謝貞建，顏軍，魏俊，薛劍，王衛(wèi)，*

（1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都610106；2.肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610106）

蘆薈（Aloe）屬多年生百合科多肉質(zhì)草本植物，可藥食兩用[1]。新鮮蘆薈不易儲藏，暴露在空氣中的蘆薈凝膠易被氧化而失去功效[2]。蘆薈的主要活性成分蘆薈甙（Aloin）為多羥基蒽醌類衍生物，具有抗炎、抗輻射等功效，兼有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖等[3-4]，其對心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、胃損傷、肝臟等也都具有良好的保護(hù)作用，能有效地促進(jìn)傷口愈合[5]，在食品[6]、醫(yī)藥[7]、化妝品[8]等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和開發(fā)價值。

目前，常用的中草藥活性成分的提取方法大多采用常溫浸泡、索氏抽提、加熱回流等，但這些方法提取時間長、耗費(fèi)試劑量大，在實(shí)際應(yīng)用中存在很大的局限性。超聲波輔助提取利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和其他次級效應(yīng)能在不改變有效成分結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，縮短提取時間，提高提取率，在中草藥活性成分的提取上得到廣泛的應(yīng)用[9-11]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用超聲波輔助提取蘆薈干粉中蘆薈甙，并選用中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法分析試驗(yàn)結(jié)果，建立蘆薈甙提取的數(shù)學(xué)模型，找出最佳試驗(yàn)條件，在此試驗(yàn)條件下預(yù)測得率，并確定自變量最佳值[12-13]。為蘆薈甙工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參數(shù)，為蘆薈資源的綜合利用及副產(chǎn)品的有益增值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：云南庫拉索蘆薈（市售）；蘆薈甙標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%，中國生物制品檢定所）；甲醇（HPLC級）；甲醇（AR）；無水乙醇（AR）；冰醋酸（AR）。

儀器：島津LC-20AB型HPLC：島津；T15RT型臺式高速離心機(jī)：上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；KQ3200型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；BSA124S型電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理

稱取蘆薈干粉1 g（精確到0.000 1 g），按相應(yīng)料液比加入乙醇溶液，混勻，超聲30 min后冷卻定容，10 000 r/min離心20 min，取上清液以0.45 μm濾膜過濾，待用。

1.2.2 蘆薈甙含量測定

色譜條件：色譜柱 Inertsil ODS C18（5 μm，4.6×150 mm）；流速：1 mL/min；流動相：甲醇-0.1%醋酸水=40：60；柱溫：40 ℃；波長：359 nm；進(jìn)樣量 10 μL。

以峰面積（Y）與蘆薈甙含量（X）外標(biāo)法定量，回歸方程Y=12 742.69X-3013.684，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。

1.2.3 提取時間的影響

準(zhǔn)確稱取過80目篩的蘆薈干粉1.000 0 g，用75%乙醇溶液15 mL溶解于25 mL容量瓶中，在30°C下，分別提取 10、20、30、40 min，按樣品處理方法處理，用“1.2.2蘆薈甙含量測定”方法測定。

1.2.4 提取溫度的影響

準(zhǔn)確稱取過80目篩的蘆薈干粉1.000 0 g，用75%乙醇溶液15 mL溶解于25 mL容量瓶中，分別在30、40、50、60、70 ℃下超聲提取 30 min，按樣品處理方法處理，用“1.2.2蘆薈甙含量測定”方法測定。

1.2.5 乙醇濃度的影響

準(zhǔn)確稱取過80目篩的蘆薈干粉1.000 0 g，分別用20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液15 mL溶解于25 mL容量瓶中，在40℃下超聲提取30 min。按樣品處理方法處理，用“1.2.2蘆薈甙含量測定”方法測定。

1.2.6 液料比的影響

準(zhǔn)確稱取過80目篩的蘆薈干粉1.000 0 g，分別用80%的乙醇溶液 10、15、20、25、30、40 mL 溶解于50 mL容量瓶中，在40℃下超聲提取30 min。按樣品處理方法處理，用“1.2.2蘆薈甙含量測定”方法測定。

1.2.7 Central Composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、液料比和提取溫度為研究對象，并以蘆薈甙含量作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)Central Composite試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平及編碼見表1。試驗(yàn)輔助軟件為Design Expert（version 8.0 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN.USA）。

表1 Central Composite設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factor level and coding of Central Composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取時間對蘆薈甙含量提取的影響

按1.2.3方法考察提取時間的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在提取時間低于30 min時，蘆薈甙含量隨著提取時間的增加而增加，而大于30 min，蘆薈甙含量趨于平衡，無明顯變化，說明在此條件下，超聲30min蘆薈甙提取液已達(dá)到飽和，不會隨時間的增加而增大，在后續(xù)試驗(yàn)中，選擇提取30 min。

2.1.2 提取溫度對蘆薈甙含量提取的影響

按1.2.4方法考察提取溫度的影響，結(jié)果見圖2。

圖1 提取時間對蘆薈甙含量的影響Fig.1 Effect of extracted time on the yield of aloin

圖2 提取溫度對蘆薈甙含量的影響Fig.2 Effect of extracted temperature on the yield of aloin

由圖2可知，溫度達(dá)到40℃時，蘆薈甙含量有一個較大值。而隨著溫度的升高，達(dá)到60℃以上，蘆薈甙含量迅速下降，原因可能是溫度過高使得乙醇揮發(fā)。溫度在40℃～60℃范圍，都比較適合蘆薈甙的提取。

2.1.3 乙醇濃度對蘆薈甙含量提取的影響

按1.2.5方法考察乙醇濃度對蘆薈甙含量提取的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 乙醇濃度對蘆薈甙含量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of aloin

由圖3可知，乙醇的最佳提取濃度在80%左右，乙醇濃度太低，則溶劑的極性較小，不利于蘆薈甙的溶出；而乙醇濃度太高，則溶劑中水分含量較少，不利于植物纖維的溶脹，反而降低了乙醇與蘆薈的反應(yīng)，從而使得蘆薈甙含量降低。

2.1.4 液料比對蘆薈甙含量提取的影響

按1.2.5方法考察液料比對蘆薈甙含量提取的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 液料比對蘆薈甙含量的影響Fig.4 Effect of ethanol volume on the yield of aloin

由圖4可知最佳液料比為15∶1（mL/g）。當(dāng)液料比小于 15∶1（mL/g），蘆薈干粉浸潤不完全，蘆薈甙提取不完全；當(dāng)大于 15∶1（mL/g）時，蘆薈甙含量變化不明顯，還有略微下降的趨勢，基于經(jīng)濟(jì)的考慮，同時較高的液料比會增加濃縮的工作量，所以選取15∶1（mL/g）。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取乙醇濃度、液料比和提取溫度3個因素做中心組合設(shè)計(jì)，以蘆薈甙含量為響應(yīng)值，共20個試驗(yàn)點(diǎn)，其中14個為析因點(diǎn)，6個為中心點(diǎn)。設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 中心組合設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Program and results of Central Composite design

利用design－expert軟件對上述結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到蘆薈甙含量Y對乙醇濃度（A）、液料比（B）和提取溫度（C）的二次多項(xiàng)回歸方程分別為：Y=2.99－0.14A+0.048B+0.028C+0.036AB－0.019AC+0.046BC-0.17A2+5.89×10－4B2+0.015C2+0.031A2B+0.21A2B2。

2.3 模型的顯著性檢驗(yàn)

對模型進(jìn)行回歸方差分析及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression model

表4 回歸模型顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test for each term of developed regression model

由表 3 可知，模型的 F=25.22，P＜0.000 1＜0.01，說明所選用的模型具有高度的顯著性。失擬項(xiàng)F=0.76，在 P＜0.05 上不顯著（P=0.563 2＞0.05）。R2越接近 1，說明此模型越能預(yù)測其響應(yīng)值[14]。模型的R2為0.971 8，表明模型擬合程度良好，預(yù)測值與實(shí)際值之間有較好的相關(guān)性。模型的校正系數(shù)RAdj2為0.933 4，表明該模型能解釋93.34%的響應(yīng)值的變化。模型響應(yīng)值的信噪比為24.489，表明有很強(qiáng)的信號。

由表4可知，模型的一次項(xiàng)A、二次項(xiàng)A2極顯著，交互項(xiàng)BC顯著，二次交互項(xiàng)A2B2極顯著，其余因素不顯著，表明各種影響因素對于蘆薈甙提取的影響不是簡單的線性關(guān)系，其中因素A（乙醇濃度）對蘆薈甙含量的提取具有很重要的作用。

圖5為蘆薈甙含量（Y）實(shí)測值相對回歸方程預(yù)測值的偏離情況對照圖。在設(shè)定的20次試驗(yàn)中，最小響應(yīng)值為2.28 mg/g，最大響應(yīng)值為3.33 mg/g。在本次試驗(yàn)中，預(yù)測值與實(shí)測值之間的最大偏差為：最大偏差/%=即最大偏差為2.05%。從這一方面說明采用響應(yīng)曲面法進(jìn)行蘆薈甙的提取的試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的回歸模型是可行的。

圖5 實(shí)測值與模型預(yù)測值對照圖Fig.5 Plot of model-predicted values against experimental values of the extraction yield of aloin

2.4 響應(yīng)面交互作用分析

通過模型方程所作的等高線圖見圖6～圖8。等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示因素交互作用不顯著，而橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著[15]。圖6顯示了其等高線呈馬鞍形，當(dāng)溫度為45℃時，液料比和乙醇濃度的交互效應(yīng)顯著。在低乙醇濃度條件下，隨著液料比的增加，其蘆薈甙含量先降低后增高；而在高乙醇濃度下，蘆薈甙的含量隨液料比增加不明顯，所以對于蘆薈甙的提取，乙醇濃度不需要太高。由圖7知，乙醇濃度與提取時間交互效應(yīng)較顯著，在較低的乙醇濃度下，需較高溫度才能得到一個高的蘆薈甙含量。由圖8知，提取溫度與液料比交互效應(yīng)顯著，在高液料比條件下，隨著溫度的增加，蘆薈甙含量都是呈一個上升的趨勢；在低液料比條件下，隨溫度的增加蘆薈甙含量由高到低。而在液料比20∶1（mL/g），溫度45℃可得到一較大值。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用軟件對回歸模型進(jìn)行分析，選取蘆薈甙含量為最大值，得最優(yōu)化條件液料比 20∶1（mL/g），提取溫度45℃，乙醇濃度70%下提取30 min進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。其預(yù)測值為蘆薈甙含量為3.33 mg/g，在優(yōu)化得到的最優(yōu)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，平行兩次結(jié)果為3.33 mg/g，3.29 mg/g，平均含量為3.31 mg/g，與預(yù)測值3.33 mg/g相差不顯著，響應(yīng)面法優(yōu)化蘆薈甙的提取工藝是切實(shí)可行的。

圖6 溫度為45℃時乙醇濃度與液料比對蘆薈甙含量影響的等高線圖Fig.6 Contour plot of the effect of concentration of ethanol and liquid-solid ratio on Alion content at temperature level of 45℃

圖7 液料比為15∶1(mL/g）時乙醇濃度與溫度對蘆薈甙含量影響的等高線圖Fig.7 Contour plot of the effect of concentration of ethanol and temperature on Alion content at liquid-solid ratio level of 15∶1（mL/g）

圖8 乙醇濃度為80%時液料比與溫度對蘆薈甙含量影響的等高線圖Fig.8 Contour plot of the effect of liquid-solid ratio and temperature on Alion content at concentration of ethanol level of 80%

3 結(jié)論

1）本實(shí)驗(yàn)得出蘆薈干粉中蘆薈甙的最佳提取條件為：液料比 20∶1（mL/g），提取溫度 45 °C，乙醇濃度 70%下提取30 min。此條件下蘆薈甙含量達(dá)到3.31 mg/g，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)證明該工藝切實(shí)可行。

2）采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)平方達(dá)到0.971 8，模型擬合程度良好，預(yù)測值與實(shí)際值之間有較好的相關(guān)性，在本次試驗(yàn)中，預(yù)測值與實(shí)測值之間的最大偏差為2.05%。

3）通過回歸模型顯著性檢驗(yàn)和依據(jù)模型方程所作的等高線可以看出，乙醇濃度的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都非常顯著，是影響蘆薈甙提取的一個重要的因素，對于蘆薈甙的提取，乙醇濃度不需要太高。液料比和提取溫度交互效應(yīng)較顯著，各種影響因素對于蘆薈甙提取的影響不是簡單的線性關(guān)系。

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