黃 志， 洪廣峰， 高明霞， 張祥民*

(1.復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海200433;2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海200032)

尋找疾病分子標(biāo)記物是疾病蛋白質(zhì)組學(xué)極為重要的研究?jī)?nèi)容，臨床診斷中采用的許多疾病分子標(biāo)記物都是糖蛋白［1，2］。血漿是臨床醫(yī)學(xué)中最為普遍的檢測(cè)樣本，因而成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)對(duì)象，但當(dāng)前對(duì)血漿樣品進(jìn)行疾病標(biāo)志物的規(guī)模化篩選方法還不成熟，這主要是由于血漿樣品中蛋白質(zhì)濃度范圍非常廣，達(dá)到10個(gè)數(shù)量級(jí)，其中22種高豐度蛋白質(zhì)占了整個(gè)蛋白質(zhì)總量的99%，而中低豐度蛋白質(zhì)所占比例僅為1%［3］。高豐度蛋白質(zhì)的存在嚴(yán)重干擾了中低豐度蛋白質(zhì)的鑒定研究，不利于疾病分子標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)［4，5］。目前，主要是采用免疫親和柱特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法來去除血漿中的一些高豐度蛋白質(zhì)［6－9］。雖然這種方法特異性很高，但是研究發(fā)現(xiàn)，在這個(gè)過程中一些低豐度蛋白質(zhì)也會(huì)被除去，從而可能會(huì)丟失一些潛在的疾病分子標(biāo)記物［9］。另外，目前由于免疫親和柱能夠特異性去除的高豐度蛋白質(zhì)種類有限，且抗體的制備費(fèi)用很高，因此免疫親和柱特別是可同時(shí)去除多種高豐度蛋白質(zhì)的免疫親和柱的使用很有限。

蛋白質(zhì)組學(xué)的色譜分離主要是基于蛋白質(zhì)或肽段在色譜柱上有不同的保留行為而得以實(shí)現(xiàn)的。馬成等［10］利用兩性親水作用色譜(ZIC-HILIC)材料制備親水富集柱，結(jié)合堿性反相色譜進(jìn)行了肽段的預(yù)分離和高準(zhǔn)確度的質(zhì)譜分析，對(duì)人血漿蛋白的糖基化進(jìn)行了研究，最終在健康人的血漿中鑒定到了299個(gè)糖基化蛋白、637個(gè)糖基化位點(diǎn)并識(shí)別出了31種不同的糖型。將不同的色譜分離模式進(jìn)行組合可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜生物樣品的有效分離［11］。相較于免疫親和柱去除高豐度蛋白質(zhì)的方法，多維色譜分離去除高豐度蛋白質(zhì)的方法具有能去除未知高豐度蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。在前期研究中，本課題組［12，13］采用強(qiáng)陰離子交換色譜-反相高效液相色譜(SAXRPLC)離線二維分離系統(tǒng)，在對(duì)二維分離梯度進(jìn)行優(yōu)化后，實(shí)現(xiàn)了血漿蛋白質(zhì)的有效分離，對(duì)其中高豐度蛋白質(zhì)餾分進(jìn)行了串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)鑒定，實(shí)現(xiàn)了高豐度蛋白質(zhì)的色譜定位，鑒定得到了68種高豐度蛋白質(zhì)，為血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究提供了重要思路。

離線多維色譜分離系統(tǒng)以其高效、高分辨率的特點(diǎn)成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域不可缺少的分離技術(shù)。但目前這種技術(shù)的第二維分離一般是單色譜柱-檢測(cè)器模式，且第二維的分離只有在對(duì)前一個(gè)第一維餾分分離完之后才能進(jìn)行下一個(gè)餾分的分離，依次進(jìn)行，直至將第一維所有的餾分分離完畢。這種離線分離模式的通量太低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在大規(guī)模樣品分析中的應(yīng)用受到了一定的限制。此外，這種技術(shù)在對(duì)第一維餾分的離線處理過程中，不可避免地會(huì)有樣品的損失，給后續(xù)分離鑒定帶來一定的不利影響。因此發(fā)展快速、高通量、損失小的蛋白質(zhì)分離技術(shù)成為推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的迫切需要。

在線多維陣列式色譜是一種極具潛力的蛋白質(zhì)分離技術(shù)［14］。本研究針對(duì)血漿樣品中高豐度蛋白質(zhì)非常集中的特點(diǎn)，采用蛋白質(zhì)負(fù)載量更大、生物兼容性更好、具有耐壓能力的ProPacTMSAX-10強(qiáng)陰離子交換色譜柱(SAX)作為第一維分離柱、采用8根XtimateTMC8反相色譜常規(guī)柱作為第二維陣列分離柱，從而搭建了一套陣列式常規(guī)柱二維色譜分離平臺(tái)，對(duì)血漿中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了完整蛋白質(zhì)水平上的分離，為血漿蛋白質(zhì)組學(xué)更深入的研究提供一種重要的分離分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

色譜系統(tǒng)為島津2010A色譜系統(tǒng)(日本島津公司)，餾分收集裝置為Probot LC Packing餾分收集裝置(美國(guó)Dionex公司)。六通進(jìn)樣閥、十通電動(dòng)切換閥、三通、八通分流器(Valco Instruments公司)。第一維SAX柱為ProPacTMSAX-10柱(250 mm×4.0 mm，10 μm)，其與保護(hù)柱均購(gòu)于美國(guó)Dionex公司;第二維分離柱為XtimateTMC8柱(250 mm×2.1 mm，粒徑為 5 μm，孔徑為 30 nm)，其與保護(hù)柱均購(gòu)自上海月旭材料科技有限公司。二喹啉甲酸(BCA)染色測(cè)定采用Epoch超微量微孔板分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)。

圖1 在線陣列式二維常規(guī)柱液相色譜系統(tǒng)原理圖Fig.1 Schematic diagram of online conventional arraybased 2D liquid chromatographic system1.HPLC gradient pump;2.6-port valve;3.SAX column;4.6-port valve;5.UV detector;6.10-port fraction swith valve;7.3-port valve;8.precolumn array;9.8-channel splitter;10.RP column array;11.8-channel fraction collector.

乙腈(ACN，HPLC純，德國(guó) Merck公司)，三氟乙酸(TFA，HPLC純)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)(美國(guó) Sigma公司);蛋白質(zhì)定量試劑盒 Quick StartTMBradford protein assay(美國(guó)Bio-Rad公司);BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司);實(shí)驗(yàn)中所用水為Millipore純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)處理后的高純水;其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 血漿及處理

血漿來源于上海華山醫(yī)院檢驗(yàn)科5名健康人的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血漿。血漿經(jīng)2 000 g、4℃條件下離心15 min，取上清液，分裝，于－80℃下保存待用。血漿總蛋白通過Bradford法定量，濃度為74.67 mg/mL。

1.3 系統(tǒng)組成

陣列式二維常規(guī)柱色譜分離系統(tǒng)如圖1所示，由1臺(tái)四元梯度色譜泵(1)、1個(gè)配有2 mL進(jìn)樣環(huán)的六通道進(jìn)樣閥(2)、1個(gè)液相六通閥(4)、1個(gè)十通道電動(dòng)切換閥(6)、1個(gè)八通道分流器(9)、8個(gè)Valco三通(7)、1根強(qiáng)陰離子交換色譜柱(3)、8根常規(guī)反相保護(hù)柱(8)、8根常規(guī)反相色譜柱組成的陣列色譜柱(10)、1臺(tái)紫外檢測(cè)器(5)及1個(gè)餾分收集儀(11)組成。其中，配有2 mL進(jìn)樣環(huán)的六通道進(jìn)樣閥(2)的1號(hào)孔為進(jìn)樣口，3號(hào)孔與四元色譜泵(1)相連，4號(hào)孔與液相六通閥(4)的1號(hào)孔相連，液相六通閥(4)的3號(hào)孔與廢液瓶相通，6、5號(hào)孔分別與第一維SAX色譜柱(3)進(jìn)口、出口端相連，4號(hào)孔與紫外檢測(cè)器(5)的進(jìn)口端相連，以構(gòu)成系統(tǒng)的第一維SAX進(jìn)樣分離系統(tǒng)。紫外檢測(cè)器(5)的出口端與十通閥(6)的進(jìn)口端相連，十通閥(6)的1號(hào)孔與廢液瓶相通，10號(hào)孔封閉，2～9號(hào)孔分別與8個(gè)Valco三通(7)的一個(gè)端口相連，Valco三通(7)的另一個(gè)端口直接與陣列RPLC分析柱(10)的進(jìn)口端相連，8個(gè)Valco三通(7)的第三個(gè)端口與8根反相保護(hù)柱(8)相連，八通道分流器(9)的8個(gè)端口與8根反相保護(hù)柱(8)相連接;液相六通閥(4)的2號(hào)孔與十通道分流器(9)的另一端口相連，以實(shí)現(xiàn)第一維SAX餾分到第二維反相色譜柱的轉(zhuǎn)移;陣列色譜柱(10)的出口端與餾分收集器(11)相連，構(gòu)成第二維陣列RPLC餾分收集部分。

1.4 血漿的SAX分離

第一維SAX分離在島津LC-2010A色譜系統(tǒng)上進(jìn)行，此時(shí)液相六通閥(4)的1號(hào)孔和6號(hào)孔相連。流動(dòng)相A為10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;流動(dòng)相B為10 mmol/L Tris-HCl(含0.5 mol/L NaCl)，pH 8.0。流速為0.5 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。血漿用流動(dòng)相A稀釋4倍，于2 000 g、4℃下離心15 min，再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為50 μL。梯度洗脫程序:0～5 min，0%B;5～15 min，0%B～10%B;15～45 min，10%B～26%B;45～70 min，26%B～40%B;70～90 min，40%B ～67%B;90～90.1 min，67%B ～100%B;90.1～100 min，100%B;100～100.1 min，100%B ～0%B;100.1～130 min，0%B。將SAX分離得到的餾分通過十通閥(6)的2～9號(hào)孔依次切換轉(zhuǎn)移到第二維8根反相保護(hù)柱(8)上，餾分的收集時(shí)間:反相柱1為0～25 min，反相柱2為25～40 min，反相柱3為40～55 min，反相柱4為55～70 min，反相柱5為70～80 min，反相柱6為80～90 min，反相柱7為90～100 min，反相柱8為100～130 min。

1.5 SAX餾分的陣列式第二維反相色譜在線分離

第二維RPLC分離在島津LC-2010A色譜系統(tǒng)上進(jìn)行，采用Probot LC Packing裝置進(jìn)行餾分收集，此時(shí)液相六通閥(4)的1號(hào)孔和2號(hào)孔相連，十通閥(6)切換至10號(hào)孔。流動(dòng)相A為5%ACN-95%H2O-0.1%TFA;流動(dòng)相 B為 95%ACN-5%H2O-0.1%TFA。流速為1.6 mL/min。第二維分離的梯度洗脫程序:0～5 min，0%B;5～15 min，0%B～25%B;15～25 min，25%B～33%B;25～60 min，33%B ～40%B;60～80 min，40%B ～54%B;80～85 min，54%B～67%B;85～85.1 min，67%B～100%B;85.1～95 min，100%B;95～95.1 min，100%B～0%B;95.1～110 min，0%B。將餾分收集于96孔板上，收集時(shí)間為1 min/孔，每孔中餾分體積為200 μL。

1.6 餾分的BCA蛋白質(zhì)定量

按照BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說明配制BCA染色液，向收集了第二維餾分的96孔板中加入100 μL BCA染色液，于37℃下反應(yīng)30 min后，在562 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，用Epoch超微量酶標(biāo)儀進(jìn)行定量檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 陣列式二維常規(guī)柱色譜分離系統(tǒng)的工作原理

考慮到樣品中蛋白質(zhì)的復(fù)雜性以及傳統(tǒng)的二維常規(guī)柱色譜分離系統(tǒng)的有限通量，本研究提出了一種新的分離策略，即在第二維采用多通道反相色譜分離模式，并將各段分離得到的餾分收集到96孔板上，以便后續(xù)蛋白質(zhì)鑒定的研究。這種分離策略既具有多維液相色譜的高分辨又具備了陣列式色譜的高通量的特點(diǎn)。

本文中以1根SAX柱(3)作為分離系統(tǒng)的第一維，再將所得餾分通過第二維8根陣列式反相色譜柱(10)進(jìn)行分離，第一維和第二維通過第二維的反相預(yù)柱(8)連接。通過十通閥(6)的切換，第一維的SAX分離可以連續(xù)逐一地與第二維的每一個(gè)通路相連接，這樣第一維各段餾分都被相應(yīng)地獨(dú)立轉(zhuǎn)移到第二維反相預(yù)柱(8)上，并得以在線富集(見圖1)。為了能使第二維8根陣列式反相分析柱(10)能同時(shí)進(jìn)行分離，我們使用了1個(gè)八通道的分流器(9)，第二維的流動(dòng)相通過分流器后被分成8個(gè)支路流經(jīng)反相預(yù)柱，預(yù)柱所富集的蛋白質(zhì)被同時(shí)沖洗進(jìn)入到陣列式反相分析柱(10)得以分離。

為了能夠同時(shí)收集第二維8個(gè)通道反相分離的餾分，我們對(duì)單通道餾分收集裝置進(jìn)行了餾分收集接口的改裝(見圖2)，以用于并行式收集。接口用PEEK材料微加工制作，上部線性等間距排列有8個(gè)孔道，接口的上端與陣列反相柱相連，下端與點(diǎn)樣針(4.7 cm，500 μm i.d.×2 mm o.d.)相接。點(diǎn)樣針陣列間距為9 mm，末端位于96孔板上方2 cm。

圖2 8通道餾分收集儀接口實(shí)物圖Fig.2 Photograph of an 8-channel fraction collector interface

采用陣列式二維常規(guī)柱色譜分離系統(tǒng)進(jìn)行分析，使復(fù)雜樣品的整個(gè)分離時(shí)間大幅縮短(為單柱分離的1/8)。本系統(tǒng)第二維陣列反相柱分離是同時(shí)獨(dú)立進(jìn)行的，其在大幅提高分離通量的同時(shí)，也無需考慮第二維僅用1根反相柱時(shí)所出現(xiàn)的分離速度與分離效率間平衡的問題，因此可以提高系統(tǒng)分離復(fù)雜樣品時(shí)的通量和總峰容量。此外，BCA蛋白質(zhì)染色法具有準(zhǔn)確、便捷的特點(diǎn)，因而被用于分析96孔板中收集到的餾分，以進(jìn)行血漿樣品中較高豐度蛋白質(zhì)的快速定位分析。

2.2 血漿蛋白質(zhì)的第一維SAX分離

離子交換色譜利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換的能力差異實(shí)現(xiàn)分離，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。本課題組曾對(duì)強(qiáng)陰離子交換柱(SAX)和弱陰離子交換柱(WAX)的分離能力進(jìn)行了比較［15］，發(fā)現(xiàn):相較于WAX 分離，SAX 具有更大的蛋白質(zhì)負(fù)載量，所用流動(dòng)相的pH條件更接近于生理pH，能減少部分蛋白質(zhì)在酸性條件下的損失，因此本研究采用SAX作為第一維分離柱。本系統(tǒng)第一維SAX柱和第二維反相預(yù)柱相連，分離過程中相同流速下系統(tǒng)壓力遠(yuǎn)高于單一SAX柱分離過程，而TSKgel SuperQ-5PW柱所能承受的最大壓力為2×106Pa，在不更換SAX柱、保證分離效果的情況下降低流動(dòng)相流速勢(shì)必要大幅延長(zhǎng)分離時(shí)間，因此最終采用耐壓能力更高的ProPacTMSAX-10柱為第一維分離柱，在不斷優(yōu)化梯度洗脫條件后，確定了130 min的洗脫條件，由圖3可見血漿樣品在第一維上得到了較好的分離。根據(jù)色譜峰的強(qiáng)度變化依次將餾分轉(zhuǎn)移到第二維預(yù)柱上進(jìn)行在線富集。

圖3 血漿蛋白質(zhì)的第一維SAX分離色譜圖Fig.3 Chromatogram of human plasma proteins by the first dimensional SAXColumn:ProPacTMSAX-10(250 mm ×4.0 mm，10 μm).Mobile phase A:10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;mobile phase B:10 mmol/L Tris-HCl containing 0.5 mol/L NaCl，pH 8.0.Flow rate:0.5 mL/min.Loading amount:700 μg of plasma proteins.UV detection wavelength:215 nm.Gradient:0－5 min，0%B;5－15 min，0%B－10%B;15－45 min，10%B－26%B;45－70 min，26%B－40%B;70－90 min，40%B－67%B;90－90.1 min，67%B－100%B;90.1－100 min，100%B;100－100.1 min，100%B－0%B;100.1－130 min，0%B.

2.3 血漿蛋白質(zhì)的第二維陣列式反相色譜分離

血漿蛋白質(zhì)經(jīng)第一維SAX分離的餾分在第二維反相預(yù)柱上得以保留、富集，通過液相六通閥(4)切換，第二維的流動(dòng)相通過分流器(9)后分成8個(gè)支路將反相預(yù)柱上的蛋白質(zhì)反沖至陣列式反相分析柱上進(jìn)行分離，這個(gè)過程既能避免離線二維色譜分離系統(tǒng)中第一維餾分凍干所帶來的損失，又具有高通量的優(yōu)點(diǎn)。本課題組曾利用Jupiter C4反相柱(250 mm ×4.6 mm，粒徑 5 μm，孔徑 30 nm)在 1 mL/min流速下進(jìn)行血漿的第二維分離，得到了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［12，13］。而本實(shí)驗(yàn)中，由于后續(xù)收集餾分采用96孔板，其單孔體積為360 μL，如果仍采用4.6 mm內(nèi)徑的Jupiter C4反相柱，采樣時(shí)間僅為20 s/孔，不利于餾分收集儀的準(zhǔn)確定位收集，因此我們采用了2.1 mm內(nèi)徑規(guī)格的XtimateTMC8反相柱作為第二維陣列分析柱，各通道流速均為0.2 mL/min，餾分收集儀采樣時(shí)間為60 s/孔。在Jupiter C4反相柱第二維分離的洗脫梯度基礎(chǔ)上，優(yōu)化并確定了一個(gè)110 min的洗脫梯度，對(duì)8根陣列式反相色譜柱進(jìn)行了同步洗脫分離。圖4顯示較高豐度的蛋白質(zhì)主要集中在第一維SAX的第3、5、6號(hào)餾分中。

圖4 SAX餾分的第二維陣列式反相色譜分離的色譜圖Fig.4 Magnified array R PLC chromatograms of SAX fractionsColumn:XtimateTMC8(250 mm ×2.1 mm，5 μm，30 nm).Mobile phase A:5%ACN-95%H2O-0.1%TFA;mobile phase B:95%ACN-5%H2O-0.1%TFA .Flow rate:0.2 mL/min.UV detection wavelength:215 nm.Gradient:0－5 min，0%B;5－15 min，0%B－25%B;15－25 min，25%B－33%B;25－60 min，33%B－40%B;60－80 min，40%B－54%B;80－85 min，54%B－67%B;85－85.1 min，67%B－100%B;85.1－95 min，100%B;95－95.1 min，100%B－0%B;95.1－110 min，0%B.Collecting times of eight fractions from SAX:column 1，0－25 min;column 2，25－40 min;column 3，40－55 min;column 4，55－70 min;column 5，70－80 min;column 6，80－90 min;column 7，90－100 min;column 8，100－130 min.

2.4 血漿反相色譜分離餾分的BCA染色定量

將第二維陣列式反相色譜分離所得的餾分采用BCA染色法進(jìn)行蛋白定量，獲得的染色結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示:紫色較深處蛋白質(zhì)濃度較高，為較高豐度的蛋白質(zhì)。圖6為用酶標(biāo)儀定量測(cè)定的96孔板中餾分蛋白含量的繪制圖，對(duì)比發(fā)現(xiàn):圖4與圖6的曲線形狀大致相同，說明BCA蛋白質(zhì)染色法適用于本系統(tǒng)餾分中蛋白質(zhì)的快速定量分析，為后續(xù)高豐度蛋白質(zhì)的快速定位及去除提供了可靠的依據(jù)。

圖5 血漿蛋白陣列式反相色譜餾分的BCA蛋白質(zhì)染色圖Fig.5 Photographs of BCA assay of the human plasma proteins in the array-based R PLC effluents

圖6 血漿蛋白陣列式反相色譜餾分的BCA酶標(biāo)檢測(cè)圖Fig.6 Plots of BCA assay of the human plasma proteins in the array-based R PLC effluents based on microplate reader detection

3 結(jié)論

本文成功建立了一種在線高通量陣列式二維常規(guī)柱液相色譜分離系統(tǒng)，并成功應(yīng)用于血漿中蛋白質(zhì)在完整蛋白質(zhì)水平上的分離。相較于傳統(tǒng)的單柱分離系統(tǒng)，本文的整體二維系統(tǒng)對(duì)復(fù)雜樣品的分離時(shí)間大幅縮短(為單柱分離的1/8)，且二維分離之間以及第二維陣列色譜柱之間均相互獨(dú)立，從而可以提高系統(tǒng)分離復(fù)雜樣品時(shí)的通量和總峰容量。借助BCA蛋白染色法的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，有助于較高豐度蛋白質(zhì)的快速定位，為后續(xù)蛋白質(zhì)水平的深入研究奠定了基礎(chǔ)。另外，本課題組正在研究將分子印跡、均衡器等新材料運(yùn)用到上述系統(tǒng)復(fù)雜樣品的處理過程中，以降低樣品的復(fù)雜度、提高低豐度蛋白質(zhì)的鑒定能力，為血漿蛋白質(zhì)組學(xué)和疾病蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究提供一種重要手段。

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