鄭 昊， 毛家維， 潘彥博， 劉忠山，劉哲益， 葉明亮， 鄒漢法

(1.中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室，國家色譜研究分析中心，中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連116023;2.中國科學(xué)院大學(xué)北京100049)

質(zhì)譜技術(shù)由于其高度的自動化水平和快速分析能力被廣泛用于復(fù)雜生物樣品的定性和定量分析中［1］。復(fù)雜生物樣品用胰蛋白酶酶解后產(chǎn)生C端是精氨酸或賴氨酸的肽段，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析［2］，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，可實現(xiàn)蛋白質(zhì)的定性或定量分析。1967年Kimmel［3］提出胍基化選擇性地發(fā)生在賴氨酸側(cè)鏈氨基上，N端氨基或其他側(cè)鏈基團不發(fā)生此反應(yīng)。近年來，這一現(xiàn)象在蛋白質(zhì)定性和定量領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。用胍基化同位素試劑(13C、15N2標(biāo)記的甲氧脲和12C、14N2標(biāo)記的甲氧脲)平行處理HeLa細胞蛋白質(zhì)胰蛋白酶酶解產(chǎn)物，不僅能增加碎片離子信息，而且還可以識別蛋白質(zhì)C 端［4，5］，利于蛋白質(zhì)鑒定。另外，利用胍基化保護賴氨酸側(cè)鏈，再用二甲基化同位素試劑標(biāo)記肽段N端，利于識別低豐度蛋白質(zhì)，提高鑒定的可信度［6］。

根據(jù)質(zhì)子轉(zhuǎn)移理論［7］和電荷誘導(dǎo)碎裂原則［8］，肽段含有氨基酸的堿性越高，其捕獲質(zhì)子的能力和保持離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的能力越強，就能產(chǎn)生更多的碎裂信息，有利于提高質(zhì)譜鑒定的靈敏度。由于空間位阻的原因，非N端賴氨酸側(cè)鏈的氨基選擇性地發(fā)生胍基化反應(yīng)，而N端氨基或其他側(cè)鏈基團則不發(fā)生該反應(yīng)［9］。賴氨酸發(fā)生反應(yīng)后轉(zhuǎn)化為高精氨酸，使其堿性增強，進而可提高含有賴氨酸的肽段的序列覆蓋率和鑒定可信度。本文對比了以下3種HeLa細胞蛋白質(zhì)胰蛋白酶酶解產(chǎn)物中的肽段胍基化前后的質(zhì)譜響應(yīng)情況:(1)僅在C端有賴氨酸的肽段;(2)中間位置含有賴氨酸的肽段;(3)不含有賴氨酸的肽段。發(fā)現(xiàn)鑒定到的第1類肽段占總肽段的比例由51.7%上升為57.3%，并且其二級質(zhì)譜圖中y離子的比重有所上升;而第3類肽段沒有明顯的變化。說明胍基化能改變質(zhì)譜的選擇性，并提高了第1類肽段的質(zhì)譜鑒定靈敏度。這些結(jié)果對于深入了解胍基化對蛋白質(zhì)分析的影響以及實現(xiàn)其廣泛應(yīng)用具有重要的意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

子宮頸癌細胞(HeLa)來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所;RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640培養(yǎng)基和青霉素/鏈霉素購自美國Gibco Invitrogen公司;新生牛血清購自德國 Biochrom AG公司;氫氧化鈉、鹽酸、丙酮、胰蛋白酶、碳酸氫銨(NH4HCO3)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘代乙酰胺(iodoacetamide，IAA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail)和甲氧脲(O-methylisourea)購自美國Sigma公司;苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF)購自美國Ameresco公司;聚乙二醇單辛基苯基醚(Triton-X 100)購自美國Bio Basic公司;C18AQ反相色譜填料(5 μm，12 nm)購自日本DAISO Chemical公司，75 μm 和 150 μm 內(nèi)徑毛細管購自美國Polymicro公司;乙腈為色譜純，購自美國Merck公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗用水為Milli-Q超純水。

Surveyor HPLC液相色譜系統(tǒng)(配有脫氣機和四元液相泵)及LTQ Velos雙壓線性離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)(配有納升電噴霧離子源和六通閥)購自美國Thermo公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與蛋白質(zhì)的提取、酶解

HeLa細胞用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%(v/v)新生牛血清，青霉素和鏈霉素的終濃度分別為1 unit/mL和1 μg/mL)在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)生長期后用胰蛋白酶消化，于1 000 g離心力下離心3 min，收集細胞。用4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后加入細胞裂解液(8 mol/L 尿素、1%(v/v)Triton-X 100、65 mmol/L DTT、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF、2%(v/v)cocktail、40 mmol/L pH 7.4 的 Tris-HCl)［10］，用超聲波細胞碎裂儀碎裂細胞。于4℃25 000 g離心力下離心60 min，棄去上清液，用4℃丙酮洗滌2次，在通風(fēng)櫥中干燥后存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

將提取的蛋白質(zhì)復(fù)溶于1 mL含8 mol/L尿素和0.1 mol/L NH4HCO3的變性溶液中;再加入DTT，在56℃水浴環(huán)境中還原1 h;加入IAA，在避光條件下對打開的二硫鍵處理 40 min;用 0.1 mol/L NH4HCO3將溶液稀釋到1 mol/L，加入適量胰蛋白酶，在37℃的水浴環(huán)境中過夜。

采用實驗室自制的C18固相萃取柱對得到的酶解產(chǎn)物除鹽純化，真空干燥后存于-20℃待用。

1.3 胍基化標(biāo)記

將O-甲氧脲試劑用3～4 mol/L的NaOH溶液配制成濃度為0.8 mol/L的溶液，調(diào)節(jié) pH值至11.0。取干燥的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物500 μg，加入制備好的 O-甲氧脲溶液 1 000 μL，用 0.1 mol/L pH 11.0 的 NaHCO3調(diào)節(jié) pH 值至10.0 ～11.0。在65℃的水浴環(huán)境下反應(yīng)10 min后除鹽，干燥待用。

1.4 分析條件及數(shù)據(jù)庫檢索

將長15 cm、內(nèi)徑75 μm的毛細管柱在高溫下拉成內(nèi)徑約為3 μm的尖頭，用氣壓法將C18AQ填料壓入柱中制成C18毛細管柱，用于上樣。用HPLC系統(tǒng)分離處理過的HeLa細胞蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物溶液。樣品以5 μL/min的流速進樣2 min到富集柱上。以250 nL/min的流速對富集的肽段進行洗脫。流動相A是0.1%(v/v)的甲酸水溶液，流動相B是0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液。洗脫梯度為:0～2 min，0%B～3%B;2～92 min，3%B～35%B;92～95 min，35%B～80%B;80%B保持10 min;105～110 min，80%B～100%A;100%A保持10 min。

采用LTQ Velos質(zhì)譜儀的正離子模式進行肽段檢測，噴霧電壓為1.8 kV。采用數(shù)據(jù)依賴模式進行采集，包含一次MS全掃描(m/z 425～2 000)，分辨率為60 000，對其中豐度前10的峰進行二級MS/MS掃描分析。

實驗所得的MS2數(shù)據(jù)用Maxquant(version 1.4.1.2)軟件轉(zhuǎn)化成“* .mgf”文件，再通過 Mascot(version 2.3.0)在 人 源 蛋 白 質(zhì) 數(shù) 據(jù) 庫 (IPI human v.3.52.fasta，包含 55 303 個條目)進行檢索。選擇胰蛋白酶酶切，允許最多兩個漏切位點，固定修飾設(shè)定為半胱氨酸碘代酰胺烷基化(57 Da)，可變修飾為甲硫氨酸氧化(16 Da)及賴氨酸側(cè)鏈和肽鏈N端胍基化(47 Da)，母離子的質(zhì)量容忍偏差為10 ppm，碎片離子為0.05 Da。導(dǎo)出肽段時通過設(shè)置score＞25、P＜0.01控制假陽性率(FDR)＜1%。

2 結(jié)果與討論

2.1 胍基化的標(biāo)記效率和選擇性

圖1 胍基化反應(yīng)原理圖Fig.1 Schematic diagram of the guanidination

如圖1所示，經(jīng)胍基化反應(yīng)后，多肽側(cè)鏈上的賴氨酸轉(zhuǎn)化為高精氨酸。取按實驗部分所述方法處理得到的胍基化肽段25 μg，復(fù)溶于0.1%(v/v)甲酸水溶液中，利LC-MS/MS進行分析，通過檢索數(shù)據(jù)庫鑒定肽段。為了考察標(biāo)記效率，需要將標(biāo)記的和未標(biāo)記的肽段分別鑒定出來，在檢索時將賴氨酸側(cè)鏈和肽鏈N端胍基化(47 Da)設(shè)定為可變修飾。得到的結(jié)果見表1，其中用于統(tǒng)計標(biāo)記效率的賴氨酸包括位于C端的賴氨酸(如IGAEVYHNLK)和由于漏切產(chǎn)生的位于肽段中間的賴氨酸(如LKEIVTNFLAGFEA)。測得胍基化效率為96.8%，比文獻報道的平均標(biāo)記效率(95%)高［11］，說明該反應(yīng)比較完全。肽鏈N端被標(biāo)記比例只占6.8%，說明胍基化具有很好的選擇性。由于標(biāo)記效率較高、選擇性好，在進行數(shù)據(jù)庫檢索時，我們將賴氨酸側(cè)鏈胍基化(47 Da)設(shè)為固定修飾。

表1 HeLa細胞蛋白質(zhì)酶解肽段胍基化反應(yīng)的標(biāo)記效率和選擇性Table 1 Labeling efficiency and selectivity of the guanidination of peptides in HeLa cell digest

2.2 胍基化對肽段質(zhì)譜鑒定的影響

為了考察胍基化對肽段質(zhì)譜鑒定的影響，將提取的HeLa細胞蛋白質(zhì)用胰蛋白酶酶解后平行分為兩份，其中實驗組進行胍基化處理，對照組不做處理。兩份樣品分別用LC-MS/MS分析，通過數(shù)據(jù)庫檢索鑒定肽段。由于胍基化僅發(fā)生在賴氨酸的側(cè)鏈上，我們將所鑒定的肽段分成3類:(1)僅在C端有賴氨酸的肽段，如IGAEVYHNLK;(2)由于漏切產(chǎn)生的中間位置含有賴氨酸的肽段，如LKEIVTNFLAGFEA;(3)不含賴氨酸的肽段，如YNQLLR。如表2所示，實驗組與對照組相比，胍基化后鑒定到的第1類肽段占總肽段的比例由51.7%增加到57.3%，說明胍基化能在一定程度上提高這一類肽段的鑒定靈敏度。

進一步比較實驗組與對照組所鑒定到的以上3類肽段的互補性。胍基化前后分別鑒定到肽段3 633條和3 490條，有1 884(35.9%)條肽段在兩組實驗中均被鑒定到，1 749(33.4%)條肽段僅在對照組被鑒定到，1 606(30.7%)條肽段僅在實驗組被鑒定到(見圖2a)。兩組實驗分別鑒定到僅在C端有賴氨酸的肽段為1 877條和1 998條，有 983(34.0%)條肽段在兩組實驗中均被鑒定到，894(30.9%)條肽段僅在對照組被鑒定到，1 015(35.1%)條肽段僅在實驗組被鑒定到(見圖2b)。兩組實驗分別鑒定到中間位置含賴氨酸的肽段為410條和310條，有117(19.4%)條肽段在兩組實驗中均被鑒定到，293(48.6%)條肽段僅在對照組被鑒定到，193(32.0%)條肽段僅在實驗組被鑒定到(見圖2c)。兩組實驗分別鑒定到不含賴氨酸的肽段為1 345條和1 183條，有728(40.4%)條肽段在兩組實驗中均被鑒定到，617(34.3%)條肽段僅在對照組被鑒定到，455(25.3%)條肽段僅在實驗組被鑒定到(見圖2d)。通過對比可以看出，包含賴氨酸的肽段(第1和2類)比不包含賴氨酸的肽段(第3類肽段)中共同鑒定到的肽段比例少。這可能是由于胍基化將賴氨酸轉(zhuǎn)化為高精氨酸后，使肽段的性質(zhì)發(fā)生了變化，從而改變了其在二級質(zhì)譜中的碎裂行為，因此在實驗組鑒定到很多新的肽段(1 015條，占35.1%)。而在對照組中，由于胍基化只選擇性地發(fā)生在賴氨酸的側(cè)鏈上，因此對于不包含賴氨酸的肽段，其質(zhì)譜鑒定結(jié)果前后差異較小，在對照組和實驗組中共同鑒定到的肽段數(shù)目較多(728條，占40.4%)?？梢?，胍基化改變了帶賴氨酸殘基的肽段性質(zhì)，由此可以提高鑒定的互補性。

表2 HeLa細胞蛋白質(zhì)酶解肽段胍基化前后肽段鑒定數(shù)量的比較Table 2 Comparison of peptides identified in HeLa cell digest before and after the guanidination

圖2 HeLa細胞蛋白質(zhì)酶解肽段在胍基化前后質(zhì)譜鑒定結(jié)果中(a)肽段的互補性、(b)C端有賴氨酸的肽段的互補性、(c)中間含賴氨酸的肽段的互補性及(d)不含賴氨酸的肽段的互補性Fig.2 Overlap of(a)identified peptides，(b)peptides with lysine at C-term，(c)peptides with lysine in the middle and(d)peptides without lysine in HeLa cell digest before and after the guanidination

2.3 胍基化對肽段在二級質(zhì)譜中碎裂的影響

為了進一步探究上述胍基化影響肽段質(zhì)譜響應(yīng)的原因，對對照組和實驗組二級質(zhì)譜圖的離子碎裂情況進行了統(tǒng)計學(xué)分析。質(zhì)譜檢測時，質(zhì)子化的肽段沿著肽鏈骨架發(fā)生斷裂，因發(fā)生斷裂的位置不同而產(chǎn)生6種類型的離子:N端產(chǎn)生a、b、c離子，C端產(chǎn)生相應(yīng)的 x、y、z離子［12］。在本實驗條件下，產(chǎn)生的主要為b、y離子。運用本實驗室開發(fā)的程序，我們可以統(tǒng)計出每條肽段二級質(zhì)譜圖鑒定到的b、y離子的數(shù)目。如肽段VNQIGSVTESLQACK，平均鑒定到的b、y離子數(shù)目分別是13和15。按照b/(y+b)計算其b離子所占的比例為46.4%，按照y/(y+b)計算y離子所占的比例為53.6%。對所有鑒定到的肽段的b、y離子比例進行概率統(tǒng)計，結(jié)果見圖3。

C端為賴氨酸的肽段在胍基化后，y離子比例大于40%的肽段在所有肽段中所占的比重都相應(yīng)提高，如圖3a所示，其總比重由原來的38.8%上升至50.0%。而b離子占主體的肽段比原來均有所減少。說明胍基化產(chǎn)生了更多的y離子信息。這可能是由于賴氨酸的胍基化發(fā)生在肽段C端，其堿性更強且容易捕獲離子化質(zhì)子，在正離子檢測模式下，這類肽段骨架斷裂主要發(fā)生在C端，產(chǎn)生了更多的y離子。由于這部分新增的離子碎裂信息，提高了這類肽段的質(zhì)譜鑒定靈敏度，和對照組相比，鑒定結(jié)果中出現(xiàn)了許多新的肽段信息。

圖3 (a)C端為賴氨酸的肽段和(b)不含賴氨酸的肽段胍基化前后y離子的比例分布圖Fig.3 R atio distributions of y ions of(a)peptides with lysine at C-term and(b)peptides without lysine before and after the guanidination

我們進一步對不含有賴氨酸的肽段進行分析，其y離子比例大于40%的肽段在所有肽段中所占的比例在胍基化前后分別為29.5%和31.1%，沒有明顯變化，如圖3b所示，說明胍基化對這類肽段的質(zhì)譜檢測基本沒有影響。這可能是由于胍基化只選擇性地發(fā)生在賴氨酸的側(cè)鏈，因此不含賴氨酸的肽段的離子碎裂過程不受影響。

3 結(jié)論

本文探討了胍基化對復(fù)雜生物樣品蛋白質(zhì)組分析的影響，發(fā)現(xiàn)胍基化反應(yīng)可以選擇性地在賴氨酸側(cè)鏈上發(fā)生，使C端為賴氨酸的肽段在總肽段中所占的比例從51.7%上升到57.3%，在一定程度上提高了質(zhì)譜鑒定的靈敏度和互補性。對鑒定到肽段的b、y離子比例進行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)胍基化后產(chǎn)生了更多的y離子碎裂信息，這可能是由于胍基化后賴氨酸堿性提高造成的。

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