓶)接入孢子懸浮液后，在28℃，150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔12 h取出2瓶，過濾菌絲體，測其干重，求其平均值。由圖4可知，該菌在馬鈴薯培養(yǎng)基的對數生長期大約在0～36 h，穩(wěn)定期大約在36～60 h，之后屬于衰退期。

圖4 不同培養(yǎng)時間下菌種生長量變化Fig.4 Effect of time on the strain growth

2.4.2 不同pH值條件下菌種生長量變化

將孢子懸浮液接種到不同 pH 值 3、4、5、6、7的馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，在28℃、150 r/min下培養(yǎng)48 h取出，過濾菌絲體，測其干重，求其平均值。由圖5可知在pH值為3時該菌生長受到抑制，且在馬鈴薯液體培養(yǎng)基中形成的菌體成顆粒狀，在pH值4～8均可生長，但是在pH值為6時生長量最大，生長情況最好，所以該菌的最適生長pH值為6。

圖5 pH值對菌種生長量的影響Fig.5 Effect of pH on the strain growth

2.4.3 不同培養(yǎng)溫度下菌種生長情況

不同培養(yǎng)溫度下菌種生長情況見表2。

表2 培養(yǎng)溫度對菌種生長的影響Table 2 Effect of temperature on the strain growth

本試驗是在PDA固體培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)，在18、24℃下，該菌生長緩慢，24 h后24℃下有少量白色菌長出，但菌絲很少，40 h后18℃的才有生長，而且在后期的培養(yǎng)過程中這2種溫度下的菌的菌絲生長都不多，但會有孢子生成。但是在28、32、36℃下培養(yǎng)時12 h就有菌體生長，18 h菌絲較多，但是36℃條件下的菌絲開始變橙色。40 h后，菌絲生長得多而密，生成孢子，但36℃下的孢子更多，菌絲生長情況以32℃的最好。

3 結語

本文通過傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)從梧州霉豆渣中分離得到1株產酶優(yōu)勢菌，利用形態(tài)學和分子手段鑒定為粗糙脈孢菌，該菌能產生蛋白酶和纖維素酶，可以發(fā)酵豆渣。并且進一步研究了該菌的最適生長溫度，時間以及pH值，為脈孢菌發(fā)酵豆渣工藝的研究奠定了一定的理論基礎。

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