周 愿， 張 珅， 袁輝明， 張麗華*， 張玉奎

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家色譜研究分析中心，遼寧大連116023;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100039)

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的體現(xiàn)者和執(zhí)行者。因此，在研究生命過程中，通常不僅需要了解哪些蛋白質(zhì)參與，而且還應(yīng)該揭示蛋白質(zhì)的含量及其變化［1］。因此亟須發(fā)展高準(zhǔn)確度、高精密度和高通量的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。近年來(lái)基于液相色譜-串級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)的方法得到了快速發(fā)展，已成為蛋白質(zhì)組定量的主流技術(shù)。該方法可以分為無(wú)標(biāo)記和穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量法。其中，基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組定量方法可以在不同樣品預(yù)處理步驟中實(shí)現(xiàn)樣品混合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記并消除LCMS/MS分析過程中引入的誤差，已成為定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的方法［2］。

二甲基化標(biāo)記是一種常用的穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法［3］。該方法利用甲醛和氰基硼氫化鈉及各自的同位素形式標(biāo)記蛋白質(zhì)/肽段中所有的活性氨基。具有反應(yīng)條件溫和、快速、高效、無(wú)明顯副反應(yīng)、同位素試劑種類多、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。常用的二甲基化標(biāo)記多是基于溶液標(biāo)記，易引起樣品的損失而導(dǎo)致定量準(zhǔn)確度差。此外，還難以實(shí)現(xiàn)樣品的自動(dòng)化分析。為此，Heck等［4］使用具有反相保留機(jī)理的預(yù)柱對(duì)捕集的肽段進(jìn)行在線二甲基化標(biāo)記，并和LCMS/MS聯(lián)用，構(gòu)建了集成化的蛋白質(zhì)組定量分析平臺(tái)。Wang等［5］在此基礎(chǔ)上，在RPLC捕集柱上進(jìn)行在線固相二甲基化標(biāo)記后，用二維強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜-反相色譜-電噴霧串級(jí)質(zhì)譜(2D-SCXRPLC-ESI-MS/MS)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了標(biāo)記肽段的在線分離分析。利用上述平臺(tái)對(duì)蛋白質(zhì)組樣品進(jìn)行自動(dòng)化定量分析，不僅降低了手動(dòng)離線操作帶來(lái)的誤差，而且減少了樣品的標(biāo)記時(shí)間。然而這些工作均是肽段水平標(biāo)記，有可能在肽段水平混合前引入實(shí)驗(yàn)誤差，不利于蛋白質(zhì)組的準(zhǔn)確定量。由于基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的方法中標(biāo)記樣品混合的步驟越是靠前，定量結(jié)果越準(zhǔn)確［6-8］，因而在蛋白質(zhì)組樣品標(biāo)記后直接混合應(yīng)優(yōu)于肽段水平標(biāo)記后混合的定量結(jié)果。

為發(fā)展基于蛋白質(zhì)水平標(biāo)記后混合的定量方法，蛋白質(zhì)組的高效在線酶解至關(guān)重要。Tian等［9］將蛋白質(zhì)樣品捕集在SCX柱上，然后連續(xù)通入胰蛋白酶溶液，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的在線酶解。然而該方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品的分級(jí)，且容易導(dǎo)致樣品丟失。近年來(lái)，我們［10-13］發(fā)展了多種由蛋白質(zhì)在線分離、酶解和肽段分離鑒定構(gòu)成的集成化蛋白質(zhì)組分析平臺(tái)，顯著提高了蛋白質(zhì)組的定性分析能力。

在此基礎(chǔ)上，將蛋白質(zhì)組樣品二甲基化后，采用由微柱弱陰/弱陽(yáng)離子交換色譜(μWAX/WCX)-固定化酶反應(yīng)器(IMER)-nanoRPLC-ESI-MS/MS構(gòu)成的平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)組的相對(duì)定量分析。與常規(guī)的肽段水平標(biāo)記后混合的方法相比，該方法具有高準(zhǔn)確度、高通量和自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)。此外，利用該平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了小鼠腹水型肝癌淋巴道高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系(Hca-F/Hca-P)的差異蛋白質(zhì)分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

尿素、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT，純度99%)、碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA，純度 98%)、胰蛋白酶(trypsin)、甲醛(formaldehyde，CH2O，38%(v/v)水溶液)、氘代甲醛(formaldehyde-d2，CD2O，20%(v/v)，溶于 D2O)、氰基硼氫化鈉(sodium cyanoborohydride，NaCNBH3)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide，EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)和乙烯基吡咯烷酮(N-vinyl-2-pyrrolidinone，NVP)(Sigma公司);過硫酸銨(ammonium persulfate，APS，Acros公司);乙腈(acetonitrile，ACN，色譜純，Merck公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水系統(tǒng)(Millipore公司)制備的超純水。WAX和WCX 填料(10 μm，100 nm(1 000 ?)，TOSOH 公司)，C18填料(5 μm，10 nm(100 ?)，Phenomenex公司)。Hca-F/Hca-P由大連醫(yī)科大學(xué)邵淑娟教授惠贈(zèng)。

實(shí)驗(yàn)使用的儀器包括高效液相色譜-電噴霧-線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜儀(HPLC-ESILTQ-Orbitrap Velos，Thermo Fisher Scientific公司)、高速離心機(jī)(Beckman Coulter公司)、組織破碎儀(Biospec Products公司)、超聲破碎儀(Vernon Hills公司)和真空濃縮儀(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系蛋白質(zhì)的提取

首先，兩種細(xì)胞系用1×PBS緩沖液(phosphate buffered saline，pH 7.2)洗凈血液，并用含有 0.1%(v/v)蛋白酶抑制劑的8 mol/L尿素溶液作為裂解液懸浮細(xì)胞系。將細(xì)胞在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下于冰浴中勻漿1 min，然后超聲破碎100 s(破碎能量設(shè)置為100%)。超聲破碎后的懸浮液在4℃冰箱中消泡后，在25 000 g下離心30 min。棄去沉淀，上清液按照樣品與丙酮體積比為1∶4的比例加入-80℃丙酮過夜。于1 000 g下離心10 s，棄去上清后冷凍干燥。最后用8 mol/L尿素溶液將蛋白質(zhì)復(fù)溶，并用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。樣品在-20℃保存待用。

1.3 蛋白質(zhì)二甲基化標(biāo)記

向200 μg Hca-P 提取蛋白質(zhì)中加入 4 μL 0.1 mol/L DTT，在56℃水浴中反應(yīng)1 h;再加入8 μL 0.1 mol/L IAA，避光反應(yīng)30 min。稀釋10倍后，將其等分成兩份分別用16 μL輕標(biāo)記試劑(4%(v/v)CH2O，0.6 mol/L NaCNBH3)和重標(biāo)記試劑(4%(v/v)CD2O，0.6 mol/L NaCNBH3)標(biāo)記1 h;標(biāo)記完成后，加入16 μL 1%(v/v)氨水終止反應(yīng)。用捕集柱(C8，10 mm ×4.6 mm，5 μm，30 nm(300 ?))除去標(biāo)記蛋白質(zhì)中的鹽;冷凍蒸干后于-20℃保存待用。

Hca-F提取蛋白質(zhì)經(jīng)類似步驟進(jìn)行DTT還原和IAA烷基化后，用重標(biāo)記試劑(CD2O+NaCNBH3)標(biāo)記，然后和輕標(biāo)記的Hca-P按照等質(zhì)量混合。除鹽后冷凍蒸干，于-20℃保存待用。

1.4 hIMER的制備

按照文獻(xiàn)［14］所述方法制備hIMER。簡(jiǎn)言之，將10 mg聚丙烯酸酯修飾的氨基微球加入到NVP溶液中(NVP∶H2O=1∶9，v/v)，并用 APS 引發(fā)，在40℃下反應(yīng)40 h。用水和甲醇清洗3次后，將微球注入5 cm ×150 μm 的毛細(xì)管中。將2.5 mg/mL胰蛋白酶、5 mg/mL EDC和5 mg/mL NHS溶于100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.0)，振蕩2 h。然后在室溫下將混合液不間斷地通入毛細(xì)管中進(jìn)行胰蛋白酶的固定，反應(yīng)時(shí)間為6 h。用溶于20 mmol/L NH4HCO3緩沖液(pH 8.0)的25%(v/v)乙腈沖洗后，再用20 mmol/L NH4HCO3緩沖液(pH 8.0)沖洗，然后于4℃保存待用。

1.5 在線酶解和LC-MS/MS分析

將5 μg輕(L)、重(H)標(biāo)記的 Hca-P/Hca-P 或Hca-P/Hca-F蛋白質(zhì)混合物分別以1 μL/min的流速上樣到 WAX/WCX柱(60 mm ×150 μm)。采用5個(gè)鹽臺(tái)階梯度(20，50，100，200和 1 000 mmol/L的醋酸銨溶液，pH 8.0)將蛋白質(zhì)洗脫至hIMER中，并進(jìn)行不停留在線酶解。每個(gè)組分的酶解產(chǎn)物用C18的捕集柱捕集后，依次進(jìn)行nanoRPLCESI-MS/MS分析。

nanoRPLC分離條件如下。C18色譜柱:200 mm×75 μm;流動(dòng)相 A:98%H2O+2%ACN+0.1%甲酸(FA)，流動(dòng)相 B:98%ACN+2%H2O+0.1%FA;梯度:0～15～15.1～20～100～105～105.1～125 min，0%B～0%B～0%B～5%B～35%B～80%B ～80%B ～0%B;前15 min流速為6 μL/min，后110 min流速為300 nL/min。

質(zhì)譜條件如下。LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜;噴霧電壓:2.0 kV;離子傳輸毛細(xì)管加熱溫度:250℃。全掃描模式分辨率(Rs):60 000，掃描范圍:m/z 350～1 800;每個(gè)全掃描后選擇20個(gè)強(qiáng)度最強(qiáng)的離子進(jìn)行碎裂;子離子掃描采用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)模式和數(shù)據(jù)依賴采集(DDA)模式;碰撞能量:35%;母離子分離窗口寬度:2 Th;采用動(dòng)態(tài)排除模式，重復(fù)次數(shù)為1，排除時(shí)間為40 s。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有采集到的數(shù)據(jù)采用 MaxQuant(1.3.0.4版本)內(nèi)置的Andromeda軟件作為搜索引擎。蛋白質(zhì)序列庫(kù)選擇 IPI.mouse.fasta(3.68 版本，共 56 729種蛋白質(zhì)序列)，并附加反庫(kù)和常見的污染物蛋白質(zhì)庫(kù)。半胱氨酸烷基化(+52.021 5)設(shè)為固定修飾;蛋白質(zhì)的N端乙?；?+42.061 6)、甲硫氨酸氧化(+15.994 9)設(shè)為可變修飾。氨基酸標(biāo)記設(shè)置:輕標(biāo)記時(shí)Lys的相對(duì)分子質(zhì)量增加28.031 3，重標(biāo)記時(shí)Lys增加32.056 4。蛋白酶選擇胰蛋白酶，允許最多4個(gè)漏切位點(diǎn)。一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量容差為6 ppm，二級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量容差為20 ppm，肽段和蛋白質(zhì)水平的假陽(yáng)性率(FDR)均低于1%。選擇蛋白質(zhì)簇中的唯一性肽段用于蛋白質(zhì)的定量，至少有1條唯一性肽段。

2 結(jié)果與討論

圖1 集成化蛋白質(zhì)組定量分析平臺(tái)示意圖Fig.1 Scheme of integrated platform for proteome quantificationa.μWAX/WCX for online separation of the dimethylated proteins;b.hIMER for online digestion;c.nano-RPLC for separation of the protein digests.WAX/WCX:weak anion exchange/weak cation exchange chromatography;hIMER:hydrophilic immobilized enzymatic reactor.

如圖1所示，構(gòu)建了新型蛋白質(zhì)定量分析平臺(tái)。該平臺(tái)包括以下3個(gè)部分:(a)微柱弱陰/弱陽(yáng)離子交換色譜(μWAX/WCX)用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的分級(jí);(b)hIMER用于蛋白質(zhì)水平的在線酶解;(c)nanoRPLC用于酶解產(chǎn)物的分離。通過該集成化系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)標(biāo)記蛋白質(zhì)的分級(jí)、在線酶解和酶解產(chǎn)物的分離。

2.1 在線酶解對(duì)蛋白質(zhì)組定量的影響

蛋白質(zhì)的酶解效率對(duì)蛋白質(zhì)組定量極為關(guān)鍵。常見的酶解方法可分自由溶液酶解和IMER酶解。與自由溶液酶解相比，IMER的酶解效率更高，但是容易產(chǎn)生含漏切位點(diǎn)的肽段，導(dǎo)致定量結(jié)果中離散點(diǎn)較多，從而影響定量準(zhǔn)確度［15］。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)親水性基團(tuán)改性的IMER進(jìn)行在線酶解。將Hca-P蛋白質(zhì)變性、還原和烷基化后直接進(jìn)行輕、重二甲基化標(biāo)記，以H/L=1∶1(質(zhì)量比)混合后經(jīng)WAX/WCX分級(jí)，并在hIMER上進(jìn)行不停留酶解后進(jìn)行分析，考察該平臺(tái)在線酶解對(duì)定量結(jié)果的影響。

表1列出了所有肽段及匹配的漏切肽段的定量比值，可以看出共有21組肽段有不漏切和漏切兩種情況。將使用漏切肽段獲得的H/L結(jié)果與使用無(wú)漏切肽段獲得的結(jié)果相比，結(jié)果介于0.533和1.37之間，說明采用漏切與無(wú)漏切肽段進(jìn)行的定量結(jié)果相近。結(jié)果表明，在蛋白質(zhì)水平標(biāo)記后混合進(jìn)入IMER實(shí)現(xiàn)同時(shí)酶解，可以消除漏切對(duì)定量準(zhǔn)確度的影響。

此外，考察了hIMER基質(zhì)的非特異性吸附對(duì)定量的影響。盡管采用hIMER可以顯著降低基質(zhì)的非特異性吸附，但仍然不可完全避免。以輕、重標(biāo)記的KACGDSTLTQITAGLDPVGR為例，考察了該肽段在不同鹽濃度洗脫時(shí)獲得的定量比值。從圖2可以看出，在不同鹽濃度下該肽段的強(qiáng)度從8.97×106逐漸降低到 1.92×105，而 H/L比值分別為1.18、1.22 和1.16;這說明 hIMER 的非特異性吸附對(duì)肽段的定量影響較小。

實(shí)驗(yàn)中采用了hIMER在線無(wú)停留的酶解，酶解時(shí)間僅為10 min。相比于24 h的自由溶液酶解，hIMER酶解大大降低了樣品預(yù)處理的時(shí)間，從而提高了定量分析的通量。

2.2 蛋白質(zhì)水平的二甲基化標(biāo)記效率

二甲基化標(biāo)記通常是在肽段水平上進(jìn)行的，但由于甲醛與氨基反應(yīng)效率較高，因此本文利用甲醛與蛋白質(zhì)中賴氨酸(K)上的氨基反應(yīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)水平標(biāo)記，并考察了標(biāo)記效率。

以H/L=1∶1(質(zhì)量比)的Hca-P提取蛋白質(zhì)為樣品，經(jīng)蛋白質(zhì)水平的二甲基標(biāo)記和集成化平臺(tái)分析，共鑒定到625條肽段，其中440條含有K。含有不同數(shù)目K的肽段的標(biāo)記效率如表2所示。當(dāng)肽段中含有5個(gè)K時(shí)，有4條肽段上的K只標(biāo)記了3～4個(gè)，被完全標(biāo)記的肽段的比例僅為42.9%;在其余情況下被完全標(biāo)記的肽段的比例均在90%左右。這說明盡管在蛋白質(zhì)水平的二甲基化標(biāo)記效率略低于肽段水平，但蛋白質(zhì)組定量結(jié)果與理論值相符。

表1 經(jīng)hIMER在線酶解產(chǎn)生的肽段及其匹配的漏切肽段的定量結(jié)果Table 1 Quantification results of peptides and the corresponding peptides with miscleavages resulting from onlinedigestion by hIMER

圖2 輕、重標(biāo)記的肽段KACGDSTLTQITAGLDPVGR在不同NH4Ac濃度洗脫后的定量結(jié)果Fig.2 Quantification results of H/L labeled peptide(KACGDSTLTQITAGLDPVGR)eluted by different NH4Ac concentrationsa.20 mmol/L;b.50 mmol/L;c.100 mmol/L.

表2 二甲基化蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中含有不同賴氨酸數(shù)目的肽段的標(biāo)記數(shù)量Table 2 Labeled peptides of dimethylated proteins digests with different lysine numbers

2.3 集成化蛋白質(zhì)組定量平臺(tái)的性能評(píng)價(jià)

以H/L=1∶1(質(zhì)量比)混合的二甲基化標(biāo)記的Hca-P蛋白質(zhì)為樣品，平行分析兩次;選擇兩次都定量到的蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)分析，共103種。蛋白質(zhì)組的定量結(jié)果分布如圖3所示，獲得的H/L的比值介于0.589 和 2.30，平均值為 1.01;說明該平臺(tái)具有良好的定量準(zhǔn)確度。這應(yīng)歸因于蛋白質(zhì)水平標(biāo)記混合后進(jìn)行酶解，消除了漏切和肽段水平混合產(chǎn)生的誤差。此外，利用該平臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化蛋白質(zhì)組定量分析，避免了人為操作引入的誤差。

圖3 H/L=1∶1(質(zhì)量比)的Hca-P蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)集成化定量分析平臺(tái)得到的蛋白質(zhì)的比值Fig.3 Protein expression ratios(H/L=1∶1(mass ratio)，Hca-P protein mixture)obtained by the integrated quantification platform

2.4 集成化蛋白質(zhì)組定量平臺(tái)的應(yīng)用

利用該集成化蛋白質(zhì)組定量分析平臺(tái)，開展了小鼠腹水型肝癌淋巴道高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的差異蛋白質(zhì)分析。實(shí)驗(yàn)平行分析了3次，選擇2次以上定量到的蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)分析，共197種蛋白質(zhì);以2倍差異為依據(jù)時(shí)，共發(fā)現(xiàn)12種蛋白質(zhì)在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中低表達(dá)，15種蛋白質(zhì)在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中高表達(dá)。

在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中高表達(dá)的蛋白質(zhì)中，HSP-27是熱休克蛋白質(zhì)的一種，參與抑制NF-αB通路從而阻斷細(xì)胞凋亡，已在多個(gè)實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)在高轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞系中顯著高表達(dá)［16-18］;膜聯(lián)蛋白 A3(Annexin A3)是膜聯(lián)蛋白的一種，也已被證實(shí)該蛋白質(zhì)的上調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)［19］。

在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中低表達(dá)的蛋白質(zhì)中，F(xiàn)ga(fibrinogen，alpha polypeptide isoform 1)、CNBP(cellular nucleic acid-binding protein)和SLIRP(SRA stem-loop-interacting RNA-binding protein，mitochondrial)通過準(zhǔn)等重二甲基化標(biāo)記的方法［17］定量到，且變化趨勢(shì)與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相同。Fga除參與凝血外，還參與細(xì)胞-細(xì)胞間的黏附以及細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附作用;CNBP是一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)脂類代謝;SLIRP是一種核受體輔阻遏子，與SRA RNA結(jié)合，抑制SRA-介導(dǎo)的核受體的共激活。這3種蛋白質(zhì)抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)理尚未見報(bào)道。

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了一種由二甲基化蛋白質(zhì)分級(jí)、在線酶解、肽段分離和質(zhì)譜分析構(gòu)成的集成化蛋白質(zhì)組定量分析平臺(tái)，并將其用于小鼠腹水型肝癌淋巴道高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的差異蛋白質(zhì)分析。結(jié)果顯示，利用該平臺(tái)顯著提高了蛋白質(zhì)組定量的準(zhǔn)確度、通量和自動(dòng)化程度。因此有望與SILAC技術(shù)結(jié)合，在規(guī)?；鞍踪|(zhì)組定量中發(fā)揮重要作用。

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