張浩，丁鵬，王進(jìn)昆，蘇穩(wěn)，牟臨杰，王波，龔光輝，劉景傳，王崇謙

單核細(xì)胞趨化蛋白-1對(duì)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用①

張浩，丁鵬，王進(jìn)昆，蘇穩(wěn)，牟臨杰，王波，龔光輝，劉景傳，王崇謙

目的探討外源性單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)對(duì)體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的作用。方法成年雄性Sprague-Dawley大鼠64只分為空白組(n=4)、對(duì)照組(n=30)和實(shí)驗(yàn)組(n=30)?？瞻捉M不做處理，對(duì)照組大腦皮層微量定向注射PBS液，實(shí)驗(yàn)組注射MCP-1。注射后3 d、5 d、7 d、14 d、21 d分別取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠各6只灌注取腦。免疫組織化學(xué)法觀察腦內(nèi)不同部位nestin陽性細(xì)胞的分布。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)nestin陽性細(xì)胞矯正累積吸光度隨時(shí)間延長而顯著增加(P＜0.001)。對(duì)照組和空白組之間無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論外源性MCP-1可以促進(jìn)MCP-1富集部位的nestin陽性細(xì)胞的數(shù)量增多。

單核細(xì)胞趨化因子-1；神經(jīng)干細(xì)胞；趨化因子；nestin

[本文著錄格式] 張浩，丁鵬，王進(jìn)昆，等.單核細(xì)胞趨化蛋白-1對(duì)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2014,20(5):434-441.

20世紀(jì)90年代，Galli等從成年小鼠紋狀體分離出一種能夠在體外分裂增殖、具有多分化潛能的細(xì)胞群，稱為神經(jīng)干細(xì)胞(neural progenitor/stem cells, NPCs)[1]，成年哺乳動(dòng)物主要分布在大腦側(cè)腦室壁的腦室下區(qū)(subventricular zone,SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層(subgranular zone,SGZ)。有研究表明，缺血性腦損傷能誘導(dǎo)體內(nèi)NPCs向損傷區(qū)域遷移[2]。局部NPCs受免疫細(xì)胞分泌的多種趨化因子影響[3-4]，其中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)可通過細(xì)胞表面趨化因子受體CCR2對(duì)海馬區(qū)增殖的神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生化學(xué)趨化作用[5-6]。MCP-1是細(xì)胞因子超家族中CC家族的成員[7]，不僅具有趨化效應(yīng)，還具有一系列調(diào)控單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞生物學(xué)活性的免疫學(xué)特性，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。2004年，Widera等證實(shí)在Boyden小室中，MCP-1可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移[8]。本研究探討外源性MCP-1對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

大鼠MCP-1：美國ABBIOTEC公司?？勾笫髇estin多克隆抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。蘇木精-伊紅染色(HE染色)試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所。立體定向儀：中西遠(yuǎn)大(武漢)科技有限公司。微量注射器：美國NANOFIL公司。大鼠開顱手術(shù)及麻醉消毒設(shè)備。LEICA RM2016型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)、LEICA DM1000型生物顯微鏡：德國LEICA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與造模

成年雄性Sprague-Dawley大鼠64只，體重200～250 g，昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物科提供。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[9]的規(guī)定。將大鼠MCP-1與PBS溶液充分混勻，制成濃度為500 ng/μl溶液。所有動(dòng)物隨機(jī)編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)表將其分為空白組(n=4)、對(duì)照組(n=30)和實(shí)驗(yàn)組(n=30)。

空白組不做任何處理。

實(shí)驗(yàn)組再分為3 d組、5 d組、7 d組、14 d組和21 d組，每組6只。10%水合氯醛2 ml/kg腹腔麻醉，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上。備皮，常規(guī)消毒鋪巾，沿頭皮矢狀縫切開，暴露顱骨。前囟后3.5 mm矢狀線左側(cè)2.2 mm用牙鉆磨出直徑為1 mm的骨窗。10 μl平頭微量注射器嚴(yán)格消毒后吸取MCP-1 5 μl，固定于大鼠腦立體定向儀的注射架上，緩慢插入大鼠硬膜下1 mm。以1 μl/min的速度注射到大鼠皮質(zhì)區(qū)。針頭留置腦內(nèi)5 min后，緩慢拔出。整個(gè)過程嚴(yán)格無菌操作。骨蠟密封骨窗，縫合頭皮，肌注慶大霉素預(yù)防感染。每隔3 d重復(fù)以上操作以保證大鼠皮質(zhì)的藥物濃度。

對(duì)照組再分為3 d組、5 d組、7 d組、14 d組和21 d組，每組6只。將注射液體改換為PBS液。其余操作與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.3 標(biāo)本采集

將分組后的大鼠按規(guī)定時(shí)間取材。10%水合氯醛2 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。大鼠仰臥位，四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，切開胸腔，暴露心臟。穿刺左心室，并切開右心耳，以生理鹽水灌洗，至右心耳灌流出液體清亮為止。夾閉腹主動(dòng)脈，多聚甲醛液灌注約30 min，待大鼠上肢僵直，快速取腦。將腦組織置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定。

1.4 切片制備

腦組織按目標(biāo)部位冠狀切塊，制成蠟塊；石蠟切片機(jī)連續(xù)冠狀位切片，厚4 μm。空白組和對(duì)照組選取相同部位進(jìn)行切片。每5張腦片取1張，共取8張。相鄰切片分別編號(hào)，脫蠟后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HE染色

各組3 d組(除空白組)標(biāo)本取同部位切片2張，行HE染色。200×光鏡下觀察腦組織病理變化。

1.6 nestin免疫組織化學(xué)染色

腦片3%H2O2室溫孵育，蒸餾水沖洗，PBS浸泡，10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育。滴加抗大鼠nestin多克隆抗體工作液，孵育1～2 h。滴加適量二抗工作液，孵育沖洗后，滴加適量辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，孵育，沖洗，顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。室溫晾干后400×顯微鏡下觀察拍片。圖片采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0分析計(jì)算累積光密度(IOD）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

實(shí)驗(yàn)組可見細(xì)微針孔及出血點(diǎn)，注射部位在大腦皮質(zhì)內(nèi)側(cè)1 mm處，海馬上方。腦內(nèi)有微量出血灶。對(duì)照組大腦解剖后表觀相同。

2.2 HE染色

空白組顯示正常頂葉皮質(zhì)：細(xì)胞胞體飽滿，分布較為緊密、排列較為緊湊；細(xì)胞核呈藍(lán)色，神經(jīng)元形態(tài)及染色均正常。實(shí)驗(yàn)組可見神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞增多，未見梗死區(qū)及感染后炎性細(xì)胞富集區(qū)。對(duì)照組鏡下與實(shí)驗(yàn)組差別不大，未見梗死區(qū)，無纖維素滲出和炎癥細(xì)胞富集等感染灶。見圖1。

圖1 HE染色結(jié)果(200×)

2.3 nestin免疫組化染色

nestin免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為稍淡染的棕黃色點(diǎn)狀或顆粒狀沉積，主要在胞質(zhì)內(nèi)，部分呈聚集分布[10-11]。

對(duì)照組和空白組皮質(zhì)區(qū)nestin少量表達(dá)，且無顯著性差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)nestin陽性細(xì)胞均顯著高于對(duì)照組(P＜0.001)。見表1。

形態(tài)學(xué)觀察，3 d時(shí)皮質(zhì)注射部位未見明顯nestin陽性細(xì)胞；5 d時(shí)皮質(zhì)注射部位可見明顯nestin陽性細(xì)胞，并且呈規(guī)律分布；7 d時(shí)，皮質(zhì)注射部位可見大量呈規(guī)律分布的nestin染色陽性細(xì)胞；14 d時(shí)，皮質(zhì)注射部位可觀察到鏈狀分布的nestin陽性細(xì)胞；21 d時(shí)，皮質(zhì)注射部位可觀察到大量規(guī)律分布的nestin陽性細(xì)胞。見圖2～圖7。

空白組和對(duì)照組海馬區(qū)nestin少量表達(dá)，且無顯著性差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)nestin陽性細(xì)胞均顯著高于對(duì)照組(P＜0.001)。見表2、圖7～圖12。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)區(qū)nestin表達(dá)(IOD)

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)nestin表達(dá)(IOD)

圖2 對(duì)照與實(shí)驗(yàn)3 d組皮質(zhì)區(qū)nestin表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖3 對(duì)照與實(shí)驗(yàn)5 d組皮質(zhì)區(qū)nestin表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖4 對(duì)照與實(shí)驗(yàn)7 d組皮質(zhì)區(qū)nestin表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖5 對(duì)照與實(shí)驗(yàn)14 d組皮質(zhì)區(qū)nestin表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖6 對(duì)照與實(shí)驗(yàn)21 d組皮質(zhì)區(qū)nestin表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖7 空白組nestin表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖8 對(duì)照與實(shí)驗(yàn)3 d組海馬區(qū)nestin表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖9 對(duì)照與實(shí)驗(yàn)5 d組海馬區(qū)nestin表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖10 對(duì)照與實(shí)驗(yàn)7 d組海馬區(qū)nestin表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖11 對(duì)照與實(shí)驗(yàn)14 d組海馬區(qū)nestin表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

圖12 對(duì)照與實(shí)驗(yàn)21 d組海馬區(qū)nestin表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，400×)

3 討論

迄今為止，研究者對(duì)于MCP-1[12]等趨化因子促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞遷移方面的研究已經(jīng)做出很大努力，并取得了一些重要進(jìn)展。但在活體中，人們只在腦出血[13-14]、顱腦損傷[11,15]等病理環(huán)境下有一定研究。由于活體內(nèi)損傷和缺血有著不同的微環(huán)境，所以我們不能直接將體外研究結(jié)果引入體內(nèi)。對(duì)于體內(nèi)趨化因子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的作用尚不明了。

趨化因子是指具有趨化作用的細(xì)胞因子。根據(jù)靠近分子氨基端(N端)的前兩個(gè)C之間是否插入其他種類氨基酸，將它們分為4個(gè)亞類：CC、CXC、CX3C和C[16-17]。MCP-1是趨化因子CC亞家族的成員。近年來研究顯示，趨化因子不僅在保護(hù)宿主、炎癥反應(yīng)、過敏反應(yīng)，免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化及免疫系統(tǒng)的自身穩(wěn)定等方面起作用，而且在腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移、中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育、損傷與疾病修復(fù)過程、心腦血管系統(tǒng)疾病的修復(fù)過程等方面都發(fā)揮重要作用[18-20]。Belmadani等觀察到，將小鼠MCP-1基因敲除后，神經(jīng)前體細(xì)胞向損傷處的遷移顯著減少[21]，說明MCP-1可誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞向MCP-1富集部位遷移。近年來也有研究表明其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的趨化也有重要作用。

nestin是胚胎期神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物[10]。McKay等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一種表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的蛋白，其在神經(jīng)胚形成時(shí)開始表達(dá)，并隨神經(jīng)細(xì)胞分化的完成而停止表達(dá)[22]。他們將這種蛋白命名為神經(jīng)元中間絲蛋白(intermediate neurofilament protein)[23]，即nestin。目前很多學(xué)者將nestin作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物[22]。

本研究通過注射MCP-1，建立SD大鼠模型。該方法比Magge等放置引流管的方法[24]降低感染和異物引起的局部炎癥反應(yīng)，從而降低了炎癥細(xì)胞分泌MCP-1對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。同時(shí)由于針孔所致的傷口和骨窗微小，故定位準(zhǔn)確。我們采用立體定向儀定位，可重復(fù)性較高。

本研究顯示，隨著時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)的nestin陽性細(xì)胞逐漸增多。海馬區(qū)為腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的富集部位，MCP-1對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞有激活效應(yīng)；而皮質(zhì)區(qū)nestin陽性細(xì)胞的富集提示MCP-1對(duì)內(nèi)源性nestin陽性細(xì)胞的趨化效應(yīng)。與Belmadani等[21]結(jié)果相似。

因此，外源性MCP-1既可激活神經(jīng)干細(xì)胞，也可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向目標(biāo)部位富集，為應(yīng)用趨化因子誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)腦損傷，改善顱腦損傷患者的康復(fù)過程，提供了基礎(chǔ)。

但神經(jīng)干細(xì)胞受趨化因子誘導(dǎo)后的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程還不清楚。我們將進(jìn)一步研究MCP-1對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的影響。

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Effect of Exogenous Monocyte Chemoattractant Protein-1 on Neural Stem Cells in Brain of Rats

ZHANG Hao,DING Peng,WANG Jin-kun,et al.Department of Neurosurgery,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,Yunnan,China

ObjectiveTo apply the exogenous monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)to induce the neural stem cells in vivo.Methods64 adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into blank(n=4),control(n=30)and experimental(n=30)groups.The experimental group was injected with MCP-1 into the cerebra,and the control group with PBS,and the blank group with no intervention. The number of nestin positive cells in brain was observed with immunohistochemistry 3,5,7,14,21 days after injection.ResultsThe number of nestin positive cells increased with time in the cortex and hippocampus in the experimental group(P＜0.001).There was no significant difference between the control group and the blank group(P＞0.05).ConclusionExogenous MCP-1 may induce the increase of neural stem cells in vivo.

monocyte chemoattractant protein-1;neural stem cells;chemotactic factor;nestin

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.05.011

R338.1

A

1006-9771(2014)05-0434-08

2013-08-27

2013-11-05)

云南省衛(wèi)生科技內(nèi)設(shè)研究機(jī)構(gòu)項(xiàng)目(No.2011ws0050)。

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，云南昆明市650032。作者簡介：張浩(1987-)，男，漢族，山西晉城市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)應(yīng)用及腦血管病的治療。通訊作者：王崇謙(1963-)，男，漢族，云南昆明市人，副主任醫(yī)師，主要研究方向：神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)應(yīng)用及顱腦損傷。