高 萌，張 賓，*，勵(lì)建榮，柳佳娜，蘇意誠(chéng)

（1.浙江海洋學(xué)院，食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316000；2.渤海大學(xué)，化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013；3.俄勒岡州立大學(xué)，海洋食品研究與教育中心，美國(guó)俄勒岡州97403）

金槍魚肉富含蛋白質(zhì)、維生素A、D和微量元素，尤其二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）等n-3多不飽和脂肪酸、蛋氨酸和?；撬岬群控S富，是國(guó)際營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)重點(diǎn)推薦的健康食品[1]。對(duì)于金槍魚加工利用，一般將其冷凍后制成凍金槍魚肉，進(jìn)而用來(lái)制成生魚片、壽司、調(diào)味及罐裝食品。金槍魚生魚片既保持了大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)又具有鮮美的滋味，因而備受廣大消費(fèi)者青睞。作為高品質(zhì)生魚片進(jìn)行食用，必須具備微生物含量低、肌肉色澤鮮艷及解凍血水汁液滲出少等條件[2]。新鮮金槍魚肉帶菌量較少，如在加工過(guò)程中采取無(wú)菌操作而制備出的生魚片，可滿足人們生食的衛(wèi)生要求。但實(shí)際在生魚片貯運(yùn)及加工過(guò)程中，遭受二次污染的機(jī)會(huì)很多，根本無(wú)法做到無(wú)菌操作，因此生魚片在未經(jīng)進(jìn)一步加工滅菌情況下被直接食用，極有可能因魚肉中的微生物超標(biāo)而引發(fā)食物中毒等多種食源性疾病[3]。

消費(fèi)者在食用生魚片時(shí)，通常以綠芥末和醬油作為殺菌佐料，認(rèn)為通過(guò)醮食方式即可起到有效殺滅微生物效果。而隨著因食用生魚片而引發(fā)的食源性疾病問(wèn)題的頻發(fā)，使得越來(lái)越多消費(fèi)者對(duì)于芥末、醬油等殺菌佐料的實(shí)際效果產(chǎn)生了疑問(wèn)[4]。崔竹梅等[5]對(duì)草魚魚片的菌落總數(shù)和菌相進(jìn)行了研究，并探討了生姜、醬油、醋等對(duì)于生魚片的殺菌效果，但其并未提出具體殺菌調(diào)味劑配方。郭姍姍等[6]采用臭氧水和二氧化氯處理脆肉鯇魚片，取得了良好減菌化效果，但此種強(qiáng)氧化劑殺菌處理方式對(duì)于魚片品質(zhì)影響較大。龔婷等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在鮮草魚片加工過(guò)程中，切片及后續(xù)浸泡工序是減少其遭受二次污染的關(guān)鍵控制點(diǎn)。

酸性電解水作為一種新興殺菌溶液，首先由日本研發(fā)成功，并被指定為一種安全的食品殺菌劑，用于殺滅金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及沙門氏菌等，效果十分顯著[8]。張向陽(yáng)等[9]采用pH2.35酸性電解水清洗鮮切胡蘿卜，在低耗水條件下即可對(duì)鮮切胡蘿卜達(dá)到顯著抑菌效果。藍(lán)蔚青等[10]的研究發(fā)現(xiàn)pH2.62、ACC為41.5mg/L的酸性電解水能在短時(shí)間內(nèi)抑制帶魚中微生物的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)明顯減緩TVBN含量的升高，可使帶魚冷藏貨架期延長(zhǎng)2～3d。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于電解水的殺菌應(yīng)用研究，絕大多數(shù)均集中在酸性較低（pH＜2.7）的電解水方面，而較低pH對(duì)于食品品質(zhì)（尤其水產(chǎn)品）、包裝運(yùn)輸材料腐蝕性大，且由于強(qiáng)酸性電解水制造成本高、受外界有機(jī)物影響較大、溶液中有效氯極不穩(wěn)定等原因，極大地限制了其應(yīng)用范圍[11-12]。關(guān)于酸性電解水在冷凍金槍魚及其生魚片制品中保鮮、殺菌應(yīng)用研究還未見(jiàn)報(bào)道。本文針對(duì)冷凍金槍魚（鰹魚，Skipjack tuna）魚片在凍藏、加工及食用過(guò)程中微生物易污染問(wèn)題，通過(guò)酸性電解水鍍冰衣技術(shù)、不同殺菌劑的殺菌效果及配方優(yōu)化研究，旨在探討冷凍金槍魚貯藏品質(zhì)保證的新方法，以及確定一種對(duì)于生魚片既能殺菌又符合口味要求的殺菌劑基礎(chǔ)配方。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚（鰹魚，Skipjack tuna） 浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司；食醋（總酸4.50～4.99g/100mL）、加飯酒（酒精度15.0%，V/V）、芥末醬（主要成分為西洋山葵和鮮山葵） 均為市售；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（MUG）等 青島拓普生物工程有限公司；大腸埃希氏菌（ATCC 25922，Escherichia coli） 廣州市微生物研究所；實(shí)驗(yàn)所用試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

FX-SASAL型電解水生成器 煙臺(tái)方心水處理設(shè)備有限公司；HS-1300型潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HWS-270型智能恒溫恒濕箱 常州越科有限公司；DF-U53V型超低溫冰箱 日本SANYO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金槍魚預(yù)處理 冷凍金槍魚（鰹魚）貯藏于-55℃超低溫冰箱中，使用前采用溫鹽水法解凍。將魚肉浸置于NaCl濃度3.0%、溫度40℃的鹽水中90s后取出，濕紗布包裹，放置于4℃冰箱中，靜置解凍12h，使魚肉內(nèi)部與表面溫度均一。解凍后魚肉進(jìn)行整理、切分，備用。

1.2.2 酸性電解水制備 濃度為0.15%NaCl溶液，在電解水生成器中進(jìn)行電解，電解條件為：電流0.2A、電壓6.3V、時(shí)間5min，獲得酸性電解水（Acidic Electrolyzed Water，AEW）。經(jīng)測(cè)定該電解水pH為4.5、氧化還原電位為836.5mV、有效氯含量為31.7mg/L。實(shí)驗(yàn)所用酸性電解水，制備后立即使用。

1.2.3 AEW鍍冰衣對(duì)于冷凍金槍魚的抑菌效果 首先將解凍金槍魚魚肉塊（10cm×5cm×5cm）置于含103cfu/mL大腸埃希氏菌溶液中1～2s（染菌），取出瀝干并于室溫下放置3h（增菌），然后置于-55℃超低溫冰箱中冷凍4h，取出立即浸沒(méi)于pH為4.5 AEW中3～5s（4℃），鍍冰衣后魚塊裝入塑料封口袋中，貯藏于-18℃冰箱中。每隔10d，測(cè)定樣品中細(xì)菌總數(shù)和大腸埃希氏菌數(shù)量。

實(shí)驗(yàn)分組：蒸餾水鍍冰衣（空白組）和酸性電解水鍍冰衣（AEW組）。

1.2.4 殺菌劑對(duì)于解凍金槍魚的殺菌效果及配方優(yōu)化 選用殺菌劑種類為食醋、芥末醬、加飯酒、AEW及（煮沸后）醬油。前期研究發(fā)現(xiàn)，所用食醋、芥末醬、加飯酒、AEW及（煮沸后）醬油樣品自身中，菌落總數(shù)均低于8cfu/g，大腸埃希氏菌均未檢出（注：未煮沸醬油本身細(xì)菌總數(shù)含量較高，因此采用煮沸殺菌處理）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，煮沸后的醬油無(wú)殺菌活性，因此以食醋、芥末、加飯酒及AEW為影響生魚片殺菌效果的主要影響因素，進(jìn)行如表1所示的4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。具體操作：在符合衛(wèi)生要求的廚房中，將解凍后金槍魚制備成生魚片（6cm×5cm×0.5cm），然后將生魚片浸沒(méi)于103cfu/g大腸埃希氏菌溶液中1～2s（染菌），取出瀝干并置于空氣中3h（增菌），再浸沒(méi)于不同殺菌劑中8～10s，取出后立即測(cè)定生魚片中菌落總數(shù)、大腸埃希氏菌的數(shù)量，優(yōu)化獲得生魚片最佳殺菌劑組合。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 微生物測(cè)定方法 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定參照GB 4789.2-2010進(jìn)行；大腸埃希氏菌測(cè)定參照GB 4789.38-2012進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)于金槍魚鍍冰衣處理、樣品細(xì)菌總數(shù)及大腸埃希氏菌的測(cè)定，均至少完成3個(gè)平行，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 AEW鍍冰衣對(duì)于冷凍金槍魚的抑菌效果

金槍魚鍍冰衣的后處理技術(shù)是為了防止魚體低溫貯藏及運(yùn)輸過(guò)程中，肌肉表面出現(xiàn)干燥、油脂外溢等干耗甚至油燒現(xiàn)象。傳統(tǒng)自來(lái)水冰衣雖可防止魚體脂類和色素的氧化，但其附著力較弱、易脫落，因此無(wú)法有效防止魚體遭受腐敗及致病微生物的侵染與繁殖。蒸餾水、AEW冰衣對(duì)于冷凍金槍魚在凍藏（-18℃）過(guò)程中抑菌效果，如表2所示。蒸餾水鍍冰衣組：0～40d凍藏期內(nèi)，魚體中細(xì)菌總數(shù)、大腸埃希氏菌數(shù)量無(wú)顯著性變化，可能是由于低溫貯藏暫時(shí)鈍化了微生物生長(zhǎng)與繁殖；隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)（80～320d），細(xì)菌總數(shù)、大腸埃希氏菌顯著性增加（p＜0.05），其原因可能是部分耐低溫菌適應(yīng)了低溫環(huán)境，且在解凍過(guò)程中恢復(fù)了一定繁殖能力，致使細(xì)菌總數(shù)、大腸埃希氏菌顯著性增加[13]。AEW鍍冰衣組：0～160d凍藏期內(nèi)，魚體中細(xì)菌總數(shù)、大腸埃希氏菌始終保持在較低范圍內(nèi)，且呈現(xiàn)出顯著降低趨勢(shì)（p＜0.05）；凍藏至320d時(shí)，魚體中細(xì)菌總數(shù)、大腸埃希氏菌有所回升，但仍顯著低于蒸餾水鍍冰衣魚肉。

表2 AEW鍍冰衣對(duì)于冷凍金槍魚的抑菌效果（-18℃）Table 2 Antibacterial effect of AEW coating ice on the frozen tuna（-18℃）

由此可見(jiàn)，AEW鍍冰衣對(duì)于冷凍金槍魚在整個(gè)貯藏期內(nèi)（0～320d）均具有顯著的抑菌效果，尤其在（0～160d）內(nèi)，可顯著降低魚肉中的微生物含量。研究發(fā)現(xiàn)，酸性電解水在溶液狀態(tài)時(shí)，由于外界光照、氧氣及加熱等作用下，易出現(xiàn)分解進(jìn)而轉(zhuǎn)變成為普通水，因此如果直接應(yīng)用，其實(shí)際殺菌作用時(shí)間相對(duì)較短[14]。此外，AEW碎冰同樣能表現(xiàn)出良好的抑菌活性，如對(duì)大腸桿菌、摩氏摩根菌等殺滅效果顯著，同時(shí)還可有效防止紅肉魚中組胺的形成與蓄積[15]。本研究中將AEW制成冷凍金槍魚的外包冰衣，在金槍魚貯藏過(guò)程中通過(guò)AEW冰中緩慢釋放的ClO-、ClO2-、O3、H2O2及[O]等活性物質(zhì)，可有效抑制細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)酶活性，并損壞細(xì)菌外層細(xì)胞膜進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡[16-17]，有效延長(zhǎng)了酸性電解水有效抑菌作用時(shí)間，因此對(duì)金槍魚在較長(zhǎng)冷凍貯藏期內(nèi)均能表現(xiàn)出良好抑菌活性。

2.2 金槍魚生魚片殺菌劑的配方優(yōu)化

2.2.1 不同殺菌劑的殺菌效果比較 食醋、芥末、加飯酒、（煮沸后）醬油及AEW對(duì)于金槍魚生魚片中細(xì)菌總數(shù)、大腸埃希氏菌殺菌效果，如表3所示。結(jié)果表明，相對(duì)于空白處理（蒸餾水），食醋、芥末及AEW均表現(xiàn)出顯著的殺菌活性，而煮沸后的醬油基本無(wú)殺抑菌活性（p＞0.05）。因此，選定食醋、芥末、加飯酒及AEW為基礎(chǔ)殺菌劑，進(jìn)行下一步的單因素及正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表3 不同菌劑對(duì)生魚片的殺菌效果Table 3 Antibacterial effect of different condiments on the tuna sashimi

2.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 染菌后魚肉于室溫下放置3h后（增菌），浸沒(méi)于不同殺菌劑中8～10s，取出后立即測(cè)定生魚片中菌落總數(shù)，結(jié)果如圖1所示。隨著食醋添加體積不斷增大，其對(duì)生魚片的殺菌效果不斷增強(qiáng)；當(dāng)食醋體積增加至8mL及以上時(shí)，殺菌效果改善作用不顯著（p＞0.05）。對(duì)于芥末的殺菌效果，隨著芥末添加量增加，其殺菌效果不斷增強(qiáng)；但考慮到生魚片在食用過(guò)程中，芥末會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激性感覺(jué)，因此在殺菌配方優(yōu)化過(guò)程中以較低添加量（1～6mL）為主要研究范圍。加飯酒的殺菌活性相對(duì)較弱，但其仍能顯著降低生魚片中細(xì)菌總數(shù)含量。對(duì)于AEW的殺菌效果，當(dāng)生魚片中添加量超多4mL后，其殺菌效果無(wú)顯著性改變（p＞0.05）。

2.2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在綜合考慮不同殺菌劑對(duì)于生魚片感官品質(zhì)影響的基礎(chǔ)上，分別以對(duì)細(xì)菌總數(shù)、大腸埃希氏菌的殺滅效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，獲得了金槍魚生魚片最佳殺菌劑組合及因素主次順序（表4）。對(duì)生魚片中細(xì)菌總數(shù)殺滅效果：食醋＞芥末＞AEW＞加飯酒，即當(dāng)食醋8.0mL、芥末1.0mL、AEW 2.0mL、加飯酒1.0mL時(shí)，制備復(fù)合殺菌劑殺菌效果最佳（A2B3C1D1）。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（3個(gè)平行）發(fā)現(xiàn)，此組合處理生魚片菌落總數(shù)為40cfu/g，殺菌效果較好。對(duì)生魚片中大腸埃希氏菌殺滅效果：食醋殺菌效果最佳，而其他3種物質(zhì)的影響情況基本相同，因此選定最佳配方組合為A1B3C1D1，即當(dāng)食醋8.0mL、芥末1.0mL、AEW 1.0mL、加飯酒1.0mL時(shí)，制備復(fù)合殺菌劑殺菌效果最佳。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（3個(gè)平行）發(fā)現(xiàn)，此組合處理生魚片大腸埃希氏菌數(shù)為50cfu/g，殺菌效果較好。

圖1 不同殺菌劑對(duì)于金槍魚生魚片的殺菌效果Fig.1 Antibacterial effect of different condiments on the tuna sashimi

由以上結(jié)果可知，對(duì)于金槍魚生魚片中微生物的安全控制，起到殺菌作用的最主要物質(zhì)為食醋和芥末。在金槍魚等各種生魚片食用過(guò)程中，保持以8.0mL食醋加入約0.1g芥末（醬）的比例，保證生魚片完全浸沒(méi)于組合殺菌劑中8～10s，即可保證生魚片食用安全。相對(duì)于食醋和芥末，加飯酒的殺菌效果有限，但在生魚片食用過(guò)程中，其可起到一定增效殺菌效果之外，更有益的是可改善生食水產(chǎn)品中的腥味問(wèn)題，因此可依據(jù)個(gè)人需求適當(dāng)（＜1.0mL）加入。AEW作為一種安全的多功能水，在生食水產(chǎn)品中同樣可起到一定輔助殺菌效果，但添加量過(guò)高（≥2.0mL）會(huì)輕微影響殺菌調(diào)味料的感官品質(zhì)，因此綜合各影響因素選定金槍魚生魚片最佳殺菌劑組合為：食醋8.0mL、0.1g芥末（醬）、1.0mL酸性電解水及少量加飯酒。AEW更為重要的應(yīng)用價(jià)值在于其對(duì)于冷凍生魚片在長(zhǎng)期凍藏過(guò)程中的抑菌作用，以及對(duì)于解凍生魚片的短期保鮮應(yīng)用（結(jié)果將另文報(bào)道）等。

此外，針對(duì)正交實(shí)驗(yàn)獲得的最佳殺菌劑組合，本研究進(jìn)而采用了風(fēng)味剖面分析法（GB12310-90），對(duì)其蘸食食用風(fēng)味進(jìn)行感官評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，金槍魚生魚片蘸食以上殺菌調(diào)味劑組合，無(wú)不良風(fēng)味和強(qiáng)烈刺激性風(fēng)味出現(xiàn)。經(jīng)消費(fèi)者嗜好感官檢驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部人員組成）發(fā)現(xiàn)，金槍魚生魚片蘸食以上殺菌調(diào)味劑可被大多數(shù)消費(fèi)者接受。

3 結(jié)論

冷凍金槍魚從解凍、加工至最后進(jìn)入消費(fèi)者口中，要經(jīng)歷很多環(huán)節(jié)和較長(zhǎng)的時(shí)間，根本無(wú)法保證整個(gè)過(guò)程的無(wú)菌操作，因此選用有效的微生物控制手段，對(duì)于保障消費(fèi)者的食用安全至關(guān)重要。本文以冷凍金槍魚（鰹魚）為原料，魚肉中細(xì)菌總數(shù)和大腸埃希氏菌為研究對(duì)象，通過(guò)酸性電解水鍍冰衣技術(shù)、不同殺菌劑殺菌效果比較及組合優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)pH4.5酸性電解水鍍冰衣在80d凍藏期內(nèi)，可顯著抑制魚肉中的微生物繁殖與生長(zhǎng)。同時(shí)，獲得了金槍魚生魚片的最佳殺菌劑組合，即食醋8.0mL、0.1g芥末（醬）、1.0mL酸性電解水及少量加飯酒，其對(duì)生魚片中的微生物殺滅效果顯著，可有效的保證消費(fèi)者的生食安全需求。

表4 細(xì)菌總數(shù)和大腸埃希氏菌數(shù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal experiment of total number of bacteria and Escherichia coli

[1]張青，王錫昌，劉源.中國(guó)金槍魚漁業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J].南方水產(chǎn)，2005，5（1）：68-74.

[2]張泓.真空冷卻紅外線脫水保鮮技術(shù)在金槍魚生魚片加工中的應(yīng)用[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2004（3）：33-34.

[3]劉弘，羅寶章，秦璐昕，等.生食三文魚片副溶血性弧菌污染的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2012，24（1）：18-22.

[4]毛雪丹，胡俊峰，劉秀梅，等.2003-2007年中國(guó)1060起細(xì)菌性食源性疾病流行病學(xué)特征分析[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2010，22（3）：224-228.

[5]崔竹梅，汪梅，蔣云升.生魚片食源性安全性評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué)，2003，24（12）：128-131.

[6]郭姍姍，榮建華，趙思明，等.臭氧水處理對(duì)冰溫保鮮脆肉鯇魚片品質(zhì)的影響[J].食品科學(xué)，2009，30（24）：469-173.

[7]龔婷，熊善柏，陳加平，等.冰溫氣調(diào)保鮮草魚片加工過(guò)程中的減菌化處理[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（1）：111-115.

[8]Issa-Zacharia A，Kamitani Y，Tiisekwa A，et al.In vitro inactivation ofEscherichia coli，Staphylococcusaureusand Salmonella spp.using slightly acidic electrolyzed water[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2010，110（3）：308-313.

[9]張向陽(yáng)，王丹，馬越，等.應(yīng)用酸性電解水清洗鮮切胡蘿卜的節(jié)水效果[J].食品工業(yè)科技，2013，34（6）：130-133.

[10]藍(lán)蔚青，謝晶.酸性電解水與溶菌酶對(duì)冷藏帶魚品質(zhì)變化的影響[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42（1）：100-105.

[11]謝軍，孫曉紅，潘迎捷，等.酸性電解水及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2010，31（2）：366-373.

[12]龔泰石.酸性電解水的制備與消毒[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2001，17（3）：283-284.

[13]白鳳翎，馬春穎，孫建華.冷凍食品解凍方式對(duì)細(xì)菌數(shù)量影響的研究[J].食品工業(yè)科技，2004，25（1）：53-54.

[14]莊琳懿.酸性氧化電位水的產(chǎn)生條件與作用的初步研究[D].上海：同濟(jì)大學(xué)，2007.

[15]Phuvasate S，Su YC.Effects of electrolyzed oxidizing water and ice treatments on reducing histamine-producing bacteria on fish skin and food contact surface[J].Food Control，2010，21：286-291.

[16]Mahmoud BSM，Yamazaki K，Miyashita K，et al.Preservative effect of combined treatment with electrolyzed NaCl solutions and essential oil compounds on carp fillets during convectional air-drying[J].International Journal of Food Microbiology，2006，106（3）：331-337.

[17]Huang YR，Hung YC，Hsu SY，et al.Application of electrolyzed water in the food industry[J].Food Control，2008，19：329-345.