紀 偉 徐 濤 劉 貝

①副研究員，②研究員，③博士研究生，中國科學院生物物理研究所，北京 100101

光學超分辨熒光顯微成像
——2014年諾貝爾化學獎解析

紀 偉①徐 濤②劉 貝③

①副研究員，②研究員，③博士研究生，中國科學院生物物理研究所，北京 100101

超分辨成像；受激發(fā)射損耗顯微鏡；光敏定位顯微鏡

超分辨成像顯微鏡的出現(xiàn)為現(xiàn)代生物醫(yī)學研究提供了新的強有力的工具，將熒光顯微鏡的應用推到了新的高度。2014年諾貝爾化學獎授予了Eric Betzig、Stefan Hell以及William Moerner三位科學家，以表彰他們在“發(fā)展超高分辨熒光顯微鏡”上的貢獻。他們的獲獎肯定了化學生物物理多學科交叉對于當今前沿科技發(fā)展的重要性。本文主要介紹了超分辨熒光顯微成像誕生的歷史背景，以及各成像技術的發(fā)生發(fā)展過程，最后對此技術的未來發(fā)展做了展望。

圖1 從左至右依次為Eric Betzig、Stefan Hell以及William Moerner(圖片摘自http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2014/)

近日瑞典皇家科學院宣布將2014年諾貝爾化學獎頒給美國霍華德?休斯醫(yī)學研究所的Eric Betzig、德國馬普生物物理化學研究所的Stefan Hell以及美國斯坦福大學的William Moerner (圖1)，以表彰他們在“發(fā)展超高分辨熒光顯微鏡”上的貢獻。歷史上，諾貝爾獎已經(jīng)多次頒發(fā)給了與生物醫(yī)學成像相關的研究，包括電子顯微成像、CT成像、核磁共振成像等等，但是像光學超分辨熒光成像這樣從理論證實、實驗證明再到推廣，僅僅過去十多年時間便獲得諾貝爾獎青睞的實屬少見，這也足見此項技術的重要性。

在過去的一百多年間，德國物理學家Ernst Abbe的發(fā)現(xiàn)都堅不可摧，即：受光學衍射限制，顯微鏡無法分辨兩個相距小于發(fā)射波長一半的物體[1]。由于衍射，一個點光源在通過透鏡系統(tǒng)后，都會以艾里斑的形式存在(圖2(a))。具體來講，顯微鏡的分辨率可由公式d=λ/(2NA)表征，λ表示發(fā)射光波長，NA表示物鏡的數(shù)值孔徑(圖2(b))。這一理論終于在20世紀末受到了前所未有的挑戰(zhàn)并被打破，形成了現(xiàn)今在生物成像領域廣泛應用的三類超分辨熒光成像技術，包括受激發(fā)射損耗(stimulated emission depletion, STED)技術[2-4]、結構光照明顯微鏡(structured illumination microscopy, SIM)技術[5-6]以及基于單分子定位的超分辨成像技術——光激活定位顯微鏡(photo-activation localization microscopy, PALM)[7]和隨機光學重構顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)[8]。STED技術和SIM技術通過不同方法調制系統(tǒng)的點擴散函數(shù)(point spread function, PSF)實現(xiàn)了超分辨成像，而PALM/STORM技術則是采用犧牲時間換取空間頻率的策略利用單分子成像加上圖像重構算法實現(xiàn)分辨率的提升。本次獲獎的Stefan Hell教授是STED技術的發(fā)明人，他于1994年提出利用量子光學中的受激輻射耗竭理論能夠突破衍射極限。Eric Betzig與William Moerner則是基于單分子定位實現(xiàn)超分辨成像技術的奠基者，前者于1995年提出了單分子定位的概念[9]，并在2006年實現(xiàn)了PALM顯微鏡[7]；后者則是開創(chuàng)了單分子光譜學[10]，并首次在單分子尺度上觀測了熒光蛋白的光激活和光閃爍性質[11]，為PALM/STORM技術的實現(xiàn)奠定了基礎。

遺憾的是，另外一個目前廣泛應用的超分辨光學成像技術——SIM的發(fā)明人Mats Gustafsson博士于2011年英年早逝，與此次諾貝爾獎失之交臂。

圖2 (a)光學衍射和艾里斑；(b)受瑞利準則的約束，普通顯微鏡的分辨率只能達到d=0.61λ/NA，假設光波長500 nm，數(shù)值孔徑為1，則分辨率約為300 nm(圖片摘自http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/resolution.html)

1 受激發(fā)射損耗顯微鏡

機遇總是會留給有準備的人。Stefan Hell博士一直是一位勇于挑戰(zhàn)權威的人，他很早就意識到光學極限遲早是要被打破的，而他最初只是腦海中有粗略的概念卻缺乏具體實現(xiàn)的理論支持。他在博士及博士后期間對4Pi顯微鏡的研究，算是其向突破衍射極限邁出的第一步，或許那時的他已清楚明白通過調制系統(tǒng)的點擴散函數(shù)的方法能夠逼近甚至突破衍射極限。他思考并嘗試了無數(shù)種突破衍射極限的方法，最終量子光學中“受激發(fā)射”現(xiàn)象吸引了Hell的注意。我們知道熒光是指處于基態(tài)的熒光基團吸收光子后躍遷到激發(fā)態(tài)，并在弛豫一段時間后以發(fā)光的形式放出熱量回到基態(tài)；而“受激發(fā)射”是指那些受到激發(fā)的準備發(fā)熒光的熒光基團能夠暫時性的被轉化到關閉態(tài)(圖3(a))。Hell博士迅速地構建了基于受激發(fā)射理論的顯微鏡原理圖(圖3(b))，并且意識到有可能將分辨率推進到30 nm——傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡分辨率的1/10，而計算機模擬的結果同樣支持他的構想。遺憾的是，Hell的工作起初并沒有引起科研界的重視，尤其是在生物成像領域，STED的發(fā)展也因此沉寂了數(shù)年之久。直到2000年，Hell在《美國科學院院刊》上發(fā)表文章，第一次實現(xiàn)了基于STED技術的顯微鏡，并得到了納米級的熒光圖像，至此STED技術才引起科研界重視，而STED技術的發(fā)展也進入了快車道。從技術層面講：雙色STED的出現(xiàn)擴展了STED顯微鏡的應用范圍[12]；采用連續(xù)光激光器極大降低了STED顯微鏡的成本[13]；高速STED技術使得科研人員能夠在高分辨率下觀察細胞動態(tài)過程[14]；RESOLFT將STED的概念拓展到更普適的高度[15]。Hell對于突破衍射極限的執(zhí)著追求造就了STED技術的問世，而后引領的STED技術的發(fā)展和推廣熱潮成就了STED技術在超分辨成像領域的一席之地。

圖3 (a)熒光基團實現(xiàn)飽和光轉化的能級示意圖；(b) STED原理示意圖：激發(fā)光和STED光經(jīng)過準直耦合后同時照在樣品上，STED光束所產(chǎn)生的saturated depletion效應將激發(fā)區(qū)域限制在非常小的區(qū)域，從而實現(xiàn)超分辨成像(圖片摘自http://www. nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2014/advanced.html)[16]

2 基于單分子定位的超分辨顯微鏡

物理學出身的Betzig一直癡迷于新型成像技術的開發(fā)，突破衍射極限同樣也是他的終極目標。早在貝爾實驗室工作期間，他就發(fā)明了近場掃描光學顯微鏡(near-field scanning optical microscopy, NSOM)[16]，并且利用它觀察到了單分子熒光[17]。雖然從原理上講NSOM也突破了傳統(tǒng)的光學衍射極限，但是近場成像分辨率依賴于探針與樣品間的距離，所以僅能進行表面成像，應用非常局限。1995年，Betzig于《光學快報》上的一篇文章中首次提及了利用單分子定位的概念(圖4(a))理論上能夠達到近似分子精度的分辨率水平[9]。2002年Jennifer Lippincott-Schwartz首次報道了具有光激活性質的熒光蛋白PA-GFP[18]?？茖W家的嗅覺使得Eric迅速意識到PA-GFP是實現(xiàn)超分辨成像的前提要素。于是供職于工業(yè)界頂級實驗室的Betzig再也按捺不住，在Hess教授的幫助下再次回到科研界，并于2006年在《Science》雜志上發(fā)表文章正式提出了光激活定位超分辨顯微鏡[7]，至此開啟了通往超分辨成像的另外一扇大門。幾乎與此同時，華人科學家莊小威利用類似原理，在《Nature Methods》雜志上提出了STORM的概念[8]。PALM/STORM均是通過對熒光分子的激活—定位—漂白三個步驟加之數(shù)萬次的循環(huán)最終重構出超分辨圖像(圖4(b))。相比于STED技術，PALM/STORM在實現(xiàn)上更簡單且成本更低，多色PALM成像、三維PALM成像、活細胞PALM成像以及厚樣本PALM成像相繼誕生，并且在生物學研究中迅速普及開來。Betzig開啟了單分子超分辨成像的先河，卻沒有將視野局限于此。傳統(tǒng)的PALM技術利用全內反射照明樣品，成像深度很淺，而片層光照明(light sheet illumination)技術擁有光毒性小、低背景噪聲和兼容厚組織成像等諸多優(yōu)勢。Betzig在片層光照明的概念下先后發(fā)展了Bessel光照明技術[19]和Lattice light-sheet照明技術[20]，并且在世界頂級雜志《Nature Methods》和《Science》上先后發(fā)表文章闡述其實現(xiàn)方法和應用，后者更是在組織細胞上實現(xiàn)了PALM成像。

圖4 (a)單分子定位的原理：單分子信號可以通過高斯擬合的方法進行精確定位，其定位精度取決于每個單分子發(fā)出的光子數(shù)(N)；(b)基于單分子定位的超分辨成像的流程圖：采用高靈敏度的CCD/sCMOS記錄下稀疏的單分子信號，通過圖像識別算法分割出每個單分子，再通過擬合算法精確定位出每個單分子的位置，最終重構出超分辨圖像。(圖片摘自http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2014/advanced.html)

Moerner教授雖然沒有直接提出超分辨成像的概念，卻是第一個觀察到單分子并對單分子性質進行詳細測量的科學家。長久以來，科學家們通過化學方法來進行測量吸收或者熒光，都是研究的數(shù)百萬分子的平均效應。1989年，還在IBM工作的Moerner教授第一次在超低溫下(4 K)觀測到了單個分子的吸收光譜[10]。這項先驅性的工作開啟一個全新的科研領域——單分子光譜學，同時也啟發(fā)了無數(shù)科學家將更多的注意力轉向了單分子研究，而這其中最著名的一個或許就是Eric Betzig了。1997年，Moerner加入加州大學San Diego分校，在那里他結識了后來同樣是諾貝爾獎得主的錢永健并了解了剛開始廣泛應用的GFP蛋白[21]。Moerner發(fā)現(xiàn)GFP的一個變種的熒光狀態(tài)能夠被不同波長的光調制，即：當用488 nm的激光激發(fā)蛋白時，GFP開始發(fā)光緊接著被淬滅；而在被紫外光照射后，GFP又能重新回到能夠發(fā)光的狀態(tài)。Moerner闡明了一種利用光來控制單分子熒光的方法，這也解決了Eric Betzig在兩年前已經(jīng)用公式證明了的一種成像方法的實現(xiàn)上的難題。Moerner同時發(fā)現(xiàn)GFP分子自身能夠在on態(tài)和off態(tài)之間轉換(blinking)，這種blinking現(xiàn)象同樣也是通往超分辨成像的途徑之一[11]。

3 展望

超分辨顯微成像技術在問世十多年之后便迅速獲得了諾貝爾獎，足見其對化學領域尤其是生物學領域的重大影響。時至今日，三大超分辨成像技術的理論基礎已比較完備，但是其應用范圍與普通共聚焦顯微鏡相比還有很大差距，因此此次諾貝爾獎的頒發(fā)勢必會引起更多化學家、生物學家的重視，將更多的科研興趣和研究重點投入超分辨顯微成像技術上來。高昂的裝備和維護費用也是影響超分辨成像技術推廣的重要制約因素。綜上所述，筆者認為今后新的突破勢必將會集中在：

(1) 上游新型熒光標簽的改造；

(2) 針對原有技術的多模態(tài)擴展；

(3) 針對最前沿生物學、醫(yī)學問題的有效應用；

(4) 成像流程和圖像分析技術的普及和簡化，系統(tǒng)成本的降低。

(2014年11月16日收稿)

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Super-resolution fluorescent microscopy: A brief introduction to the Nobel Prize in Chemistry 2014

JI Wei①, XU Tao②, LIU Bei③
①Associate Professor, ②Professor, ③Ph. D. Candidate, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101

Super-resolution fluorescent microscopy becomes a powerful tool for biomedical research, and extent the application of fluorescent microscopy to a brand new level. The Royal Swedish Academy of Sciences decided to award Erik Betzig, Stefan W. Hell and W. E. Moerner the Nobel Prize in Chemistry 2014 for the development of super-resolution fluorescence microscopy. Their award proved the importance of this multidisciplinary field consist of chemistry, biology and physics. In this article, we briefly introduced the historical background of super-resolution imaging, and dissect the born and development of each techniques. Finally, the current problems and the challenges for future research were presented.

super-resolution imaging, stimulate emission depletion, photoactivated localization microscopy

(編輯：段艷芳)

10.3969/j.issn.0253-9608.2014.06.003