孫敏，張皚峰，楊朝陽(yáng)，李曉光

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3殼聚糖支架誘導(dǎo)成年大鼠腦損傷后海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成①

孫敏1，張皚峰2，楊朝陽(yáng)1，李曉光1

目的觀察神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT-3)殼聚糖支架誘導(dǎo)神經(jīng)突觸形成，修復(fù)成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷。方法60只成年雄性Wistar大鼠平均分為單純損傷組、單純殼聚糖支架組和NT-3殼聚糖支架組，分別于術(shù)后3 d、7 d、14 d、28 d和60 d，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)損傷區(qū)神經(jīng)再生。術(shù)后30 d和60 d應(yīng)用神經(jīng)示蹤方法與免疫電鏡技術(shù)觀察損傷區(qū)內(nèi)再生的神經(jīng)突觸。結(jié)果NT-3殼聚糖支架組海馬損傷區(qū)內(nèi)nestin+、微管蛋白β-tubulin-Ⅲ+、微管相關(guān)蛋白2(MAP2)+神經(jīng)細(xì)胞較單純殼聚糖支架組和單純損傷組明顯增加(P＜0.01)。NT-3殼聚糖支架組在海馬損傷區(qū)內(nèi)觀察到5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)+/MAP2+雙陽(yáng)性新生神經(jīng)元，并形成突觸聯(lián)系。結(jié)論NT-3殼聚糖支架可激活腦損傷區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，分化為成熟神經(jīng)元并形成神經(jīng)突觸，參與腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建。

創(chuàng)傷性腦損傷；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3殼聚糖支架；神經(jīng)前體細(xì)胞；增殖；分化；突觸；神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

[本文著錄格式] 孫敏，張皚峰，楊朝陽(yáng)，等.神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3殼聚糖支架誘導(dǎo)成年大鼠腦損傷后海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20(5):428-433.

創(chuàng)傷性腦損傷是由于交通事故、生產(chǎn)事故及意外導(dǎo)致的常見(jiàn)外源性腦疾病[1]。創(chuàng)傷性腦損傷后導(dǎo)致神經(jīng)元死亡或丟失，造成多種神經(jīng)功能缺陷，其中海馬損傷導(dǎo)致認(rèn)知功能缺陷，嚴(yán)重影響患者的空間學(xué)習(xí)與記憶功能。研究表明，在成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)特殊區(qū)域(腦室下區(qū)和海馬齒狀回)存在持續(xù)的神經(jīng)發(fā)生，可產(chǎn)生新的神經(jīng)元[2]。神經(jīng)環(huán)路重建是指新生神經(jīng)元之間能夠建立突觸聯(lián)系，整合入宿主組織，形成有功能的神經(jīng)回路[3]。成體神經(jīng)發(fā)生包括從分裂開(kāi)始，到成熟、整合、有功能的新神經(jīng)元出現(xiàn)及存活的全部神經(jīng)元發(fā)育過(guò)程[4]。成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞多數(shù)處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)腦損傷使細(xì)胞微環(huán)境發(fā)生變化，靜止的神經(jīng)前體細(xì)胞可以被激活、增殖，但大多數(shù)分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞參與瘢痕的形成，幾乎不能或極少能分化為神經(jīng)元[5]。本課題組前期研究表明，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(neurotrophin-3,NT-3)殼聚糖支架具有良好的組織相容性，有利于新生組織的形成及減少炎癥等不良反應(yīng)[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察應(yīng)用NT-3殼聚糖支架移植修復(fù)腦損傷后，損傷區(qū)內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞能否增殖分化為成熟神經(jīng)元，新生的神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系并整合入宿主組織重建神經(jīng)環(huán)路。

1 材料和方法

1.1 材料

60只成年雌性Wistar大鼠，體重200 g，SPF級(jí)，首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 大鼠6%水合氯醛6 ml/kg腹腔注射麻醉。腹面向下固定于大鼠立體定位儀上；頭部正中矢狀切口，切開(kāi)皮膚及皮下組織，鈍性分離，暴露顱骨。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定損傷區(qū)域?yàn)榍柏逗?-)3.7～3.9 mm，正中線左旁開(kāi)(L)1～3 mm，硬腦膜下(V)3 mm，門(mén)齒棒低于耳間線(-)3.3 mm。手術(shù)顯微鏡下，牙科鉆掀去骨瓣，注意不要損傷硬腦膜[6]；打開(kāi)硬腦膜，采用本實(shí)驗(yàn)室自制的“生物組織吸除裝置”[7]機(jī)械性損傷并吸除體積約為2×2×3 mm腦組織，包括海馬CA1區(qū)及覆蓋其上的大腦皮質(zhì)。

單純損傷組(n=20)不施加任何干預(yù)措施；單純殼聚糖支架組(n=20)在損傷區(qū)移植不載有NT-3的殼聚糖支架；NT-3殼聚糖支架組(n=20)損傷區(qū)內(nèi)移植載有NT-3的殼聚糖支架。支架大小與吸除腦組織相仿?？p合皮膚切口，碘酒消毒傷口。置溫暖環(huán)境待其蘇醒后送返飼養(yǎng)室，予糖鹽水和食物。術(shù)后腹腔注射青霉素105U/d，共7 d。

1.2.2 5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)標(biāo)記 術(shù)后第2天予BrdU (SIGMA公司)5 mg/100 g腹腔注射，每12小時(shí)注射1次，共7 d。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 分別于術(shù)后3 d、7 d、14 d、28 d、60 d每組各任取3只大鼠，4%多聚甲醛心臟灌注固定后取腦，置于4℃4%多聚甲醛溶液6 h，取出放于30%PB蔗糖溶液脫水2周，冰凍切片機(jī)大腦冠狀面連續(xù)冰凍切片，切片厚14 μm。

1.2.3.1 神經(jīng)絲蛋白(NF) 1∶50鼠抗NF(中杉金橋) 4℃孵育60 h，加入1∶300生物素化山羊抗鼠IgG二抗，室溫12 h，加入1∶300辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素三抗，室溫過(guò)夜。3,3-二氨基苯聯(lián)胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染核，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3.2 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)1∶80兔抗GFAP (中杉金橋)4℃孵育60 h，加入1∶300生物素化山羊抗兔IgG二抗，室溫12 h，加入1∶300辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素三抗，室溫過(guò)夜。DAB顯色，蘇木素復(fù)染核，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3.3 巢蛋白(nestin) 1∶100鼠抗nestin(SIGMA公司)4℃孵育60 h，加入1∶300生物素化山羊抗鼠IgG二抗，室溫12 h，加入1∶300辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素三抗，室溫過(guò)夜。DAB顯色，蘇木素復(fù)染核，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3.4 微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ) 1∶50兔抗β-tubulin-Ⅲ(MILLIPORE公司)4℃孵育60 h，加入1∶300生物素化山羊抗兔IgG二抗，室溫12 h，加入1∶300辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素三抗，室溫過(guò)夜。DAB顯色，蘇木素復(fù)染核，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3.5 微管相關(guān)蛋白2(MAP2) 1∶80兔抗MAP2 (MILLIPORE公司)4℃孵育60 h，加入1∶300生物素化山羊抗兔IgG二抗，室溫12 h，加入1∶300辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素三抗，室溫過(guò)夜。DAB顯色，蘇木素復(fù)染核，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 生物素化葡聚糖胺(BDA)神經(jīng)示蹤 術(shù)后60 d，腦損傷區(qū)對(duì)側(cè)(右側(cè))CA3區(qū)注射BDA(中杉金橋)。注射點(diǎn)(2點(diǎn))位于前囟后(-)3.3 mm、正中線右旁開(kāi)(R)3 mm、硬腦膜下(V)3.9 mm，以及前囟后(-)3.6 mm、正中線右旁開(kāi)(R)3 mm、硬腦膜下(V)3.7 mm。每只動(dòng)物每點(diǎn)以0.1 μl/min的速度，注射0.4 μl。注射后24 h灌殺取腦，冰凍切片機(jī)大腦冠狀面連續(xù)冰凍切片，切片厚20 μm。

1.2.4.1 MAP2免疫熒光染色 1∶80兔抗MAP2一抗4℃孵育60 h，加入1∶100 Texas-red標(biāo)記的山羊抗兔IgG熒光二抗，室溫避光10 h，加入1∶2000 Hoechst 33342，室溫孵育5 min。50%甘油PB封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4.2 GFAP免疫熒光染色 1∶80兔抗GFAP一抗4℃孵育60 h，加入1∶100 Texas-red標(biāo)記的山羊抗兔IgG熒光二抗，室溫避光10 h，加入1∶2000 Hoechst 33342，室溫孵育5 min。50%甘油PB封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 免疫電鏡取材與染色 術(shù)后30 d和60 d，各組任取大鼠3只，0.075%戊二醛+4%多聚甲醛冰上灌流取材，置0.075%戊二醛+4%多聚甲醛3 h，振動(dòng)切片，厚40 μm。切片漂洗后入3%H2O2孵育10 min，漂洗，2 mol/L鹽酸室溫孵育30 min，四硼酸鈉孵育10min；漂洗，1%羊血清室溫封閉1 h，加入1∶100小鼠抗BrdU(中杉金橋)、1∶200兔抗大鼠MAP2，室溫孵育過(guò)夜，漂洗，加入1∶50納米金顆粒二抗(NANOPROBES公司)，室溫孵育2 h，銀增強(qiáng)試劑盒(NANOPROBES公司)室溫孵育10 min，ABC試劑盒(中杉金橋)孵育過(guò)夜。DAB呈色，鋨酸固定、脫水、樹(shù)脂包埋，高溫聚合，電鏡超薄切片，置鎳網(wǎng)上用Philips CM120電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)動(dòng)物從前囟中心-3.7 mm到-3.9 mm行20張冠狀腦切片。計(jì)數(shù)高倍視野下海馬區(qū)各種標(biāo)記物陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，共4個(gè)視野。計(jì)量數(shù)據(jù)均采用(±s)表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色

術(shù)后60 d，NT-3殼聚糖支架組損傷區(qū)內(nèi)觀察到大量NF+細(xì)胞及神經(jīng)纖維(圖1a)；單純殼聚糖支架組可見(jiàn)少量NF+細(xì)胞呈網(wǎng)格狀分布(圖1b)，單純損傷組損傷區(qū)內(nèi)未見(jiàn)NF+細(xì)胞(圖1c)，僅損傷邊緣可見(jiàn)少量NF+細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，NT-3殼聚糖支架組(167.17±9.989)，單純殼聚糖支架組(83.00±10.018)，單純損傷組(15.92±3.343)，有非常高度顯著性差異(F= 978.416,P=0.000)。

損傷區(qū)與正常組織交界處GFAP+細(xì)胞數(shù)，NT-3殼聚糖支架組(19±6.937)，顯著少于單純損傷組(70± 15.912)(F=73.136,P=0.000,圖2a、圖2b)。

術(shù)后3 d，各組損傷邊緣均可見(jiàn)nestin+細(xì)胞。損傷后7 d，NT-3殼聚糖支架組損傷區(qū)內(nèi)有大量nestin+細(xì)胞，損傷區(qū)內(nèi)殘留一些未降解的載體(圖3)。術(shù)后7 d，NT-3殼聚糖支架組nestin+細(xì)胞數(shù)(83.83±6.686)，單純殼聚糖支架組(34.5±4.908)，單純損傷組(7.92± 1.832)，有非常高度顯著性差異(F=740.502,P=0.000)。

術(shù)后14 d，NT-3殼聚糖支架組損傷區(qū)出現(xiàn)大量β-tubulin-Ⅲ+細(xì)胞(圖4)。術(shù)后28 d，NT-3殼聚糖支架組β-tubulin-Ⅲ+細(xì)胞數(shù)從(47.08±3.232)減少到(26.75± 3.817)(F=198.333,P=0.000)；單純殼聚糖支架組從(26.83±3.243)減少到(14.45±2.207)(F=112.34,P= 0.000)；單純損傷組從(10.08±2.906)減少到(7.92± 2.065)(F=4.431,P=0.47)。

術(shù)后28 d，NT-3殼聚糖支架組觀察到損傷區(qū)內(nèi)出現(xiàn)大量MAP2+細(xì)胞(圖5)，這種增殖趨勢(shì)持續(xù)到術(shù)后60 d。MAP2+細(xì)胞數(shù)從(89.58±4.033)增加到(152.42± 7.141)(F=704.401,P=0.000)。

2.2 免疫電鏡

術(shù)后30 d，NT-3殼聚糖支架組損傷區(qū)觀察到BrdU+/MAP2+神經(jīng)元(圖6a)；術(shù)后60 d，損傷區(qū)內(nèi)可見(jiàn)新生神經(jīng)元形成的多突觸聯(lián)系(圖6b)。單純損傷組損傷區(qū)未觀察到神經(jīng)元。

2.3 BDA神經(jīng)示蹤

術(shù)后60 d，NT-3殼聚糖支架組熒光顯微鏡下觀察到損傷對(duì)側(cè)BDA+細(xì)胞通過(guò)海馬CA3錐體細(xì)胞的軸突，沿著海馬聯(lián)合，穿過(guò)GFAP+膠質(zhì)瘢痕(圖7a)進(jìn)入損傷側(cè)海馬CA1區(qū)，在損傷區(qū)內(nèi)觀察到BDA+神經(jīng)細(xì)胞(圖7b)，部分BDA+細(xì)胞同時(shí)表達(dá)MAP2(圖7c)。

圖1 術(shù)后60 d各組NF+細(xì)胞(免疫組織化學(xué)染色)

圖2 術(shù)后60d NT-3殼聚糖支架組和單純損傷組GFAP+細(xì)胞(免疫組織化學(xué)染色)

圖3 NT-3殼聚糖支架組nestin+細(xì)胞(術(shù)后7 d,免疫組織化學(xué)染色)

圖4 NT-3殼聚糖支架組β-tubulin-Ⅲ+細(xì)胞(術(shù)后14 d,免疫組織化學(xué)染色)

圖5 NT-3殼聚糖支架組MAP2+細(xì)胞(術(shù)后28 d,免疫組織化學(xué)染色)

圖6 NT-3殼聚糖支架組BrdU+/MAP2+神經(jīng)元(免疫電鏡)

圖7 NT-3殼聚糖支架組BDA示蹤(免疫熒光染色)

3 討論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)不存在神經(jīng)發(fā)生，中樞神經(jīng)一旦死亡，不能夠再生，神經(jīng)細(xì)胞丟失是永久性的，只能由膠質(zhì)細(xì)胞替代[8]。因此，中樞神經(jīng)損傷后的治療與恢復(fù)非常困難。近年的研究表明，成體腦能夠不斷產(chǎn)生新生神經(jīng)元，可以在解剖上整合到宿主腦內(nèi)，定位于腦的病變部位，表達(dá)適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)遞質(zhì)和受體，并形成精確的軸突投射[9]。腦損傷后2周可在CA3區(qū)觀察到新生神經(jīng)元產(chǎn)生的軸突及樹(shù)突，4周能形成成熟突觸結(jié)構(gòu)，參與神經(jīng)通路重建修復(fù)[9]。這些新生神經(jīng)元可通過(guò)整合到神經(jīng)系統(tǒng)的微回路內(nèi)，替代丟失的神經(jīng)元，從而發(fā)揮功能。前期研究表明，移植NT-3殼聚糖材料組可以明顯改善創(chuàng)傷性腦損傷所致認(rèn)知功能缺陷[6]。

3.1 NT-3殼聚糖支架促進(jìn)神經(jīng)再生

NT-3主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，在海馬、小腦、大腦皮質(zhì)、三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元和結(jié)狀神經(jīng)節(jié)等神經(jīng)元中表達(dá)，以海馬和小腦含量較高[8]。將載有NT-3的成纖維細(xì)胞移植到脊髓損傷處，損傷后第10周所有移植物中都有軸突生長(zhǎng)，表明NT-3可促進(jìn)移植物中軸突髓鞘形成[10]。

殼聚糖是一種修復(fù)周圍神經(jīng)的導(dǎo)管材料，體外研究發(fā)現(xiàn)，在殼聚糖纖維膜上培養(yǎng)與培養(yǎng)基培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，生存分化能力無(wú)明顯差別，說(shuō)明殼聚糖生物材料不影響神經(jīng)元的增殖分化，具有良好的組織相容性、安全性、微生物降解性[11]。本研究結(jié)果提示，損傷本身促進(jìn)損傷區(qū)域內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化能力有限，單純殼聚糖支架與NT-3殼聚糖支架均能促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化為成熟神經(jīng)元，但NT-3殼聚糖支架組神經(jīng)再生較單純殼聚糖支架組明顯提高?？赡芘cNT-3促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的分化、誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)有關(guān)[12]。將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NT-3與殼聚糖結(jié)合，使NT-3緩慢釋放，可以長(zhǎng)期(14周)發(fā)揮[13]神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NT-3激活內(nèi)源性神經(jīng)干/祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化為神經(jīng)元的作用。而單純殼聚糖支架僅能作為細(xì)胞遷移和突起生長(zhǎng)的支架。這與以前的研究一致[14]。

3.2 再生神經(jīng)元形成突觸參與宿主腦神經(jīng)環(huán)路的重建

神經(jīng)元之間突觸聯(lián)系的建立，是神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)形成的基礎(chǔ)。海馬的突觸回路中，CA3錐體細(xì)胞軸突的Schaffer側(cè)支投射到同側(cè)CA1腔隙層，終止于錐體細(xì)胞頂樹(shù)突干；通過(guò)海馬聯(lián)合，CA3錐體細(xì)胞的軸突投射到對(duì)側(cè)海馬的CA1錐體細(xì)胞的基樹(shù)突[8]。

免疫電鏡技術(shù)是免疫組織化學(xué)與電鏡技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，可以在超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原、抗體結(jié)合定位。利用帶有特殊標(biāo)記的抗體與相應(yīng)抗原相結(jié)合，在電子顯微鏡下觀察，由于標(biāo)準(zhǔn)物形成一定的電子密度而指示出相應(yīng)抗原所在的部位。研究表明，電鏡下成熟突觸結(jié)構(gòu)包含以下3個(gè)條件：①存在明確的突觸后致密物；②100 nm的突觸前膜上至少存在4個(gè)突觸囊泡；③存在清晰的突觸間隙[15]。本研究借助納米金顆粒標(biāo)記成熟樹(shù)突MAP2[16]，利用ABC試劑盒及DAB呈色BrdU[9]雙標(biāo)定位。BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞[1]與成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物MAP2雙標(biāo)說(shuō)明損傷區(qū)內(nèi)觀察到的神經(jīng)元是新生的成熟神經(jīng)元。移植NT-3殼聚糖支架術(shù)后30 d，損傷區(qū)內(nèi)觀察到BrdU+/MAP2+的新生神經(jīng)元；術(shù)后60 d，損傷區(qū)內(nèi)可見(jiàn)新生神經(jīng)元的同一樹(shù)突與不同突觸前成分形成多突觸聯(lián)系。單純損傷組損傷區(qū)內(nèi)無(wú)法觀察到神經(jīng)元。表明移植NT-3殼聚糖支架后，損傷區(qū)內(nèi)有大量新生神經(jīng)元，新生神經(jīng)元形成成熟的突觸聯(lián)系。

BDA是將葡聚糖胺結(jié)合到異硫氰酸熒光素制成的一種大分子神經(jīng)示蹤劑，BDA陽(yáng)性細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈綠色熒光[17]。Veenman等首先將BDA用于順行性標(biāo)記神經(jīng)元的胞體，觀察不同區(qū)域神經(jīng)元之間的聯(lián)系[18]。本研究顯示，術(shù)后60 d，將神經(jīng)示蹤劑BDA注射到NT-3殼聚糖支架組損傷對(duì)側(cè)海馬CA3區(qū)，在損傷側(cè)海馬CA1區(qū)內(nèi)觀察到BDA+神經(jīng)細(xì)胞，說(shuō)明NT-3殼聚糖支架能修復(fù)破壞的神經(jīng)通路。損傷區(qū)內(nèi)部分BDA+細(xì)胞同時(shí)表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)記物MAP2，提示神經(jīng)突觸參與宿主腦神經(jīng)通路的重建。

未來(lái)有可能通過(guò)控制內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞特異性活化，并沿著所需的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞譜系分化，誘導(dǎo)患病腦和脊髓的細(xì)胞再生修復(fù)。哺乳動(dòng)物腦的正常神經(jīng)發(fā)生區(qū)域之外，不存在大量多能前體細(xì)胞，如何誘導(dǎo)分布于整個(gè)神經(jīng)軸的少量前體細(xì)胞增殖分化，修復(fù)損傷區(qū)域，是我們當(dāng)今工作的重點(diǎn)。然而，現(xiàn)在僅僅開(kāi)始了解神經(jīng)前體細(xì)胞在它們所處的局部微環(huán)境中的潛能和信號(hào)之間的復(fù)雜相互作用；有關(guān)內(nèi)源性干/祖細(xì)胞的來(lái)源、遷移途徑、新生神經(jīng)元的功能及神經(jīng)元分化和存活的特異性調(diào)節(jié)，仍需進(jìn)一步研究。

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Neurotrophin-3 Chitosan Scaffolds Induced Hippocampal Neural Network Formation after Traumatic Brain Injury in Adult Rats

SUN Min,ZHANG Ai-feng,YANG Zhao-yang,et al.Department of Neurobiology,Capital Medical University,Beijing 100069,China

ObjectiveTo repair the traumatic brain injury in adult rats by inducing neural synapses formation with neurotrophin-3 (NT-3)chitosan scaffolds.Methods60 adult male Wistar rats were equally divided into lesion group,blank chitosan scaffolds group and NT-3 chitosan scaffolds group.The neural regeneration in the lesion area were observed through immunochemistry 3 days,7 days,14 days, 28 days,60 days after operation.Regenerated neural synapses involved the neural circuitry reconstruction in the lesion area were observed through neural tracing and immune electron microscopy 30 days and 60 days after operation.ResultsThe nestin+,β-tubulin-Ⅲ+,microtubule associated protein 2(MAP2)+neural cells in hippocampal lesion area were significantly more in the NT-3 chitosan scaffolds group than in the other groups(P＜0.01).Newborn neurons that express 5-bromouracil deoxyriboside(BrdU)and MAP2 were observed and formed synaptic connections in hippocampal damage zone in the NT-3 chitosan scaffolds group.Regenerated neural synapses involved the neural circuitry reconstruction in the lesion area.ConclusionNT-3 chitosan scaffolds activate the neural progenitor cells to proliferate and differentiate to mature neurons,which form neural synapses to involve the neural circuitry reconstruction.

traumatic brain injury;neurotrophin-3 chitosan scaffolds;neural progenitor cells;proliferation;differentiation;synapses; neural network

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.05.010

R742

A

1006-9771(2014)05-0428-06

2014-03-02

2014-04-11)

1.“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012BAI17B04)；2.國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012AA020506)；3.北京市科委重點(diǎn)項(xiàng)目(No. D09080104660000)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系，北京市100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院口腔科，北京市100050。作者簡(jiǎn)介：孫敏(1983-)，女，內(nèi)蒙古包頭市人，碩士研究生，主要研究方向：應(yīng)用組織工程學(xué)方法修復(fù)腦損傷的研究。通訊作者：李曉光(1959-)，男，漢族，吉林長(zhǎng)春市人，博士，教授，主要研究方向：應(yīng)用組織工程學(xué)方法修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究。