蔡 莉

（江陰職業(yè)技術(shù)學院化紡系，江蘇 江陰，214433）

近幾年隨著制藥企業(yè)GMP的實施，臭氧滅菌效果的監(jiān)測日益受到重視，可供選擇的監(jiān)測方法很多，如化學指示劑法、留點溫度計法等，但較為可靠的方法為采用生物指示劑［1］，即用某些特異的菌種作為指示菌，根據(jù)其是否被殺滅作為消毒滅菌的指標。無菌檢查是無菌產(chǎn)品質(zhì)量控制的一個重要指標。但無菌檢查時常采用抽樣檢查，而微生物污染是非均勻污染，由于抽樣的概率問題，生產(chǎn)過程中產(chǎn)品滅菌效果不符合要求往往難以用無菌檢查結(jié)果反映出來，除非是較嚴重污染的情況［2］。因此，產(chǎn)品的無菌保證不能依據(jù)終產(chǎn)品的無菌檢查結(jié)果，而需要通過生物指示劑的挑戰(zhàn)試驗來監(jiān)控。

在微生物挑戰(zhàn)性試驗中，傳統(tǒng)的檢驗臭氧消毒效果是用枯草芽孢桿菌來檢測，但實踐證明枯草芽孢桿菌作為檢測的生物指示劑存在著較多的缺點，其殺菌率達不到微生物挑戰(zhàn)性試驗的標準要求。因此為提高檢測的靈敏度，本文分別考察兩種生物指示劑，在不同的臭氧消毒時間、臭氧濃度、環(huán)境溫度等條件下，以環(huán)境中的菌體殘留量（殺菌率）作為指標來檢測殺菌效果，從而優(yōu)選出對臭氧較為敏感的生物指示劑。進而對選出的生物指示劑進行微生物挑戰(zhàn)性試驗驗證［3－4］，選出更為合適的生物指示劑。

1 材料與方法

1.1 材料

金黃色葡萄球菌（北京四環(huán)衛(wèi)生藥械廠有限公司）、枯草芽孢條（上海寶錄生物科技有限公司），分別取上述菌液1ml，用pH值＝7.0的緩沖液稀釋為原來的10－4，控制菌種數(shù)在50－100cfu／ml之內(nèi)；臭氧消毒器（河北冠宇環(huán)保設(shè)備制造有限公司；生化培養(yǎng)箱（上海博訊室業(yè)有限公司）。

1.2 方法

在潔凈區(qū)相應(yīng)的功能間內(nèi)，將已稀釋好的枯草芽孢桿菌菌懸液和金黃色葡萄球菌菌懸液（稀釋級別為10－4）1ml分別滴加到空培養(yǎng)皿內(nèi)，每個功能間放兩平皿，使菌懸液平攤分布滿整個平皿，每個房間放置培養(yǎng)皿時需考慮工作區(qū)域和最差情況點（如氣流組織不易到達的角落和容易積塵不易清潔的死角）。打開臭氧消毒器，控制臭氧濃度15－20ppm、溫度20－25℃、消毒四小時。消毒結(jié)束后向平皿中注入15ml 40℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻，待培養(yǎng)基冷凝后培養(yǎng)若干小時后觀察計數(shù)。同時以兩個菌懸液平皿放置相同的時間后注入瓊脂冷凝后做陽性對照，并向兩個空白平皿注入營養(yǎng)瓊脂做為空白對照。以上培養(yǎng)皿均放入生化培養(yǎng)箱中，溫度控制在30－35℃，培養(yǎng)72h后對微生物進行計數(shù)。本文以殺菌率作為指標來比較臭氧對生物指示劑的殺滅效果。殺菌率的計算公式為：殺菌率＝（對照組菌數(shù)－消毒組菌殘存數(shù)）／對照組菌數(shù)×100%。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同臭氧消毒環(huán)境對兩種微生物指示劑的影

響

分別考察不同的臭氧消毒時間、臭氧濃度、環(huán)境溫度對兩種生物指示劑殺菌率的影響，從而得到對臭氧消毒較為敏感的生物指示劑。

2.1.1 臭氧消毒時間對兩種生物指示劑的影響

分別考察不同臭氧消毒時間（1h、2h、3h、4h、5h）下，對兩種生物指示劑的生長影響，結(jié)果見圖1。

圖1 臭氧消毒時間對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌殺菌率的影響

由圖1可知，臭氧對金黃色葡萄球菌的殺菌率大于對枯草芽孢桿菌的殺菌率，其作為生物指示劑靈敏性更優(yōu)于枯草芽孢桿菌，因此選取臭氧消毒最佳時間為2小時。

2.1.2 臭氧濃度對兩種生物指示劑的影響

分別考察不同的臭氧消毒濃度（2ppm，6ppm，8ppm，10ppm，15ppm，20ppm）對兩種生物指示劑生長的影響，具體結(jié)果見圖2。

圖2 臭氧濃度對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌殺菌率的影響

由圖2曲線可知，金黃色葡萄球菌的最高殺菌率仍高于枯草芽孢桿菌，說明金黃色葡萄球菌作為生物指示劑其敏感性要優(yōu)于枯草芽孢桿菌，因此宜選擇臭氧消毒濃度為15ppm。

2.1.3 消毒時環(huán)境溫度對兩種生物指示劑的影響

研究不同的消毒溫度（5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃）對兩種生物指示劑殺菌率的影響，具體結(jié)果見圖3。

圖3 消毒時環(huán)境溫度對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌殺菌率的影響

由圖3可知，用金黃色葡萄球菌作為生物指示劑，當消毒時環(huán)境溫度為20℃時，對金黃色葡萄球菌的殺菌率達到最高，其殺菌效果比較明顯。因此宜選擇20℃作為臭氧消毒滅菌的環(huán)境溫度。

通過以上不同條件下對兩種生物指示劑殺菌率的比較，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的靈敏性優(yōu)于枯草芽孢桿菌，但其殺菌率是否能達到微生物挑戰(zhàn)性試驗的要求，尚需進一步驗證。

2.2 對金黃色葡萄球菌做生物指示劑的驗證

臭氧消毒前對十萬級無菌室做浮游菌檢測，并在臭氧消毒后再次檢測浮游菌，得出殺菌率。同時在殺菌時用金黃色葡萄球菌作為生物指示劑來檢測臭氧消毒能力，并計算其殺菌率。

比較以上兩個殺菌率，如果殺菌率相似（相差5%，達到微生物可接受標準），則說明金黃色葡萄球菌能作為臭氧消毒的生物指示劑。

表1 浮游菌檢測記錄

表2 金黃色葡萄球菌檢測檢測記錄

根據(jù)公式計算，得出金黃色葡萄球菌殺菌率為91.6%，浮游菌殺菌率為92.94%，其偏差在可接受標準之內(nèi)。故金黃色葡萄球菌能作為微生物挑戰(zhàn)性試驗的生物指示劑，可用于檢測臭氧消毒的效果。

3 結(jié)論

本文創(chuàng)新性的選擇金黃色葡萄球菌作為生物指示劑，與傳統(tǒng)的生物指示劑——枯草芽孢桿菌進行比較，通過試驗得到當臭氧消毒時間2h、臭氧消毒濃度為15ppm、環(huán)境溫度20℃時，用金黃色葡萄球菌做生物指示劑靈敏性要優(yōu)于枯草芽孢桿菌做生物指示劑，同時其殺菌效果符合微生物挑戰(zhàn)性實驗的要求，因此可作為監(jiān)測臭氧消毒效果的生物指示劑。

［1］安玉梅，周存英，劉相娟.兩種生物指示劑對壓力蒸汽滅菌器生物監(jiān)測的影響［J］.當代護士，2010（10）：154－155.

［2］黃程蘭，劉敏，陳瀅.臭氧在污水處理中的應(yīng)用［J］.四川化工，2012（1）：25－28.

［3］蘇敏.臭氧空氣消毒的臨床應(yīng)用［J］.實用醫(yī)藥雜志，1998，11（1）：66.

［4］龔海燕，張明，李倩.滅菌生物指示劑與指示微生物［J］.環(huán)境衛(wèi)生學雜志，2013，3（4）：170－174.