薛焱，王同智，薛永志，劉欣媛，張東 ，李月玲，高洪波

（1.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，包頭 014060；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021)

白刺屬(Nitraria L.)是蒺藜科（Zygophyllaceae）的一個古老小屬[1]，全世界約有13種，分布廣泛，分布于亞洲、歐洲、非洲和澳大利亞的荒漠。我國有8種[2]，主要分布于我國西北部及北部各省區(qū)。在內(nèi)蒙古地區(qū)白刺資源十分豐富，分布有唐古特白刺（Nitraria tangutorum Bobr.）、西伯利亞白刺（Nitraria sibirica Pall）（即小果白刺）、齒葉白刺（Nitraria roborowskii Kom.）（即大果白刺）和球果白刺（Nitraria sphaerocarpa Maxim.）（即泡泡刺）等四種[3,4]。白刺果營養(yǎng)價值很高，其味甜帶酸，兼有葡萄和櫻桃香味，形狀、大小都類似櫻桃，故有“沙漠櫻桃”之美稱。白刺果實中含有黃酮、生物堿、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)元素等成分，藥理學(xué)研究表明白刺除具有調(diào)血脂作用外，還有調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞、抗氧化、抗疲勞、保肝及抗腫瘤抗癌等作用，其所含黃酮類和生物堿類化合物是其重要活性成分[4-6]。迄今未見對4種白刺總黃酮和生物堿類化合物的含量的比較研究，本研究以4種白刺為材料，通過其總黃酮和生物堿類化合物的含量的測定、比較和分析，希望為白刺活性物質(zhì)及白刺資源開發(fā)利用的研究提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白刺于2010年7月分別采自內(nèi)蒙古臨河境內(nèi)，經(jīng)內(nèi)蒙古大學(xué)生命學(xué)院植物教學(xué)研室鑒定為唐古特白刺、西伯利亞白刺、小果白刺和的球果白刺果實和葉片。每個區(qū)域選4種白刺分別選取20～30株生長良好的植株，在其中、上部位的東、南、西、北4個方向分別采集果實和葉，自然風(fēng)干后干燥，粉碎并過50目篩備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品鑒定所（批號：100080-200707和100040-200710）；硫酸阿托品標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品鑒定所（批號：100080-200707和100040-200710）；乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、溴甲酚綠、鄰苯二甲酸氫鉀、碳酸鈉、硫酸、氯仿 均為分析純。

UV-3010紫外分光光度計 日本島津；BS110S型電子分析天平 德國Startorius公司。

1.2.實驗方法

1.2.1 白刺總黃酮的測定 4種白刺果實總黃酮的測定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，利用紫外分光光度計進行測定，具體方法如下：

1.2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品6.05mg，置25mL容量瓶中，加70%乙醇20mL，密塞，超聲使其溶解，冷卻后加70%乙醇定容至刻度，搖勻，獲得濃度為0.242mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液[7，8]。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將濃度為0.242mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確量取0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.4mL，搖勻，放置6min，再加入10%的硝酸鋁溶液0.4mL，搖勻，放置6min，最后加入4%的氫氧化鈉溶液4mL，振搖并加水至刻度，放置15min。在200～600nm波長范圍進行吸收光譜掃描，以不加標(biāo)準(zhǔn)品同法制備空白對照，顯示在503nm處有最大吸收，因此選擇503nm為測定波長。

1.2.1.3 樣品溶液的制備及測定 精密稱取2.5g白刺樣品，以料液比1：7加入70%的乙醇，浸泡12h，加熱回流提取3次，每次2h，抽濾、合并3次濾液，并用少量70%乙醇洗滌，洗液并入濾液中，定容至50mL的容量瓶中，搖勻，作為待測原溶液。依1.2.1.2項中方法顯色，測定。

1.2.2 白刺總生物堿含量測定

1.2.2.1 溴甲酚綠緩沖液的配制及對照品溶液的配制 稱取溴甲酚綠125mg，用0.2mol/L的NaOH12.5mL溶解后，加入鄰苯二甲酸氫鉀2.55g，加少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，調(diào)pH4.42，備用。稱取在120℃干燥至恒重的硫酸阿托品對照品25.0mg，置于25.0mL容量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻。精密量取5.0mL置于100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得50.0μ g/mL對照品溶液[9]。

1.2.2.2 供試品溶液制備和測定 稱取4種白刺果實和葉片樣品各50.0g于500mL圓底燒瓶中，加300mL95%乙醇，置于80℃水浴回流提取3h，濾出提取液，再加300mL 95%乙醇同法提取 1次，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至糖漿狀。提取物用 2%硫酸溶解，合并酸水液，過濾。濾液以5%碳酸鈉堿化至pH9～10，用氯仿萃取3次，每次20mL，合并氯仿液并揮干，殘留物以2%硫酸溶解，將pH值調(diào)為7.0，加水定容于100mL容量瓶中，即得供試品溶液[10]。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別量取對照品溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于 25mL分液漏斗中，各加水至 7.0mL，加入溴甲酚綠溶液（pH=4.42）4.0mL，搖勻。再分別加入氯仿15.0mL，密塞瓶口振搖3min，靜置1h后取澄清的氯仿液，置于25mL容量瓶中，定容，搖勻。按1.2.2.2制備方法操作制備對照液、供試液和空白液，移至1cm比色池中，在200～800nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，對照品溶液和樣品溶液顯色后在418nm處均有最大吸收值，故選定418nm作為測定波長。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.結(jié)果與分析

2.1 白刺總黃酮的測定

2.1.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度實驗 取對照品溶液，按照“標(biāo)準(zhǔn)曲線”操作方法連續(xù)測定6次，結(jié)果見表1。RSD為1.66%。

表1 精密度實驗Table 1 Precision of the measured results

名稱 1 2 3 4 5 6 （mg/mL）蘆丁 0.0603 0.0598 0.0619 0.0603 0.0624 0.0609 0.0609 1.66

2.1.2 重復(fù)性實驗 照上述方法，對同一供試品溶液樣品進行5次平行試驗，結(jié)果見表2。測得RSD為1.77%，表明此方法有良好的重復(fù)性。

表2 重復(fù)性實驗Table 2 Reproducibility of the measured results

2.1.3 穩(wěn)定性實驗 在室溫條件下，將供試品溶液放置0、2、4、6、8、12h，按照上述方法進行測定，結(jié)果見表3。RSD為1.42%，說明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性實驗Table 3 Stability of the measured results

2.1.4 加樣回收率實驗 采用加樣回收法取已知含量的供試品溶液9份（三組）,分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液,依1.2.1.2項中方法顯色、測定總黃酮的含量。結(jié)果見表4，顯示平均回收率為98.84%，RSD=1.99%。

表4 總黃酮加樣回收率測試結(jié)果Table 4 Recoveries of the measured results

2.1.5 四種白刺總黃酮含量得比較

根據(jù)在503nm波長處測定其吸光度值，計算得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程C=3.9067A+0.0031，r=0.9996，顯示在0～96.8μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。測得4種白刺果實和葉中總黃酮含量如表5，經(jīng)單因素方差分析，果實中，唐古特白刺和小果白刺總黃酮含量差異顯著，小果白刺總黃酮含量最高為 1.587%，唐古特白刺含量最低為 1.376%；葉中，4種白刺總黃酮含量差異顯著，球果白刺葉的中總黃酮含量最高為 1.772%，唐古特白刺和和小果白刺次之，大果白刺含量最低。

表5 4種白刺果實和葉中總黃酮含量的比較Table5 The content of total flavonoids in leaves and fruits of N.tangutorum、N.sibirica、N.roborowskii and N.sphaerocarpa

2.2 白刺總生物堿含量測定

2.2.1 精密度實驗 取對照品溶液，按1.2.2.3測定方法進行測定，在418nm波長處重復(fù)測定5次。結(jié)果RSD=0.45%，表明本實驗使用的儀器精密性良好。

2.2.2 重復(fù)性實驗 照上述方法，對同一供試品溶液樣品進行5次平行試驗，測得RSD為1.77%，表明重現(xiàn)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實驗 在室溫條件下，將供試品溶液放置0、2、4、6、8、12h，按照上述方法進行測定，RSD為1.40%，結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 加樣回收率實驗 采用加樣回收法取已知含量的供試品溶液9份（三組）,分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液,依1.2.2.3項中方法，在418nm處測定其吸光度，結(jié)果顯示平均回收率為99.41%，RSD=1.99%。

2.2.5 四種白刺總生物堿含量得比較

根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出回歸方程是：A=0.0543C-0.0117，r=0.9992，結(jié)果顯示，當(dāng)硫酸阿托品溶液濃度在 2.0～12.0μ g/L時，濃度與吸光值有良好的線性關(guān)系。4種白刺果實和葉中總生物堿含量如表6所示，經(jīng)方差分析，4種白刺果實和葉中的總生物堿含量有顯著差異，葉的總生物堿含量顯著高于果實的。果實和葉中，都顯示唐古特白刺總生物堿含量最高為0.058%和0.152%，小果白刺次之，大果白刺和球果白刺含量低。

表6 4種白刺果實和葉中總生物堿含量的比較Table 6 The content of total alkaloids in leaves and fruits of N.tangutorum 、N.sibirica 、N.roborowskii and N. sphaerocarpa

3 討論

以硝酸鋁-亞硝酸鈉分光光度法測定總黃酮含量，采用酸堿提取法提取總堿，以硫酸阿托品為對照品，酸性染料比色法測定白刺總生物堿含量的方法，通過方法學(xué)考察，這兩種方法操作簡便，準(zhǔn)確，適合于白刺總黃酮和總生物堿含量的測定。

生物堿和黃酮類化合物是在植物體內(nèi)通過次生代謝途徑合成的次生代謝產(chǎn)物，是藥用植物的重要有效成分。在自然生長條件下，植物的種質(zhì)和遺傳適應(yīng)性是影響植物次生代謝物含量的關(guān)鍵因素[11]。所以，不同種質(zhì)必將導(dǎo)致植物次生代謝物含量的變化。通過對4種白刺的果實和葉總黃酮和總生物堿含量比較，葉中總黃酮和總生物堿的含量較高，而果實中含量較少，說明總黃酮和生物堿的積累和貯存主要是在葉中進行。小果白刺果實總黃酮含量最高，球果白刺葉的中總黃酮含量最高，而唐古特白刺總生物堿含量最高，其中小果白刺和唐古特白刺在內(nèi)蒙古分布廣泛，資源極為豐富，可選擇作為提取白刺總黃酮和生物堿的原料。本研究僅對內(nèi)蒙古臨河地區(qū)分布的 4種白刺的果實和葉總黃酮和總生物堿含量進行初步測定的結(jié)果，對這4種白刺不同地域、不同生長期和其它部位總黃酮和總生物堿的積累規(guī)律還需進一步的研究。

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