李琳琳，曹新志，劉 芳，趙迎慶，任林生

（四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000）

絲素蛋白具有良好的生物相容性，無毒，無刺激性，極小的炎癥反應(yīng)性。但是由于絲素蛋白的相對分子質(zhì)量比較大，且結(jié)構(gòu)比較致密，故而在應(yīng)用上受到很大的限制。不過作為蛋白質(zhì)，絲素蛋白具有一定的生物降解性，其降解產(chǎn)物本身不僅對組織無毒副作用，還對皮膚、牙周組織等有營養(yǎng)與修復的作用[1]。絲素肽是絲素蛋白的水解產(chǎn)物，極易被人體吸收，消化率較絲素蛋白大大提高，且具有降低血液膽固醇、促進酒精代謝、降低血壓、促進胰島素分泌及預防老年性癡呆癥等生理功能[2-3]。絲素肽不僅具有食用價值，而且具有藥用價值，因此作為功能食品因子開發(fā)具有廣闊的應(yīng)用前景。

高效液相色譜法（HPLC），尤其是反相高效液相色譜（RP-HPLC）以其獨特的優(yōu)勢，已經(jīng)成為當下許多研究肽類或蛋白質(zhì)的實驗室的主要分離分析手段。王惠珍等[5]用HPLC分析了轉(zhuǎn)移因子多肽的分布情況，并對色譜條件進行了反復的探索。忻余等[6]用HPLC測定了尿多酸肽注射液中小分子肽的相對分子質(zhì)量，實驗結(jié)果證明尿多酸肽注射液中的小分子肽的相對分子質(zhì)量均在104Da以下，且重現(xiàn)性好。張根生等[7]采用超濾法結(jié)合凝膠過濾色譜法，測定了雞蛋蛋白水解產(chǎn)物中肽相對分子質(zhì)量的分布情況，證明了雞蛋蛋白質(zhì)水解多肽相對分子質(zhì)量是連續(xù)分布的，并分別測出了各個相對分子質(zhì)量范圍的多肽所占的百分比。陳棟梁等[8]用HPLC測定了卵清蛋白肽的相對分子質(zhì)量范圍，并對卵清蛋白肽的理化性質(zhì)及對免疫功能的調(diào)節(jié)作用進行了研究。本文采用RP-HPLC法測定蠶絲蛋白水解液中多肽組份相對分子質(zhì)量的分布情況是基于其相對分子質(zhì)量的對數(shù)與色譜峰的保留時間存在一定的相關(guān)性，旨在為進一步擴大絲素肽在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇（色譜純）、KH2PO4（分析純）、丙氨酸（生物試劑） 成都科龍化工試劑廠；硫酸 分析純，重慶川東化工有限公司；脫膠蠶絲 四川理工學院食品與生物技術(shù)應(yīng)用研究所；活性炭 分析純，天津市福晨化學試劑廠；高效液相色譜所用的四種標準品分別是胰島素（分子量5808u，SIG MA公司）、酵母核糖核酸（分子量330u，上海華藍化學科技有限公司）、桿菌肽（分子量1422u，南京生利德生物科技有限公司）、還原性谷胱甘肽（分子量307u，BIO-RAD公司）。

Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng) 包括手動進樣系統(tǒng)，真空透膜脫氣，高穩(wěn)定性二元泵，二極管陣列及示差檢測器，柱溫箱：低于環(huán)境10～80℃，±0.15℃，色譜條件：色譜柱為C18，流動相為甲醇∶ KH2PO4=50: 50，柱溫為30℃，檢測波長為254nm，流速為0.6mL/min，進樣量10μL，美國AGILENT公司。

1.2 試劑及溶液的配制

0.005 mol/L的KH2PO4的配制，準確稱取0.6804g KH2PO4，然后用適量的雙蒸水溶解，用1000mL容量瓶定容至刻度線。100μg/mL的胰島素溶液、酵母核糖核酸溶液、桿菌肽溶液和還原性谷胱甘肽標準儲備溶液的配制：分別準確稱取0.01g的胰島素、酵母核糖核酸、桿菌肽和還原性谷胱甘肽，用適量雙蒸水溶解，然后用100mL容量瓶定容至刻度線，既得濃度為100μg/mL的標準胰島素溶液、酵母核糖核酸溶液、桿菌肽溶液和還原性谷胱甘肽溶液，將配好的溶液置于4℃冰箱中備用。分析測試時，用移液管準確移取一定量的四種標準溶液的儲備液，經(jīng)逐級稀釋而配制成濃度為100、10、1、0.1μg/mL的標準分析液?？瞻锥嚯娜芤?，用胰島素經(jīng)單寧酸處理而制得。

1.3 樣品的處理

根據(jù)每克脫膠蠶絲水解所得到的絲素肽的量，由單因素試驗得到正交試驗L9(34)所需的因素水平，從而進一步優(yōu)化試驗條件。將脫膠后的廢蠶絲用硫酸水解，然后經(jīng)過氧化鈣水溶液沉淀除鹽、脫色以及抽濾等步驟制成絲素肽溶液，進樣前用0.45μm的濾膜過濾。單因素試驗四個因素的因素水平設(shè)計分別是：硫酸濃度依次設(shè)定為20%、25%、30%、35%和40%；固液比依次設(shè)定為1:20，1:30，1:40，1:50和1:60；水解溫度依次設(shè)定為70℃、80℃、90℃、100℃和110℃；水解時間依次設(shè)定為6h、7 h 、8 h 、9 h 和10 h。1～9號試驗均取1.0g脫膠的廢蠶絲進行水解。正交試驗設(shè)計的具體的處理條件見下表1所示：

表1 正交試驗L9（34）的設(shè)計[4]Table 1 Design of orthogonal test L9（34）

1.4 多肽含量的測定方法

用30-35%的優(yōu)質(zhì)生石灰水溶液的上清液滴定不同條件水解過的脫膠蠶絲至pH6.5-7.0，靜置30min后抽濾，然后加入活性炭進行脫色處理，脫色液與活性炭的混合比為100∶5（V/W），混合后在磁力攪拌器上脫色1h，經(jīng)抽濾后，用去離子水定容至250mL。取不同處理條件的水解液50mL，25℃條件下，用三倍體積的15%的單寧酸沉淀5min，在10000r/min的離心機中離心30min。用茚三酮顯色法測定上清液中游離氨基酸的含量，其條件為在25mL比色管中依次加入5.0mL上清液，2.0mL茚三酮溶液，2.0mL抗壞血酸溶液，5.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖液，用蒸餾水定容至刻度線，測定569nm處的吸光值，對照標準曲線測定游離氨基酸的濃度，得出上清液中游離氨基酸的含量A[9-11]。用自動凱氏定氮儀測定上清液中總氮的含量，然后減去上清液中游離氨基酸的含量既得多肽的含量。

1.4.1 氨基酸標準曲線的制作 在6支25mL的比色管中分別加入0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL的丙氨酸標準溶液，之后依次加入2.0mL茚三酮溶液，2.0mL抗壞血酸溶液，5.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加去離子水至25mL，搖勻。置于沸水浴中加熱20min，進行顯色取下冷卻，定容。測定569nm處的吸光值，以丙氨酸標準溶液的含量為橫坐標，以對應(yīng)的氨基酸標準溶液的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量的計算 凱氏定氮后蛋白質(zhì)的計算公式如下式所示：

式中：W為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度,g/100mL；C為鹽酸標準液的濃度，mol/L；V1為空白滴定消耗的標準鹽酸的體積，mL；V2為樣品消耗滴定消耗的標準鹽酸的體積，mL；2為取蠶絲水解液樣品的體積，mL；M氮為氮的摩爾質(zhì)量14.01g/mol；6.25為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

1.4.3 多肽含量的計算

式中，T為多肽的含量，A為游離氨基酸的含量。最終結(jié)果精確到小數(shù)點后兩位。

1.5 多肽相對分子質(zhì)量的測定方法

本試驗分別探索了液相色譜所用的流動相、波長、流速的具體條件，并依據(jù)所選定的色譜條件，測定標準多肽的分子量，制作了標準多肽的標準曲線及回歸方程。

1.5.1 流動相及波長的選擇 多肽或蛋白質(zhì)的液相色譜所用的流動相通常是含酸性或中性介質(zhì)的甲醇-水或乙腈-水或甲醇與緩沖鹽溶液[12-16]。在測定蛋白質(zhì)或多肽時，如果出峰效果不理想，可以在流動相中加入少量的三氟乙酸、乙酸或甲酸以改善出峰效果[17-18]。本試驗分別以甲醇-水，乙腈-水，甲醇- KH2PO4為流動相，并用乙酸調(diào)節(jié)各流動相的pH，使其pH在6.5左右，設(shè)定柱溫30℃，流速0.6mL/min，進樣量10μL，并設(shè)定各個流動相的不同洗脫條件進行全波長掃描，測定其出峰效果，以得出準確的出峰效果良好的色譜條件。

1.5.2 流速的選擇 在波長為254nm，流動相為甲醇: KH2PO4=50: 50，柱溫為30℃，進樣量為10μL的條件下，設(shè)定流速分別為1.0、0.8、0.6mL/min，測定其出峰效果。

1.5.3 多肽的標準曲線與回歸方程 本試驗采用外標法，將已配好的還原性谷胱甘肽、桿菌肽、酵母核糖核酸、胰島素四種標準液按1∶ 1∶ 1∶ 1的比例混合均勻，在流動相為甲醇: KH2PO4=50: 50，波長為254nm，流速為0.6mL/min，柱溫為30℃的色譜條件下，進樣量10μL，記錄各標準品的色譜峰的保留時間，重復進樣4次。以還原性谷胱甘肽、桿菌肽、酵母核糖核酸和胰島素的相對分子質(zhì)量的常用對數(shù)log(MW)對其色譜峰的保留時間（t）繪制標準曲線，得出回歸方程。在與標準樣液相同的色譜條件下進絲素肽的樣，記錄絲素肽樣品的色譜峰的保留時間，對照回歸方程計算出樣品的相對分子質(zhì)量。

1.6 方法的線性范圍及靈敏度

將一系列濃度為0.1-100μg/mL的混合標準樣品進樣分析，考察方法的線性范圍。檢出限（LOD）以信噪比為（S/N）為3來計算，定量限（LOQ）為10來計算。

1.7 方法的精密度與準確度

用空白加標法測定方法的精密度和準確度，分別準確量取2.0g空白胰島素溶液于3個10mL比色管中，再分別準確移取1.0mL濃度為100、10、1μg/mL的胰島素標準樣品于比色管中，用甲醇分別將其溶解并定容至刻度，配制成每克空白胰島素溶液中分別加入100、10、1μg的標準品的加標樣液。將空白胰島素溶液和加入三個水平胰島素標準樣品的多肽樣品分別重復五次，測定其重復性及回收率。

2 、結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸的標準曲線

用茚三酮顯色法測得的游離氨基酸的回歸方程為y = 0.0335x - 0.0002，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9996，由相關(guān)系數(shù)可知氨基酸濃度在0～25μg/mL范圍內(nèi)，其吸光度與氨基酸的濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.2 蠶絲蛋白水解工藝條件優(yōu)化

2.2.1 單因素實驗結(jié)果分析 由單因素實驗得，在水解時間為7h～9h范圍內(nèi)多肽含量隨時間的延長而不斷提高，超過9h后，多肽的得率開始降低（圖1）；在固液比為1:30～1:50范圍內(nèi)多肽的得率隨固液比的增大而不斷提高，超過1: 50后多肽含量開始降低（圖2）；在溫度為80～100℃范圍內(nèi)多肽的得率隨溫度的升高而不斷提高，超過100℃后，多肽含量開始降低（圖3）；在硫酸濃度為25%～35%范圍內(nèi)多肽的得率隨硫酸濃度的增大而不斷提高，超過35%后多肽含量開始降低（圖4）。即選定的正交試驗的因素水平分別為硫酸濃度為25%、30%和35%，固液比分別為1:30、1:40和1:50，水解溫度分別為80、90和100℃，水解時間分別為7、8和9h。(下面的圖為添加的內(nèi)容)

圖1 水解時間對多肽含量的影響Figure 1 The effect of time of hydrolysis on yield of peptide

圖2 固液比對多肽含量的影響Figure 2 The effect of ratio of material and acid on yield of peptide

圖3 溫度對多肽含量的影響Figure 3 .The effect of temperature on yield of peptide

圖4 硫酸濃度對多肽含量的影響Figure 4 The effect of concentration of sulfuric acid on yield of peptide

2.2.2 正交實驗結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗確定的因素水平范圍，采用四因素三水平即L9(34)進行正交試驗方案設(shè)計，得到的正交試驗結(jié)果如表2，3所示，由正交試驗結(jié)果分析得優(yōu)方案為A2B2C1D2，即固液比為1:40，硫酸濃度為30%，水解溫度為100℃，水解時間8h。由于通過正交試驗結(jié)果分析所得的最優(yōu)試驗方案不在所做過的試驗里，所以本研究又按所得到的優(yōu)方案的條件進行了試驗，根據(jù)此方案制得的蠶絲多肽的得率為81.4%，比正交表中已有的最優(yōu)試驗號5號高，所以最終所選方案為

A2B2C1D2。

表2 正交試驗L9（34）結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test L9（34）

表3 試驗結(jié)果分析表Table 3 Analysis of test results

因素主次 A > B > C > D優(yōu)方案 A2B2C1D2

2.3 液相色譜條件的選擇

2.3.1 流動相及波長的選擇 由實驗可知，在柱溫30℃，流速0.6mL/min，進樣量10μL的條件下，以甲醇- KH2PO4為流動相，且甲醇∶ KH2PO4=50: 50，波長為254nm時其出峰效果是最好的，見圖5。故本試驗選擇的流動相為甲醇: KH2PO4=50: 50，波長為254nm的色譜條件。

圖5 流動相為甲醇:KH2PO4=50:50時標準品的色譜圖Figure 5 The chromatography of standard in the mobile phase, methanol: KH2PO4 = 50: 50

2.3.2 流速的選擇 經(jīng)實驗可知在波長為254nm，流動相為甲醇: KH2PO4=50: 50，柱溫為30℃，進樣量為10μL的條件下，當流速為0.6mL/min時，色譜峰峰形和分離效果較好，見圖6，故本試驗選用流速為0.6 mL/min。

圖6 流速為0.6 mL/min時標準品的色譜圖Figure 6 The chromatography of standard when the flow rate was 0.6mL/min

2.4 多肽的標準曲線與回歸方程

經(jīng)實驗測得的胰島素的色譜峰的保留時間為2.671min，酵母核糖核酸的為4.734min，桿菌肽的為5.53min，還原性谷胱甘肽的為7.994min。由標準蛋白質(zhì)的回歸方程log(MW)=-0.2401t + 4.4122，R2= 0.9993可知，蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量的常用對數(shù)與其色譜峰保留時間具有良好的線性關(guān)系，因此可作為相對分子質(zhì)量測定的標準曲線。標準色譜圖如圖7所示：

圖7 標準蛋白質(zhì)的色譜圖Figure7 Chromatogram of standard protein

2.5 方法的線性范圍及靈敏度

通過對一系列濃度的混合標準樣品進樣分析，得到實驗方法的線性范圍及檢測限和定量限，結(jié)果見表4，可看出各種標準品在線性范圍內(nèi)均有很好的線性相關(guān)性，方法的靈敏度較好，定量限小于1.10μg/mL，檢出限小于0.23μg/mL。

表4 標準品的線性范圍、檢出限、定量限Table 4 The linear range ,detection limit and quantitative limit of standard

2.6 方法的精密度與準確度

通過空白加標法測得的方法的精密度和準確度的結(jié)果見下表5，由表可知，此方法有較好的精密度和準確度，各標準樣品的相對標準偏差范圍為2.1-9.7%，回收率范圍在81.9-101.6%，達到了痕量物質(zhì)的分析要求

表5 方法的重復性及回收率Table 5 Reproducibility and recoveries of method

注：表中1、2、3、4分別代表還原性谷胱甘肽、桿菌肽、酵母核糖核酸和胰島素；n.d.=未檢測出

2.7 絲素肽相對分子質(zhì)量的測定結(jié)果

用本試驗選定的流動相為甲醇: KH2PO4=50: 50，波長為254nm，流速為0.6mL/min的色譜條件，對蠶絲蛋白水解液進行液相色譜測定，圖8為蠶絲蛋白水解液中多肽組分的色譜圖。由圖可知，本實驗建立的色譜條件能使蠶絲蛋白水解液中的多肽組分得到較好分離，蠶絲蛋白水解液中的多肽組分的保留時間與標準品的保留時間吻合，其色譜峰的保留時間范圍為3.699-5.487min，對照標準曲線，得到其分子量范圍為1281-3477 u。

圖8 蠶絲蛋白水解液中多肽組分的色譜圖Figure 8 The chromatography of polypeptide components in silk protein hydrolysis

3 結(jié)論

本試驗采用高效液相色譜法分析測定蠶絲蛋白水解液中多肽的相對分子質(zhì)量范圍，所用的標準物質(zhì)均為多肽，因此其色譜條件是一致的，從而保證試驗結(jié)果的有效性和準確性。功能性小分子肽的界限劃分迄今未有明確的定義，目前報道的生物活性肽主要是小分子肽，相對分子質(zhì)量大多在3000u以下。目前國內(nèi)外熱點研究的也是相對分子質(zhì)量（Mr）都在3000u左右的小分子肽[19]，此外有研究證明小腸更容易吸收二肽和三肽[20]，而由圖8可知，本試驗所測得的絲素蛋白水解液中絲素肽的相對分子質(zhì)量范圍大多數(shù)集中在3500u以下，且相比于其他組試驗，最優(yōu)方案5號試驗中多肽組分的相對分子質(zhì)量更集中，成分比較簡單。此外由于本試驗所用的標準品的相對分子質(zhì)量范圍為307 ～5808u，因此，對于色譜圖中出現(xiàn)的低于300u的成分的相對分子質(zhì)量的測定僅提供參考。此研究為蠶絲蛋白水解制備絲素肽提供了有力的科學依據(jù)，同時為其它多肽類物質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定提供參考。鑒于高效液相色譜法所用樣品量少且速度快的優(yōu)點，高效液相色譜法已被越來越廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定中。

[1]楊立群,楊丹,孟舒等.絲素蛋白作為藥物緩釋載體的研究進展[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù),2009,4(6):449-451.

[2]程輝銘譯.絲素的食品化及其功能性[J].國外絲綢,1994, (1):2-7.

[3]周鳳娟,許時嬰,楊瑞金等.納濾技術(shù)在絲素活性肽生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 膜科學與技術(shù),2008, 28(3):83-85.

[4]李云雁,胡傳榮.試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理[M].第二版.北京:化學工業(yè)出版社,2012:124-128.

[5]王惠珍,解軍,牛勃等.高效液相色譜法分析轉(zhuǎn)移因子多肽分布[J].山西醫(yī)科大學學報,2000,31(1):95-96.

[6]忻余,徐康森.高效液相色譜法測定尿多酸肽注射液中小分子肽的分子量[J].藥物分析雜志,2001,21(3):191-193.

[7]張根生,徐倩,費英敏等.雞蛋蛋白質(zhì)水解多肽分子量分布的研究[J].哈爾濱商業(yè)大學學報,2002,18(5):554-555.

[8]陳棟梁,劉莉,唐良艷等.卵清蛋白肽對小鼠機體的免疫增強作用[J].食品科技,2006, (1):219-223.

[9]黃威娜，楊勇，林苗.分光光度法測定絲肽液中氨基酸總含量[J].香精香料化妝品,2011（3）：35-38.

[10]鄒龍，李仲秋，劉輝等.茚三酮比色法測乙肝寧水提物中總游離氨基酸含量[J].贛南醫(yī)學院學報，2012,32（2）：161-164.

[11]GB/T 14965-1994.食物中氨基酸的測定方法[S].

[12]陳俊,萬紅梅,潘志明等.高效液相色譜法測定骨髓蛋白粉的蛋白質(zhì)系數(shù)[J].肉類研究,2010, (7):54-56.

[13]鄧芹英.高效液相色譜法測定油菜籽蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中的氨基酸[J].分析化學,1990,18(8):763-765.

[14]董愛軍,楊鑫,張英春等.高效液相色譜法分離測定牦牛乳中的8種蛋白質(zhì)[J].分析測試學報,2012,32(8):972-976.

[15]盧鶴,鄭永杰.高效液相色譜法分離大豆蛋白肽[J]. 齊齊哈爾大學學報,2006,22(2):1-3.

[16]董轉(zhuǎn)年,龔秀會,彭波等.天麻多肽的分離純化研究[J].生物技術(shù),2007,17(6):56-58.

[17]QIAN Yuwei, KEN Preston, OLEG Krokhin, et a1.Characterization of Wheat Gluten Proteins by HPI C and MALDI TOF Mass Spectrometry[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2008, 19 (10):1547-1550.

[ 18]GAN Bin-bin. Determination of gastrodin in food by HPLC[ J]. Technol Dev Chem, 2005, 34(2): 33-34.

[19]謝正軍.苜蓿葉蛋白和酶法制備抗氧化肽的研究[D].江蘇省無錫市.江南大學.2009.

[20]于志鵬, 趙文竹, 于一丁等.蛋清蛋白質(zhì)降壓肽純化及分子量測定[J].食品工業(yè)科技，2010，(7):230-232.