王乃福，吳冬雪，張霞，劉培，張海英，高旗利

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300456）

致瀉性大腸桿菌（DEC）是細(xì)菌性腹瀉的常見病原菌，它包括腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）和腸聚集性大腸桿菌（EAEC）。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年有10億人患腹瀉，其中5億人發(fā)生在第三世界，導(dǎo)致每年5百萬(wàn)嬰幼兒死亡，雖然不同地區(qū)的自然環(huán)境和生產(chǎn)、生活方式有所差異，引起腹瀉病的主要病原體有所不同，但致瀉性大腸桿菌是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外十分關(guān)注的引起人類臨床腹瀉和食物中毒的重要病原菌，由致瀉性大腸桿菌引起的腹瀉病例數(shù)始終位于第二位，可見大腸桿菌腸道傳染的廣泛性[1]。大腸桿菌O157是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸出血性大腸桿菌血清型，同其他血清型致瀉性大腸埃希氏菌相比，O157血清型致病性更強(qiáng)，最低致病劑量更低，患者發(fā)病后病死率較高。自1982年美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)該血清型以來(lái)，在世界上很多國(guó)家相繼發(fā)生了爆發(fā)和流行，現(xiàn)已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。目前，我國(guó)致瀉性大腸桿菌的檢測(cè)仍以血清型檢測(cè)為主，但由于此方法假陽(yáng)性率比較高，所需檢驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，已越來(lái)越不能滿足快速發(fā)展的國(guó)際貿(mào)易、食品安全突發(fā)事件的需要，必須尋求一種高通量診斷方法一次鑒定多個(gè)致瀉性大腸桿菌血清型?；蛐酒夹g(shù)是近年來(lái)興起的一種基因診斷技術(shù)，該技術(shù)具有快速、敏感、高效、平行化、自動(dòng)化等特點(diǎn)，既可以應(yīng)用許多不同的探針來(lái)檢測(cè)同一靶基因以降低假陽(yáng)性率，還可以通過(guò)集成多種病原的基因探針來(lái)對(duì)病原體進(jìn)行快速的診斷、鑒別診斷與基因分型[2]。自1995年被應(yīng)用以來(lái)，已廣泛應(yīng)用于基因圖譜繪制、基因表達(dá)分析、疾病診斷、藥物篩選、疫苗研制、環(huán)境監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域[3-5]。本試驗(yàn)運(yùn)用基因芯片技術(shù)，擬建立一種針對(duì)包括EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC 和 大 腸 埃 希 氏 菌O157血清型的診斷方法，以期進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)室診斷效率，為臨床疾病診斷、食物中毒檢測(cè)、進(jìn)出口食品檢疫、流行病學(xué)調(diào)查等工作提供有效檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及來(lái)源

腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和大腸桿菌O157來(lái)自德國(guó)大腸桿菌國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，沙門氏菌、變形桿菌、臘樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心，非致瀉型大腸桿菌為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

試劑：ExTaq DNA聚合酶：dNTPs購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，細(xì)菌培養(yǎng)基均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。

儀器：恒溫培養(yǎng)箱Binder，德國(guó)；PCR儀Biometra，德國(guó)；水浴箱Shellab，美國(guó)；雜交培養(yǎng)箱HybriLinker，美國(guó)；芯片點(diǎn)樣儀PerkinElmer，美國(guó)；共聚焦激光掃描儀GenePix 4000B，美國(guó)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)和探針的合成

根據(jù)Genbank中腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和大腸桿菌O157的序列，通過(guò)序列比對(duì)，篩選出特異DNA序列。由于Genbank上這些菌株的序列資源較為豐富，分析這些特異序列之后進(jìn)行目的基因的篩選，并根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和探針，得到了針對(duì)各種菌株特異目的基因的PCR引物9對(duì)，探針23條。同時(shí)設(shè)計(jì)負(fù)對(duì)照探針Cy3-（T）40。使用工具Primer premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)且所有引物和探針設(shè)計(jì)完成后，使用ClustalX 1.83進(jìn)行基因序列特異性比對(duì)，以確保引物和探針之間的特異性。引物和探針均由上海生物芯片有限公司合成。

1.2.2 菌株的培養(yǎng)

大腸桿菌、沙門氏菌、變形桿菌、臘樣芽孢桿菌用NA培養(yǎng)基37℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后挑取3個(gè)～4個(gè)菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱經(jīng)過(guò)37℃培養(yǎng)24 h。副溶血性弧菌用氯化鈉蔗糖平板37℃培養(yǎng)24 h，然后挑取3個(gè)～4個(gè)菌落接種到氯化鈉結(jié)晶紫增菌液，37℃增菌8 h～16 h。產(chǎn)氣莢膜梭菌挑取適量的菌種接種到SPS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24 h～48 h，挑取黑色菌落于液體硫乙醇酸鈉中增菌。金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌用TSA血平板37℃過(guò)夜培養(yǎng)，取3個(gè)～4個(gè)菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 DNA的提取

細(xì)菌DNA的提取按照QIAGEN公司細(xì)菌基因組提取試劑盒使用說(shuō)明中得操作規(guī)程進(jìn)行提取。

1.2.4 多重PCR擴(kuò)增

將腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和大腸桿菌O157的多個(gè)目的基因分為兩組進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。第一組為 Stap、Stah、wzy、ipaH、eae，第二組為 LT、stx1、stx2、aggR。反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液，2.5μL；dNTP，0.5μL；上游引物各0.2μL；下游引物各0.8μL；模板 DNA，5μL；Taq酶，0.3 μL；去離子水補(bǔ)足 25 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

1.2.5 芯片的制備

將探針加入到384孔板中相應(yīng)的位置，每孔加入10 μL探針。利用PerkiElmer公司的SpotArray微陣列點(diǎn)制系統(tǒng)基因芯片點(diǎn)樣儀將384孔板中的探針點(diǎn)到玻片上，每條探針重復(fù)點(diǎn)樣3次。點(diǎn)好的芯片在室溫下過(guò)夜干燥，然后45℃烘箱干燥2 h。干燥后的芯片放回潔凈的芯片盒中避光保存?zhèn)溆?。點(diǎn)樣陣列為7×4，每個(gè)芯片上共點(diǎn)8個(gè)陣列。芯片上探針排列見下圖1。

1.2.6 基因芯片的雜交

將雜交液置65℃烘箱中預(yù)熱15 min，混勻10 μL預(yù)熱的雜交液、6 μL去離子水、第一組和第二組PCR混合液產(chǎn)物各2 μL混勻后98℃變性5 min，立即置于冰上5 min；取雜交倉(cāng)，在底部凹槽內(nèi)均勻的加入200 μL去離子水，將變性后的雜交混合液全部垂直加入蓋片加樣孔中，組裝好雜交倉(cāng)，放入60℃水浴鍋中，雜交2 h。將雜交好的基因芯片取出，依次在洗液Ⅰ中輕柔提洗3 min，洗液Ⅱ中輕柔提洗3 min，95%乙醇中輕柔提洗90 s，使用吹風(fēng)機(jī)快速吹干。

圖1 芯片點(diǎn)陣示意圖Fig.1 Schematic diagram of probe square of the chip

1.2.7 基因芯片的結(jié)果判定

芯片用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀掃描，使用532 nm單色熒光、100%Power Gain、10μm分辨率，根據(jù)信號(hào)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度調(diào)節(jié)光電倍增管（PMT）值至650，利用GenePixPro軟件得到每個(gè)探針位點(diǎn)的熒光信號(hào)強(qiáng)度值，用cutoff值（SNR=3.5）去除信號(hào)低的探針，只有高于cutoff值的探針信號(hào)被視為有效信號(hào)。

1.2.8 基因芯片的特異性檢測(cè)

用制備的基因芯片和上述雜交方法，對(duì)本研究檢測(cè)的多種致瀉性大腸桿菌和沙門氏菌、變形桿菌、臘樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、非致瀉型大腸桿菌等近緣菌株進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增和芯片雜交檢測(cè)，驗(yàn)證制備基因芯片的特異性。

1.2.9 基因芯片的靈敏度檢測(cè)

采用“添加檢出”的方式，將腸致病性大腸桿菌（EPEC）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）、腸聚集性大腸桿菌（EAEC）和大腸桿菌O157純菌培養(yǎng)液10倍梯度稀釋（100cfu/mL～108cfu/mL），分別各取 10 mL 純菌培養(yǎng)液提取基因組，用于進(jìn)行多重PCR試驗(yàn)和芯片雜交檢測(cè)。本研究選取大腸桿菌O157（882364株）wzy基因進(jìn)行純菌的靈敏度試驗(yàn)。

1.2.10 基因芯片檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用

采用建立的基因芯片檢測(cè)方法，對(duì)從市場(chǎng)、超市等購(gòu)買48份食品樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 多種致瀉性大腸桿菌PCR擴(kuò)增

對(duì) EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC 及大腸桿菌O157進(jìn)行擴(kuò)增，均得到預(yù)期目的片段，表明針對(duì)各病原引物特異性良好。

2.2 雜交特異性試驗(yàn)

在多重PCR試驗(yàn)成功的基礎(chǔ)上，使用所設(shè)計(jì)的每一條探針，對(duì)相應(yīng)的菌株DNA進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA檢測(cè)結(jié)果見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)菌株芯片雜交結(jié)果Fig.2 Hhybridizated results of standard strains

從圖2中可以看出，所設(shè)計(jì)的探針對(duì)相應(yīng)的菌株檢測(cè)均可以得到正確的檢測(cè)結(jié)果。另外使用沙門氏菌、變形桿菌、臘樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、非致瀉型大腸桿菌等8株近緣菌株進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增和芯片雜交檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖3。

圖3 8株近緣菌株雜交結(jié)果Fig.3 Hybridizated results of eight closely related bacterial strains

從圖3中可以看出，8株近緣菌芯片中均未出現(xiàn)所研究的 EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC 及大腸桿菌O157的目的基因的檢測(cè)信號(hào)。

2.3 芯片靈敏度試驗(yàn)

選取大腸桿菌O157（882364株）wzy基因進(jìn)行純菌的靈敏度試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果見圖4。

圖4 大腸桿菌O157靈敏度試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity test of Escherichia coli O157

由圖4可知，芯片對(duì)大腸桿菌O157的檢測(cè)靈敏度為104cfu/mL。本方法2次檢測(cè)結(jié)果相同，表明該方法具有良好的可重復(fù)性。其它致瀉性大腸桿菌的檢測(cè)靈敏度結(jié)果見表1。

表1 各致瀉性大腸桿菌純菌靈敏度Table 1 The sensitivity of the diarrheagenic Escherichia coli bacteria respectively

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從市場(chǎng)、超市等購(gòu)買如下食品（見表2），并分別編號(hào)，采用我們建立的致瀉性大腸桿菌的檢測(cè)方法，進(jìn)行檢測(cè)。

表2 檢測(cè)的實(shí)際樣品Table 2 The samples detected

檢測(cè)結(jié)果顯示：第11號(hào)生豬肉樣品檢出毒力基因eae，第16號(hào)生豬肉樣品檢出毒力基因lt。全部實(shí)際樣品經(jīng)國(guó)標(biāo)的血清學(xué)檢測(cè)方法確認(rèn)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果完全一致。單純48例實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果而言，該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確性為100%，假陽(yáng)性和假陰性率均為0%。

3 討論

多重PCR是在同一PCR體系中同時(shí)加入多種病原微生物的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。多重PCR與單重PCR相比，大大提高了效率，在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)可同時(shí)檢出多種病原微生物，節(jié)省了時(shí)間，減少了費(fèi)用?；蛐酒夹g(shù)具有快速、準(zhǔn)確、高通量、自動(dòng)化等特點(diǎn)。運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)致病菌的同類研究已有報(bào)道。多重PCR與基因芯片技術(shù)的整合可以實(shí)現(xiàn)兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，通過(guò)PCR的基因放大作用和芯片的熒光探針雜交技術(shù)使此種檢測(cè)體系達(dá)到較高的靈敏度和特異度[6-7]。本研究綜合了多重PCR和基因芯片技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，采用多重PCR和基因芯片聯(lián)用的技術(shù)，建立了高通量芯片檢測(cè)方法，可以高效特異的檢測(cè)多種致瀉性大腸桿菌，純菌檢測(cè)靈敏度可達(dá)104cfu/mL，達(dá)到較高的檢測(cè)靈敏度，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道相一致[8-9]。所建立的多種致瀉性大腸桿菌基因芯片檢測(cè)方法可作為一種有效的初篩方法應(yīng)用于出入境檢驗(yàn)檢疫局、食品工廠等部門檢查食品的安全，同時(shí)，為流行病學(xué)調(diào)查和傳染性疾病的早期診斷和判定提供了一種有效的檢測(cè)手段。

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