卜利偉，邱瑞霞，黃雪松

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州，510632)

黑蒜(black garlic)是在控制環(huán)境中溫度和濕度的情況下，新鮮大蒜(Allium sativum L.)自然發(fā)酵而成的產(chǎn)品［1］。在黑蒜加工過程中，新鮮大蒜先在低溫條件下熟化一定時(shí)間后，再高溫熟化成最終產(chǎn)品，其中低溫熟化階段主要發(fā)生酶促反應(yīng)，而高溫熟化階段主要發(fā)生非酶褐變反應(yīng)，包括Maillard反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)、Vc氧化分解等［2］。這些反應(yīng)產(chǎn)生的一些褐變產(chǎn)物使黑蒜擁有了相對于新鮮大蒜更加豐富的功能成分和更強(qiáng)的生物活性［3］。而這些反應(yīng)所產(chǎn)生的一些呈色物質(zhì)使得新鮮大蒜的顏色從自然白色漸變?yōu)辄S色、咖啡色到最終的黑色［4］。

成熟的黑蒜兼具黑色和強(qiáng)生物活性，可見黑蒜的呈色物質(zhì)與品質(zhì)之間應(yīng)當(dāng)存在一定關(guān)系，此外，呈色物質(zhì)本身也有一些生物活性，如類黑精的抗氧化特性［5］，5-HMF可治療內(nèi)毒素血癥及降低因此誘發(fā)的多臟器功能衰竭所致死亡等方面的作用［6］。郭彩華［7］等證實(shí)黑醬油中類黑素粗制品對DPPH自由基的清除率最高達(dá)89.0%，對羥自由基的清除能力達(dá)89.5%，而類黑素正是黑醬油呈色的主要物質(zhì)。因此，如果了解了黑蒜生產(chǎn)中某種呈現(xiàn)黑色物質(zhì)的生成規(guī)律，便可以利用呈色物質(zhì)和黑蒜品質(zhì)之間的函數(shù)關(guān)系在黑蒜加工的過程中對黑蒜的品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控。為此，本文將對黑蒜中主要呈色物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，并通過不同溫度等處理研究其生成規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

新鮮大蒜，產(chǎn)自山東省金鄉(xiāng)縣，購自廣州市天河區(qū)石牌蔬菜市場;購自Dikma公司的色譜純甲醇;無水乙醇(分析純)，購自廣州化學(xué)試劑廠;5-HMF(98.0%)購自 Sigma公司;所有用水均為Mili-Q純化系統(tǒng)純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

FHS-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)，金壇市宏華儀器廠;DHG-9070A烘箱，上海一恒科技有限公司;Prominence LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司;4000 Qtrap四極桿-線性阱復(fù)合型質(zhì)譜儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 樣品前處理

第一階段:凍結(jié)，將樣品(3 kg新鮮大蒜分裝到100個(gè)小袋，每袋30 g)放入－70℃冰箱冷凍48 h。

第二階段:低溫熟化，從－70℃冰箱中取出樣品放入45℃恒溫烘箱里，熟化72 h，期間每隔8 h取出2袋樣品，測定物料中的5-HMF含量。

第三階段:高溫熟化，從低溫熟化后的樣品中取72袋樣品平均放進(jìn)3個(gè)恒溫烘箱中，溫度分別設(shè)定為70，80和90℃，熟化72 h，期間每個(gè)烘箱每隔8 h取出2袋樣品，測定物料中的5-HMF含量(2袋樣品的平均值)。

1.4 黑蒜呈色物質(zhì)的分離鑒定

將150 g活化后的硅膠裝入燒結(jié)漏斗中(內(nèi)徑10 cm，長15 cm)。取一定量的黑蒜樣品經(jīng)破碎、離心后，用乙酸乙酯萃取3次，萃取液旋蒸濃縮至一定體積，然后濃縮液與15 g活化后的硅膠合并在一起濃縮干燥得到硅膠和樣品的混合物。將其均勻鋪在150 g硅膠表面，以100 mL的石油醚-乙酸乙酯(體積比=1∶1)為初始洗脫液，不斷增加初始洗脫液中的甲醇比例來提高極性進(jìn)行減壓洗脫，每100 mL收集一瓶，共收集21瓶洗脫液。

1.5 黑蒜呈色物質(zhì)的ESI-MS鑒定

將真空柱分離后的第4瓶洗脫液中黑色物質(zhì)進(jìn)行ESI-MS鑒定，質(zhì)譜條件為離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電離方式EI;電子能量70 eV，溶劑延遲時(shí)間為2 min，采用正離子模式，掃描質(zhì)量范圍20～500 m/z，采集方式為掃描，質(zhì)量分析數(shù)據(jù)庫為Nist 9811。

1.6 加5-HMF內(nèi)標(biāo)鑒定黑蒜中的呈色物質(zhì)

將真空柱分離后的第4瓶洗脫液分成2份(1份加入一定濃度的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品，1份不加)，然后用HPLC進(jìn)行分析。色譜條件為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，檢測波長284 nm，柱溫40℃，流動(dòng)相為甲醇∶水(體積比 =10∶90)，流速0.8 ml/min，進(jìn)樣量為 10 μL［8］。

1.7 5-HMF含量測定

1.7.1 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱量0.14 g 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品定容至100 mL，依次稀釋為 2.8、11.2、22.4、44.8、89.6、179.2、358.4 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.6部分所述色譜條件下進(jìn)樣。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)做線性回歸方程y=82 114x－9 699.6，R2=0.998 9(n=7)，檢測方法在2.8～358.4 mg/L線性良好。

1.7.2 5-HMF含量測定

將1.3部分不同溫度不同加工時(shí)間取出的物料切碎、勻漿、離心后加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，靜置12 h后離心去沉淀，然后加入80%乙醇定容至100 mL，靜置2 h，吸取一定量上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后打入進(jìn)樣小瓶中用1.6部分所述色譜條件進(jìn)行HPLC測定，同時(shí)以5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品為外標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑蒜呈色物質(zhì)的分離鑒定

根據(jù)1.4部分方法洗脫得到了21瓶洗脫液，其中第3瓶洗脫液呈現(xiàn)微黃色，第4瓶［其洗脫液是石V(油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=31∶31∶38］洗脫液揮發(fā)完后剩下的物質(zhì)呈現(xiàn)較重的黑色，將其用一定量乙酸乙酯重溶后做ESI-MS鑒定，圖1顯示有3個(gè)明顯的離子峰，其質(zhì)荷比分別是127、144、149，推測它們分別是 5-HMF(其 M=126)的 M+H+、M+Na+、M+NH4+峰，即圖1所代表的樣品應(yīng)當(dāng)為5-HMF的MS圖。

圖1 黑蒜呈色物質(zhì)的質(zhì)譜鑒定Fig.1 The mass spectrum identification of the color material of black garlic

為進(jìn)一步確定該洗脫液中的呈色物質(zhì)為5-HMF，采用1.6部分所述加標(biāo)方法進(jìn)行鑒定。圖2結(jié)果表明，瓶號4樣品在加入5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品之前，“M”的峰強(qiáng)度約為400 mAU，而加入5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品后，其保留時(shí)間與未加5-HMF時(shí)相同，且“M+HMF”峰的峰強(qiáng)度約為1150 mAU。綜合考慮該結(jié)果與圖1的MS結(jié)果，可以得出一個(gè)結(jié)論:即該洗脫液中呈色物質(zhì)成分應(yīng)為5-HMF。黑蒜成熟與否可以通過5-HMF含量來體現(xiàn)，因此，用HPLC測定.3個(gè)溫度條件下不同加工時(shí)期5-HMF的生成含量。

圖2 加5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品之前和之后對比Fig.2 The comparison of results before and after adding 5-HMF

2.2 黑蒜加工過程中5-HMF的生成規(guī)律

2.2.1 5-HMF檢測方法的確定

圖3－a是5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜，通過配制2.8～358.4 mg/L濃度的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品，用Excel作圖得到線性回歸方程y=82 114x－9 699.6。圖3－b是黑蒜提取物的 HPLC圖譜。由圖3－b可見，5-HMF在13.87 min出峰，且峰形對稱無干擾，可以滿足測定黑蒜中5-HMF的要求。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中5-HMF的測定圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of 5-HMF standard and the sample

將圖3－b中對應(yīng)5-HMF保留時(shí)間的峰面積帶入上述回歸方程中計(jì)算出5-HMF的含量，由圖4可知，(1)70、80、90℃ 3個(gè)溫度下加工成的黑蒜產(chǎn)品的5-HMF 含量分別為 4.79、31.28、154.87 μg/g，證明較高溫度會(huì)促進(jìn)5-HMF生成。5-HMF是Maillard反應(yīng)重要的中間產(chǎn)物，其不僅是Maillard反應(yīng)和非酶褐變的重要指示因子，也是色素沉積的潛在條件［9］。在黑蒜熟化過程的“低溫熟化”階段，物料無5-HMF產(chǎn)生，表明新鮮大蒜本身無5-HMF，并且在45℃低溫熟化72 h也沒有5-HMF產(chǎn)生，此階段的生化反應(yīng)主要是以大蒜中的水解酶類(如大蒜果聚糖水解酶［10］)為主的酶促反應(yīng)，此階段的物料顏色由最初的白色逐漸呈現(xiàn)出微黃色。(2)在“高溫熟化”階段的反應(yīng)主要為非酶褐變反應(yīng)，5-HMF開始積累，同時(shí)物料的顏色開始由黃色迅速變成咖啡色，然后變成最終的黑色，此時(shí)得到了成熟黑蒜產(chǎn)品，并顯示出黑蒜的各種生理活性和功能特性。(3)3種溫度下的5-HMF含量均呈指數(shù)增長趨勢，用origin8.0軟件進(jìn)一步對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到時(shí)間與5-HMF含量的函數(shù)關(guān)系見表1(P ＜0.05)。

圖4 5-HMF隨著溫度和時(shí)間的含量變化Fig.4 The variation in content of 5-HMF as the temperature and time

2.2.2 5-HMF生成反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

將加工時(shí)間和5-HMF的函數(shù)關(guān)系用零級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型和一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合分析發(fā)現(xiàn)，其函數(shù)關(guān)系更符合一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程(表2)。而且C0=1.02 μg/g，速率常數(shù)的對數(shù)和溫度的關(guān)系符合方程ln K=－3 862.5(1/T)+7.98，其積分式為K=e7.98exp(－3 862.5/T)= 2.91×103 exp(－32.11/RT)，此方程符合阿雷尼烏斯公式。其中頻率因子Kf=2.91×103h－1，反應(yīng)活化能Ea=32.11 kJ/mol。

表1 5-HMF生成的動(dòng)力學(xué)方程Fig.1 Kinetics of the 5-HMF formation reaction in black garlic

圖5 5-HMF生成的阿雷尼烏斯曲線Fig.5 Arrhenius plots for 5-HMF accumulation

陳磊［11］證實(shí)黃酒中5-HMF的生成反應(yīng)也屬于一級反應(yīng)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，F(xiàn)allico［12］研究蜂蜜當(dāng)中5-HMF的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同種類蜂蜜中5-HMF的反應(yīng)活化能在32.5～43.6 kJ/mol之間，而本實(shí)驗(yàn)測得5-HMF的反應(yīng)活化能為32.11 kJ/mol，由此可見，在不同的反應(yīng)體系中，同一種物質(zhì)的反應(yīng)活化能會(huì)有所不同，陳磊在研究黃酒中5-HMF的生成動(dòng)力學(xué)時(shí)證實(shí)弱極性物質(zhì)會(huì)促進(jìn)5-HMF生成。

3 討論

一般認(rèn)為，低分子有色化合物和高分子的類黑精是發(fā)酵食品顯黑色的主要原因，5-HMF屬于低分子黑色化合物的一種，在真空硅膠柱純化收集到的21瓶洗脫液中，除第4瓶洗脫液(主要物質(zhì)是5-HMF)之外，第20瓶洗脫液，即石油醚-乙酸乙酯-甲醇(體積比=31∶31∶38)洗脫液部分也呈黑色。第20瓶洗脫液的極性大于第4瓶洗脫液極性，因此推測此部分洗脫液有可能是大分子的類黑精。然而由于類黑精成分復(fù)雜，無法對其定性定量分析，而5-HMF是一種已知的物質(zhì)，而且5-HMF的檢測方法已經(jīng)建立，研究其生成規(guī)律相對容易，因此，5-HMF用來監(jiān)控黑蒜的品質(zhì)更準(zhǔn)確和方便。此外，本實(shí)驗(yàn)以溫度為變量，pH等其他因素對黑蒜中5-HMF生成規(guī)律的影響有待進(jìn)一步研究，不過Fallico等人以溫度和pH為變量證實(shí)5-HMF生成屬于偽一級反應(yīng)，即當(dāng)pH固定時(shí)，單一以溫度為變量，5-HMF的生成屬于一級反應(yīng)。

目前關(guān)于5-HMF好壞的報(bào)道仍有較大的爭議［13－14］，因此，通過應(yīng)用黑蒜加工過程中 5-HMF 含量和加工時(shí)間的動(dòng)力學(xué)模型中的參數(shù)可以控制5-HMF的生成含量。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分離鑒定出黑蒜中的主要呈色物質(zhì)之一5-HMF，并通過不同溫度條件下的加工，測定不同時(shí)期物料的5-HMF含量，發(fā)現(xiàn)加工時(shí)間和5-HMF含量的函數(shù)關(guān)系符合一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，應(yīng)用于阿雷尼烏斯方程后得到其活化能為32.11 kJ/mol。利用這個(gè)動(dòng)力學(xué)模型可以有效控制5-HMF的生成量。例如在黑蒜加工過程中，可以通過低溫延長熟化時(shí)間來減少5-HMF含量生成，此外，也可以利用該動(dòng)力學(xué)模型可以對黑蒜成熟與否和黑蒜品質(zhì)做出評判。

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