李佳斌， 周廉淇， 顏 輝， 李楠楠， 郝斐然， 田 芳， 張養(yǎng)軍

(蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京蛋白質(zhì)組研究中心，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京102206)

隨著高效液相色譜技術(shù)、質(zhì)譜儀器和技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)組的深度覆蓋。例如，Ruedi［1］實(shí)驗(yàn)室使用電泳-反相色譜兩維分離結(jié)合質(zhì)譜分析策略對(duì)人類骨肉瘤細(xì)胞系進(jìn)行分析，成功鑒定了10 006個(gè)蛋白質(zhì);Mann［2］實(shí)驗(yàn)室使用離子交換-反相色譜兩維分離策略結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)HeLa細(xì)胞系進(jìn)行分析，鑒定到10 025個(gè)蛋白質(zhì);Ding等［3］采用兩維短梯度反相色譜分離策略結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)在12 h內(nèi)鑒定了來自于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的8 000個(gè)蛋白質(zhì)。盡管如此，定性結(jié)果并不能提供諸如不同生理病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)的差異表達(dá)狀況以及蛋白質(zhì)絕對(duì)表達(dá)量的信息，而這些信息與生物學(xué)問題和重大疾病調(diào)控機(jī)制相關(guān)聯(lián)，所以我們亟須在定性鑒定的基礎(chǔ)上，開發(fā)出高靈敏度、高準(zhǔn)確度的定量方法。定量蛋白質(zhì)組學(xué)可以分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量，相對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)主要是對(duì)不同生理病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)的差異表達(dá)狀況進(jìn)行相對(duì)比較分析，而絕對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)則是測(cè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量?；谫|(zhì)譜的絕對(duì)定量和相對(duì)定量方法目前常使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記來區(qū)分來自不同狀態(tài)生物樣本中的蛋白質(zhì)或酶切肽段。現(xiàn)有的穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法，包括穩(wěn)定同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)肽段技術(shù)(absolute protein quantitation using stable isotope labeled peptides，AQUA)［4］;代謝標(biāo)記，如細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC)［5］;化學(xué)標(biāo)記，如同位素標(biāo)簽相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)［6］和質(zhì)量差異標(biāo)簽相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)(mass differential tags for relative and absolute quantification，mTRAQ)［7］;酶促標(biāo)記(如18O 標(biāo)記［8，9］)。這些基于同位素的標(biāo)記技術(shù)都存在同位素試劑價(jià)格昂貴，同位素簇峰之間相距較近的問題，使得這些同位素峰在質(zhì)譜分析時(shí)會(huì)發(fā)生相互干擾，從而給定量結(jié)果帶來誤差。為了解決這個(gè)問題，我們的研究目的是探索非同位素標(biāo)記方法。

2004年，Whetstone等［10］首次以化學(xué)性質(zhì)相近的稀土金屬元素作為質(zhì)量標(biāo)簽，提出了“元素標(biāo)記親和標(biāo)簽”(element-coded affinity tags，ECAT)的新方法，其優(yōu)點(diǎn)是采用了金屬元素作為質(zhì)量標(biāo)簽，可以進(jìn)行多重標(biāo)記。另外，選擇金屬元素使得目標(biāo)峰之間相距較遠(yuǎn)，但不足之處是該方法標(biāo)記的是肽段中的半胱氨酸，無法對(duì)不含半胱氨酸的肽段進(jìn)行定量。Liu等［11］使用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)螯合稀土金屬元素釔、鋱(Y、Tb)作為金屬標(biāo)記標(biāo)簽對(duì)肽段的N端進(jìn)行標(biāo)記，可實(shí)現(xiàn)對(duì)所有肽段的標(biāo)記和定量，但存在所選擇的雙功能試劑標(biāo)記效率不高的問題。針對(duì)此問題，Wang等［12］用羥基琥珀酰亞胺-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA-NHS)作為螯合試劑，解決了原方法采用螯合試劑DTPA標(biāo)記效率不高的問題，并通過對(duì)標(biāo)記方法的優(yōu)化使金屬標(biāo)記效率接近100%。之后采用4種不同的鑭系金屬(Tb、Ho、Tm、Lu)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)合成肽段和馬心肌紅蛋白胰蛋白酶酶切肽段的4重相對(duì)定量。另外，Wang等［13］將金屬標(biāo)記與多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)(MRM)相結(jié)合，成功地對(duì)騰沖嗜熱菌蛋白進(jìn)行了絕對(duì)定量，線性范圍內(nèi)的R2值大于0.99，RSD值小于15%。同金屬標(biāo)記方法相比，傳統(tǒng)的AQUA技術(shù)采用化學(xué)合成方法，所需同位素試劑價(jià)格昂貴，制備周期長(zhǎng)，質(zhì)控過程復(fù)雜，且無法標(biāo)記目標(biāo)樣品實(shí)現(xiàn)反相標(biāo)記，而金屬標(biāo)記方法試劑價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，標(biāo)記效率高，可以增強(qiáng)質(zhì)譜信號(hào)，便于多重金屬標(biāo)記，無背景干擾。綜上所述，金屬元素標(biāo)記方法具有多種優(yōu)勢(shì)，值得重視和進(jìn)一步研究。

在對(duì)簡(jiǎn)單生物樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量時(shí)，如藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)中蛋白質(zhì)的定量分析中，一般會(huì)采用抗體富集策略，這樣會(huì)降低機(jī)體干擾。例如，Rix等［14］通過親和沉淀技術(shù)首先富集了與治療白血病的3種不同藥物直接相關(guān)的不同激酶，然后對(duì)這些激酶在藥效過程中的作用進(jìn)行分析。這種策略的主要問題是方法的靈敏度。針對(duì)此問題，在質(zhì)譜分析時(shí)采用選擇性離子檢測(cè)技術(shù)是一種合理的選擇。在這種簡(jiǎn)單環(huán)境情況下，待測(cè)樣品結(jié)構(gòu)單一、純凈，此時(shí)使用一級(jí)圖譜定量，相比于目前藥物定量常采用的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)［15－19］，可避免使用二級(jí)圖譜進(jìn)行定量時(shí)肽段由于二級(jí)碎裂時(shí)多種碎裂行為并存使二級(jí)信號(hào)強(qiáng)度相比一級(jí)離子信號(hào)強(qiáng)度明顯下降的問題，從而獲得更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。

本文在前人工作的基礎(chǔ)上，建立了基于金屬標(biāo)記結(jié)合高效液相色譜-選擇離子監(jiān)測(cè)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)絕對(duì)定量新方法。該方法一方面以雙功能試劑DOTA-NHS螯合鑭系金屬元素鋱、鈥和镥(Tb、Ho、Lu)為質(zhì)量標(biāo)簽，繼承金屬元素標(biāo)記方法標(biāo)記效率高，價(jià)格低廉，可多重定量的優(yōu)點(diǎn);另一方面采用選擇離子監(jiān)測(cè)質(zhì)譜技術(shù)，避免了二級(jí)離子信號(hào)降低的問題，提高了定量結(jié)果的靈敏度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-電噴霧-線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(HPLC-ESI-LTQ-FT MS，美國Thermo Fisher Scientific公司);TSQ vantage質(zhì)譜系統(tǒng)(美國Thermo Scientific公司);Eksigent nanoLC·2D高效液相色譜儀(美國AB SCIEX);4800基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-TOF MS，美國 AB SCIEX公司);安捷倫1100毛細(xì)管色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司);3K30型高效離心機(jī)(美國Sigma公司);真空濃縮儀(Concentrator Plus，德 國 Eppendorf公司);Sartorius CPA225D分析天平(德國Sartorius公司);Thermo Heraeus Fresco 21微量離心機(jī)(德國Heraeus有限公司)。

內(nèi)標(biāo)肽段由上海吉爾生化有限公司合成，色譜方法測(cè)定純度為99%;氯化鋱(terbium chloride)、氯化鈥(holmium chloride)、氯化镥(lutetium chloride)、三乙二胺碳酸鹽(triethylammonium bicarbonate，TEAB)、碳酸氫銨和醋酸銨購于美國Sigma公司;DOTA-NHS購于美國 Macrocyclics公司;測(cè)序級(jí)胰蛋白酶和二硫蘇糖醇(DTT)購自美國Promega公司;碘乙酰胺(IAA)購自美國New Jersey公司;乙腈(色譜純)購自美國J.T.Baker公司;三氟乙酸(TFA)購自美國Acros公司;甲酸(FA)購自德國Fluka公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備(美國Millipore公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 合成肽段的金屬標(biāo)記

對(duì)選擇的合成肽段，采用以下步驟進(jìn)行標(biāo)記:(1)肽段與雙功能試劑的反應(yīng):移取1 μg肽段溶于10 μL TEAB 緩沖液中(0.2 mol/L 且 pH=8.0)，補(bǔ)加20 μL乙腈，混勻后加入 10 μL雙功能試劑DOTA-NHS(50 nmol/μL)，渦旋2 min，室溫反應(yīng)1 h。(2)金屬與雙功能試劑標(biāo)記肽段反應(yīng):將反應(yīng)液真空干燥，加入10 μL乙腈復(fù)溶，再加入40 μL醋酸銨緩沖液(0.1 mol/L且pH=6.0)，之后加入金屬氯化物的醋酸銨溶液，其中金屬加入量為雙功能試劑DOTA-NHS加入量的2倍(物質(zhì)的量比)，室溫反應(yīng)1 h后，使用MALDI-TOF質(zhì)譜分析，以標(biāo)記前后肽段質(zhì)荷比的信號(hào)強(qiáng)度的比值考察標(biāo)記效率。

1.2.2 金屬標(biāo)記的歧視性考察

隨機(jī)選擇3條合成的肽段，用同一種金屬標(biāo)記后，使用MALDI-TOF質(zhì)譜考察金屬標(biāo)記的效率，考察金屬對(duì)不同肽段是否存在歧視性。

對(duì)一條肽段使用3種不同的金屬標(biāo)記，使用MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定金屬標(biāo)記的效率，考察肽段對(duì)不同金屬標(biāo)記是否存在歧視。

1.2.3 金屬標(biāo)記的穩(wěn)定性考察

為了考察金屬與DOTA-NHS以及DOTANHS與肽段結(jié)合的穩(wěn)定性，并同時(shí)考察標(biāo)記的肽段是否會(huì)發(fā)生金屬離子置換反應(yīng)，將金屬標(biāo)記完成后的肽段加入到等物質(zhì)的量的另外兩種金屬鹽的混合溶液中，即將金屬 Tb、Ho、Lu標(biāo)記完成后的 Tb-DOTA-SSIIDIYAR、 Ho-DOTA-SSIIDIYAR、 Lu-DOTA-SSIIDIYAR分別加入到等物質(zhì)的量的Ho和Lu、Tb和Lu以及Ho和Tb的混合溶液中放置24 h，在放置前后各取0.8 μL溶液進(jìn)行 MALDITOF質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.4 不同金屬標(biāo)記的肽段的色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜響應(yīng)行為考察

首先考察金屬標(biāo)記肽段(SSIIDIYAR和AGYTAIVSHR)在ESI源質(zhì)譜中的一級(jí)質(zhì)譜響應(yīng)行為，DOTA修飾后的標(biāo)準(zhǔn)肽段分別使用3種金屬(Tb、Ho、Lu)標(biāo)記后再等物質(zhì)的量混合進(jìn)行HPLCESI-LTQ-FT MS分析，采用FULL SCAN模式，觀察3種不同金屬標(biāo)記的肽段在色譜上的保留時(shí)間和ESI-LTQ-FT MS中的一級(jí)響應(yīng)強(qiáng)度，基于質(zhì)譜的檢測(cè)結(jié)果，選擇合適的金屬標(biāo)簽應(yīng)用于騰沖嗜熱菌中烯醇酶蛋白的定量分析。

1.2.5 騰沖嗜熱菌全蛋白的提取、酶切與標(biāo)記

取75℃騰沖嗜熱菌加入到適量的裂解液中(裂解液由8 moL/L 的尿素、5 mg DTT、10 μL 的蛋白酶抑制劑組成)進(jìn)行超聲破碎，超聲功率為400 W，超聲1 s，停2 s，超聲40次為一循環(huán)，重復(fù)循環(huán)8次至溶液澄清。然后在4℃ 20 000 r/min條件下離心30 min，取上清液，采用Bradford法測(cè)定騰沖嗜熱菌的蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)分裝后于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

取100 μg騰沖嗜熱菌蛋白溶液，加入40 μL 0.2 mol/L且pH=8.0的TEAB緩沖液;混勻后加入DTT，使其終濃度為10 mmol/L，37℃反應(yīng)4 h;加入IAA，其終濃度為50 mmol/L，暗處放置1 h。還原、烷基化后，按胰蛋白酶︰底物=100∶1(質(zhì)量比)加入1 μg測(cè)序級(jí)胰蛋白酶，在37℃水浴孵育4 h后再加入2 μg的測(cè)序級(jí)胰蛋白酶繼續(xù)酶解16 h。將騰沖嗜熱菌酶解產(chǎn)物分裝后于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

取出10 μg的騰沖嗜熱菌酶切產(chǎn)物使用金屬標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記方法參考1.2.1節(jié)。

1.2.6 質(zhì)譜鑒定

1.2.6.1 MALDI-TOF MS 質(zhì)譜鑒定分析

儀器控制軟件為4000 Series Explorer software。采用馬心肌紅蛋白的胰蛋白酶酶解肽段作為標(biāo)準(zhǔn)肽段對(duì)儀器進(jìn)行校正，要求相對(duì)誤差小于10 ppm，一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用MS-2 kV反射模式，加速電壓20 kV，激光能量為3 500，每張譜圖由1 600個(gè)亞譜累加獲得。

1.2.6.2 HPLC-ESI-LTQ-FT MS 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)鑒定分析

色譜分離:采用Agilent 1100系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣器上樣，體積為20 μL。毛細(xì)管液相色譜流動(dòng)相A為0.1%甲酸+2%乙腈水溶液，B相為0.1%甲酸+80%乙腈水溶液。洗脫梯度:0～26 min，5%B～35%B;26～31 min，35%B ～100%B;31～36 min，100%B;37～46 min，100%A平衡色譜柱。流速:300 nL/min。

質(zhì)譜鑒定:(1)FULL SCAN模式:正離子模式;掃描范圍為m/z 375.0～1 500.0;質(zhì)譜采集時(shí)間為46 min;數(shù)據(jù)依賴模式為選取一級(jí)質(zhì)譜全掃描的信號(hào)強(qiáng)度最高的10個(gè)離子進(jìn)行MS/MS分析;二級(jí)碰撞能量為35 V，活化時(shí)間為10 ms;二級(jí)重復(fù)采集譜圖2次后，動(dòng)態(tài)排除，排除時(shí)間為25 s。(2)SIM模式:正離子模式，質(zhì)譜采集時(shí)間為46 min;分辨率為100 000。

1.2.6.3 HPLC-ESI-TSQ MS 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)鑒定分析

色譜分離:采用Eksigent nanoLC·2D系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣器上樣，體積為20 μL。流動(dòng)相組成、洗脫梯度設(shè)置及流速與LTQ色譜條件相同。

質(zhì)譜鑒定:(1)FULL SCAN模式:正離子模式，掃描范圍為:m/z 375.0～1 500.0;質(zhì)譜采集時(shí)間為46 min;數(shù)據(jù)依賴模式:選取一級(jí)質(zhì)譜全掃描的信號(hào)強(qiáng)度最高的10個(gè)離子進(jìn)行MS/MS分析;二級(jí)碰撞能量為35 V，活化時(shí)間為10 ms;二級(jí)重復(fù)采集譜圖3次后，動(dòng)態(tài)排除，排除時(shí)間為32 s。(2)MRM模式:正離子模式，質(zhì)譜采集時(shí)間為46 min;監(jiān)視母子離子對(duì)為 m/z790.32/637.33、m/z 790.32/682.40。(3)SIM 模式:正離子模式，質(zhì)譜采集時(shí)間為46 min;監(jiān)視一級(jí)離子為m/z 790.32、m/z 808.82。

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬元素標(biāo)記的原理

金屬元素標(biāo)簽部分由雙功能試劑(大環(huán)類金屬螯合劑)和鑭系金屬元素組成。雙功能試劑的活性基團(tuán)與肽段或蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)，再螯合上化學(xué)性質(zhì)相近但質(zhì)量數(shù)不同的鑭系金屬元素，從而形成肽段的質(zhì)量標(biāo)簽。本實(shí)驗(yàn)的雙功能試劑為帶有琥珀酰亞胺酯活性基團(tuán)的DOTA-NHS，DOTA-NHS與肽段反應(yīng)后，肽段分子質(zhì)量增加386.18 Da，螯合鑭系單同位素金屬鋱、鈥和镥(相對(duì)原子質(zhì)量158.925、164.930和 174.967)后，肽段分子質(zhì)量共增加542.08 Da、548.09 Da和 558.13 Da。

2.2 金屬標(biāo)記反應(yīng)的可行性

為了實(shí)現(xiàn)金屬標(biāo)記質(zhì)譜的定量新方法在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用，首先使用合成肽段為研究對(duì)象，對(duì)金屬標(biāo)簽的標(biāo)記效率、肽段歧視性、穩(wěn)定性、色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜響應(yīng)行為等進(jìn)行了一系列的考察。

2.2.1 金屬標(biāo)簽標(biāo)記效率

為了驗(yàn)證DOTA-NHS與肽段N端的反應(yīng)效率和特異性，首先將肽段AFAAGVDLGFR(分子質(zhì)量975 Da)與50倍質(zhì)量的DOTA-NHS在pH 8.0～8.5 TEAB緩沖液中室溫反應(yīng)1 h。反應(yīng)中需要嚴(yán)格控制反應(yīng)體系的pH值，這是由于當(dāng)pH值較低時(shí)，肽段N端的伯氨基由于帶電荷而使其親核性減弱，降低反應(yīng)效率;而當(dāng)pH過高時(shí)賴氨酸側(cè)鏈上的氨基也會(huì)參與反應(yīng)，使得一個(gè)肽段標(biāo)記上多個(gè)標(biāo)簽，反應(yīng)副產(chǎn)物增加，影響肽段的定量結(jié)果。為了盡可能地避免DOTA-NHS酯鍵水解，反應(yīng)體系中乙腈體積為TEAB緩沖液的3倍。

然后將樣品真空干燥，在pH 6.0的NH4OAc緩沖液中與2倍過量的金屬TbCl3室溫反應(yīng)1 h。MALDI-TOF MS檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，肽段的m/z為976(圖1a)，與DOTA-NHS反應(yīng)后質(zhì)量數(shù)增加386(圖1b)，且此時(shí)質(zhì)譜圖上已經(jīng)檢測(cè)不到原肽段。再與金屬Tb螯合，質(zhì)量數(shù)共增加542(圖1c)，且此時(shí)質(zhì)譜圖上也檢測(cè)不到合成肽段與DOTA-NHS反應(yīng)后的肽段，說明標(biāo)記反應(yīng)完全。

2.2.2 金屬標(biāo)簽的歧視性

考察金屬標(biāo)記中是否存在歧視性，即考察金屬標(biāo)簽是否只適用于特定的肽段以及肽段是否只適用于特定的金屬標(biāo)記。使用3種不同的金屬元素，對(duì)分子質(zhì)量為1 426 Da的肽段AQIEETTSDYDR進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記效率如表1所示;而同一種金屬元素鋱對(duì)3條隨機(jī)選擇的合成肽段的標(biāo)記效率如表2所示。大于99%的標(biāo)記效率證明金屬標(biāo)記是一種標(biāo)記效率高且具有廣泛適用性的標(biāo)記方法。

表1 3種金屬標(biāo)記同一條隨機(jī)選擇的合成肽段的標(biāo)記效率Table 1 Labeling efficiencies of one peptide labeled with three metal elements

圖1 (a)肽段AFAAGVDLGR、(b)肽段與雙功能試劑反應(yīng)后與(c)其再與金屬離子Tb螯合后的質(zhì)譜圖Fig.1 MALDI-TOF MS spectra of(a)peptide(AFAAGVDLGR)，(b)DOTA-AFAAGVDLGRand(c)Tb-DOTA-AFAAGVDLGR

表2 同一金屬標(biāo)記3條不同肽段的標(biāo)記效率Table 2 Labeling efficiencies of three peptides labeled with one metal element

2.2.3 金屬標(biāo)記的穩(wěn)定性

標(biāo)記肽段的金屬離子置換反應(yīng)的考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，圖2a為金屬標(biāo)記完成后的肽段Lu-DOTA-SSIIDIYAR(分子質(zhì)量1 595 Da)點(diǎn)靶分析的MALDI-TOF質(zhì)譜圖，圖2b為金屬Lu標(biāo)記完成后的肽段Lu-DOTA-SSIIDIYAR加入到等物質(zhì)的量的Ho和Tb的混合溶液中并放置24 h后所得的MALDI-TOF質(zhì)譜圖，比較圖中質(zhì)譜峰(肽段SSIIDIYAR分子質(zhì)量1 037 Da，DOTA-SSIIDIYAR 分子質(zhì)量1 423 Da)可以發(fā)現(xiàn)已標(biāo)記上的金屬未脫落，且未檢測(cè)到發(fā)生金屬置換反應(yīng)的肽段(Tb-DOTASSIIDIYAR 分子質(zhì)量1 579 Da，Ho-DOTA-SSIIDIYAR分子質(zhì)量1 585 Da)。其他兩種金屬標(biāo)記肽段的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果與Lu標(biāo)記肽段結(jié)果一致，證明金屬標(biāo)記是穩(wěn)定的。

圖2 (a)金屬標(biāo)記完成后的Lu-DOTA-SSIIDIYAR與(b)其加入到Ho、Tb鹽混合液中并放置24 h后所得的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.2 MALDI-TOF MS spectra of(a)Lu-DOTASSIIDIYARand(b)Lu-DOTA-SSIIDIYAR solution added with TbCl3and HoCl3for 24 h

2.2.4 不同金屬標(biāo)記的肽段的色譜及質(zhì)譜行為

為了考察金屬標(biāo)記是否影響肽段在色譜和質(zhì)譜中的行為，本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)3種不同金屬元素標(biāo)記的合成肽段SSIIDIYAR和AGYTAIVSHR作為樣品，等物質(zhì)的量混合后在HPLC-ESI-LTQ-FT MS上采用選擇離子監(jiān)測(cè)技術(shù)對(duì)其保留時(shí)間及色譜峰面積進(jìn)行考察。3種不同金屬標(biāo)記肽段的保留時(shí)間如表3所示，說明帶有不同金屬標(biāo)簽的肽段在色譜中共洗脫，滿足定量要求。3種不同金屬標(biāo)記肽段的總離子流色譜峰面積如表4所示，RSD值小于8%，滿足定量要求。

表3 不同金屬標(biāo)記肽段(SSIIDIYAR，AGYTAIVSHR)的保留時(shí)間Table 3 R etention times of the labeled peptides(SSIIDIYAR，AGYTAIVSHR)with different metal elements

表4 不同金屬標(biāo)記肽段(SSIIDIYAR，AGYTAIVSHR)的色譜峰面積Table 4 Peak areas of the labeled peptides(SSIIDIYAR，AGYTAIVSHR)with different metal elements

2.3 SIM 技術(shù)與MR M技術(shù)靈敏度的比較

將等物質(zhì)的量金屬鋱標(biāo)記的肽段SSIIDIYAR和AGYTAIVSHR混合后，分別采用SIM模式和MRM模式質(zhì)譜(TSQ，Thermo Scientific公司，美國)進(jìn)行分析。首先對(duì)金屬標(biāo)記肽段的所有b、y離子進(jìn)行全掃描，以選擇用于MRM模式的最高離子強(qiáng)度的母子離子對(duì)。如圖3a和圖3b所示，在Tb-SSIIDIYAR的所有子離子中，離子m/z 637.33信號(hào)響應(yīng)最高，而在Tb-AGYTAIVSHR的所有子離子中，離子m/z 682.40信號(hào)響應(yīng)最高，故選擇這兩對(duì)母子離子對(duì)與其相應(yīng)的母離子的SIM質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較。

圖3 (a)Tb-SSIIDIYAR和(b)Tb-AGYTAIVSHR的串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectra of(a)Tb-SSIIDIYAR and(b)Tb-AGYTAIVSHR

采用MRM模式質(zhì)譜對(duì)金屬標(biāo)記肽段進(jìn)行檢測(cè)。Tb-SSIIDIYAR的子離子m/z 637.33的提取離子流色譜圖如圖4a所示，其信號(hào)強(qiáng)度為2.41×104;Tb-AGYTAIVSHR的子離子m/z 682.40的提取離子流色譜圖如圖4b所示，其信號(hào)強(qiáng)度為1.88×104。

圖4 (a)Tb-SSIIDIYAR的子離子m/z 637.33和(b)Tb-AGYTAIVSHR的子離子m/z 682.40的提取離子流色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatograms of(a)product ion m/z 637.33 of Tb-SSIIDIYAR and(b)product ion m/z 682.40 of Tb-AGYTAIVSHR

將上述混合物進(jìn)行SIM模式質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。Tb-SSIIDIYAR的信號(hào)強(qiáng)度為1.62×106，而 Tb-AGYTAIVSHR的信號(hào)強(qiáng)度為4.68×106。

比較肽段在SIM模式和MRM模式質(zhì)譜的信號(hào)強(qiáng)度值可知，SIM模式的靈敏度高于MRM模式的靈敏度。所以在簡(jiǎn)單環(huán)境下對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量，SIM模式是比較好的選擇。

2.4 絕對(duì)定量方法建立及在騰沖嗜熱菌中的應(yīng)用

圖5 (a)Tb-SSIIDIYAR和(b)Tb-AGYTAIVSHR的選擇離子檢測(cè)色譜圖Fig.5 SIM chromatograms of(a)Tb-SSIIDIYARand(b)Tb-AGYTAIVSHR

將不同物質(zhì)的量(1、5、10、20、50、100、500、1 000 fmol)金屬Tb標(biāo)記的騰沖嗜熱菌中烯醇酶蛋白的合成肽段(SSIIDIYAR、AGYTAIVSHR)分別加入到金屬Ho標(biāo)記的1 μg騰沖嗜熱菌蛋白酶解液中，體積為 20 μL，共 8個(gè)樣品，使用 HPLC-ESILTQ-FT MS進(jìn)行SIM質(zhì)譜分析。采取genesis積分方法對(duì)肽段離子的峰面積進(jìn)行積分，以金屬Tb標(biāo)記肽段的物質(zhì)的量和峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算發(fā)現(xiàn)1 pmol標(biāo)準(zhǔn)肽段的峰面積積分結(jié)果明顯偏離曲線(R2=0.97)，故選擇最大上限濃度為500 fmol。最終標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，在1～500 fmol范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸系數(shù)R2大于0.99，說明金屬標(biāo)記完成后的標(biāo)準(zhǔn)肽段在1～500 fmol間峰面積與物質(zhì)的量成良好線性。依據(jù)定量限為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%時(shí)的工作曲線的最低點(diǎn)這一定義，定量限為1 fmol。重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，1 fmol的肽段SSIIDIYAR的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.74%，而1 fmol的肽段AGYTAIVSHR的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為11.31%。即當(dāng)上樣量為1 fmol時(shí)，同時(shí)滿足工作曲線的最低點(diǎn)和RSD＜20%，所以該方法的定量限為1 fmol，且兩條肽段的線性范圍都為1～500 fmol。

以金屬Ho標(biāo)記的騰沖嗜熱菌中烯醇酶蛋白酶解肽段(SSIIDIYAR、AGYTAIVSHR)的7次質(zhì)譜分析峰面積的平均值分別為8 681 588和21 007 452，將峰面積平均值代入兩條曲線求得烯醇酶蛋白的濃度，此時(shí)烯醇酶蛋白使用特征肽段SSIIDIYAR曲線的定量結(jié)果為 52.49fmol，使用特征肽段AGYTAIVSHR的定量結(jié)果為48.58 fmol。測(cè)得騰沖嗜熱菌烯醇酶蛋白的物質(zhì)的量平均值為50.535 fmol，RSD為5.47%，表明定量結(jié)果可信。由于烯醇酶蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為46 286.7，所以騰沖嗜熱菌全蛋白中烯醇酶蛋白的含量為2.314 ng/μg。

2.5 絕對(duì)定量新方法的準(zhǔn)確度

圖6 肽段SSIIDIYAR和AGYTAIVSHR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Calibration curves of SSIIDIYARand AGYTAIVSHR

將50 fmol金屬 Ho標(biāo)記肽段(SSIIDIYAR、AGYTAIVSHR)加入騰沖嗜熱菌全蛋白酶解液中對(duì)方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行考察。將genesis積分得到的Ho-DOTA-SSIIDIYAR和Ho-DOTA-AGYTAIVSHR的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 Ho-DOTA-SSIIDIYAR和Ho-DOTA-AGYTAIVSHR的測(cè)得量分別為57.89 fmol和59.12 fmol。肽段SSIIDIYAR的回收率=57.89/50×100% =115.78%，肽段AGYTAIVSHR的回收率=59.12/50×100%=118.24%，兩條肽段的平均回收率為117.01%。由回收率可知金屬標(biāo)記結(jié)合選擇離子監(jiān)測(cè)技術(shù)具有較高的準(zhǔn)確度，表明該方法可以用于蛋白質(zhì)的定量。

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種新的蛋白質(zhì)絕對(duì)定量方法，即基于金屬標(biāo)記結(jié)合高效液相色譜-SIM質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)絕對(duì)定量新方法。首先以鑭系金屬元素鋱、鈥、镥螯合雙功能試劑DOTA-NHS作為質(zhì)量標(biāo)簽對(duì)標(biāo)準(zhǔn)肽段進(jìn)行標(biāo)記，然后結(jié)合SIM模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，建立了蛋白質(zhì)絕對(duì)定量的新方法。通過對(duì)金屬標(biāo)記適用性的考察，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，并最終將該方法應(yīng)用于騰沖嗜熱菌中烯醇酶蛋白的定量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有高精密度和準(zhǔn)確度，可用于相對(duì)比較簡(jiǎn)單的生物樣本中蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量分析，提供了一種蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量方法的新選擇。

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