李芳林 張凝宇 欽卓輝 李 輝 李智民

（深圳市職業(yè)病防治院，廣東 深圳 518000）

血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑減輕糖尿病腎間質(zhì)巨噬細胞的浸潤

李芳林 張凝宇 欽卓輝 李 輝 李智民

（深圳市職業(yè)病防治院，廣東 深圳 518000）

目的 探討血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對糖尿病腎臟的保護作用。方法 STZ尾靜脈注射建立大鼠糖尿病模型。用免疫組化方法檢測大鼠腎臟巨噬細胞的表達。比較血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療組與非治療組腎臟巨噬細胞的表達。結(jié)果 糖尿病成模后，巨噬細胞在腎間質(zhì)的表達明顯增加。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療組較非治療組腎間質(zhì)巨噬細胞的浸潤減少加(P＜0.01)，伴隨蛋白尿的減輕。結(jié)論 血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可減輕糖尿病大鼠腎臟炎癥浸潤。

血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑；巨噬細胞；糖尿病

越來越多的證據(jù)顯示，炎癥在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病中起重要作用[1]。無論1型還是2型糖尿病腎病，早期腎組織中均有單核/巨噬細胞的浸潤。浸潤的單核/巨噬細胞通過分泌細胞因子、炎性介質(zhì)及產(chǎn)生氧自由基等造成腎組織結(jié)構(gòu)的破壞，加速腎小球硬化的進程。尤其近年腎臟間質(zhì)的病變在糖尿病腎病發(fā)展中的作用逐漸得到認可和重視。本人在以往的研究中也發(fā)現(xiàn)過巨噬細胞在糖尿病腎間質(zhì)中的浸潤[2]。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）被證實具有獨立于降壓之外的腎保護作用[3]，國內(nèi)對于血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對糖尿病腎病發(fā)病早期的巨噬細胞浸潤作用卻鮮有報道。因此本研究主要探討了血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對糖尿病大鼠腎臟中巨噬細胞浸潤的影響及與蛋白尿的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 糖尿病大鼠模型的建立

健康雄性SD大鼠24只（200～250 g）。隨機分為正常對照組（NC組）8只，糖尿病組（DM組）16只。糖尿病組大鼠禁食不禁水12 h后，予一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司）50 mg/kg。48 h后尾靜脈采血，快速血糖儀測隨機血糖，1周后復(fù)測空腹血糖，以兩次隨機血糖＞16.7 mmol/L和空腹血糖＞13.9 mmol/L為糖尿病模型建立成功，建模成功后將糖尿病組隨機分為2個亞組，1組為纈沙坦治療組（DV組），1組為糖尿病對照組（DC組）。治療組予50 mg/（kg·d）纈沙坦（北京諾華公司提供，160毫克/粒）灌胃，糖尿病對照組（DC組）和正常對照組（NC組）不予治療。正常對照組予等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液注射。在8周留取血、尿、組織標(biāo)本。

1.2 組織學(xué)常規(guī)檢查

腎組織石蠟切片行PAS和HE染色，觀察腎組織腎小球硬化程度和腎小管損害程度。腎小球系膜區(qū)增寬程度按0～3分的半定量計分方法評價：0級為無系膜增寬，計0分；1級為輕度系膜增寬，計1分；2級為中度系膜增寬，計2分；3級為重度系膜增寬，計3分。每個動物至少評價30個腎小球，最終評分由所評價的動物所有腎小球計分的平均值得出，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.3 免疫組織化學(xué)染色和量化

腎組織石蠟切片用小鼠抗-大鼠CD68抗體（識別大鼠巨噬細胞）（Serotec公司，UK）行免疫組織化學(xué)染色，最后套染無蘇木素的PAS。分別計算20個連續(xù)非重疊的腎皮質(zhì)區(qū)高倍鏡視野下（×400）CD68+巨噬細胞數(shù)，除以高倍視野數(shù)，得每皮質(zhì)高倍視野下的平均細胞數(shù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

均數(shù)比較采用方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖、體質(zhì)量及腎重/體質(zhì)量變化

NC組大鼠隨著時間的延長，體質(zhì)量逐漸增加。而糖尿病大鼠隨著時間的延長體質(zhì)量無明顯增加。DC組、DV組體質(zhì)量均低于NC組體質(zhì)量（P＜0.01）。DC組、DV組大鼠各時間點血糖較NC對照組明顯增高（P＜0.01）。見表1。

表1 大鼠血糖、體質(zhì)量和24 h尿蛋白排泄量的測定

2.2 24 h尿蛋白排泄量

DC組隨著時間的延長，24 h尿白蛋白的排泄量逐漸升高，各時間點統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異（P＜0.01）。與NC組比較，DC組各時間24 h尿白蛋白的排泄量明顯升高，統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。DV組與DC組比較，蛋白尿有減輕趨勢，在8周時DV組較DC組尿白蛋白排泄率減少（P＜0.05）。

2.3 光鏡病理學(xué)變化

在DM組大鼠可以看到：腎小球體積增大，腎小球囊腔縮小，系膜區(qū)增寬，基底膜增厚以及腎小管肥大。而NC組無以上變化，DC組上述變化較DV組嚴(yán)重。8周時DC組與DV組腎小球系膜增寬半定量評分分別為（2.16±0.12） 和（1.74±0.40） （P＜0.01）。

2.4 腎臟巨噬細胞浸潤

免疫組化染色顯示在NC組大鼠腎間質(zhì)偶爾見到個別巨噬細胞浸潤。DC組腎間質(zhì)內(nèi)有明顯巨噬細胞浸潤，而在DV組巨噬細胞浸潤情況較DC組減輕。DC組與DV組8周腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤數(shù)分別為（13.9±3.3）個/HPF和（8.3±2.7）個/HPF（P＜0.01）。見圖1。

圖1 腎間質(zhì)CD68+巨噬細胞免疫組化染色(×200；a：DC組；b：DV組)

3 討 論

在本研究中，我們探討了血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎間質(zhì)中的巨噬細胞浸潤的影響，及其在糖尿病早期腎損害中的保護作用。結(jié)果顯示：在糖尿病大鼠腎臟中，腎間質(zhì)可見巨噬細胞浸潤，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可明顯減輕巨噬細胞的浸潤和蛋白尿水平，伴隨光鏡病理學(xué)的變化。

在糖尿病腎病早期，腎小球表達過量單核細胞趨化蛋白-1、血管細胞黏附分子-1、細胞間黏附分子-1等，導(dǎo)致組織局部單核/巨噬細胞浸潤，浸潤的單核/巨噬細胞通過分泌細胞因子，炎性介質(zhì)及產(chǎn)生氧自由基等造成腎組織結(jié)構(gòu)的破壞，加速腎臟病變進程。盡管糖尿病腎病在以往被強調(diào)為腎小球疾病，但是近年腎臟間質(zhì)的病變在糖尿病腎病發(fā)展中的作用得到認可和重視[4]。控制這一間質(zhì)炎癥過程，有可能延緩糖尿病的腎損害進程。

我們通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，在糖尿病成模后8周，此時腎臟中巨噬細胞的浸潤顯著，而腎小球只有個別巨噬細胞。在血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療組，腎間質(zhì)巨噬細胞的浸潤明顯減輕，腎小球系膜增寬程度減輕。這些提示纈沙坦可能通過減少巨噬細胞浸潤，減輕腎臟病理改變，減少尿蛋白排出，從而有效防止或延緩糖尿病腎病的進展。

血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑為什么能減輕腎間質(zhì)巨噬細胞的浸潤？這可能與血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑選擇性與血管緊張素Ⅱ受體結(jié)合有關(guān)。血管緊張素Ⅱ（AgnⅡ）無法與受體結(jié)合，因而AgnⅡ誘導(dǎo)的單核細胞趨化蛋白分泌減少，從而使單核巨噬細胞的浸潤減少[5]。

綜上所述，我們證實了血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對糖尿病大鼠腎臟炎性細胞浸潤的減輕作用。但是，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑是如何參與腎臟保護尚需深度研究。對炎癥浸潤的拮抗有望成為延緩糖尿病腎病的新靶點之一。

[1] King GL.The role of inflammatory cytokines in diabetes and its complications[J].J Periodontol,2008,79(8 Suppl):1527-1534.

[2] Li F.Increased expression of toll-like receptor 2 in rat diabetic nephropathy[J].Am J Nephrol,32(2):179-186.

[3] Tan F.Dual blockade of the renin-angiotensin-aldosterone system is safe and effective in reducing albuminuria in Asian type 2 diabetic patients with nephropathy[J].Singapore Med J,2010,51(2):151-156.

[4] Nagao T.Osteopontin plays a critical role in interstitial fibrosis but not glomerular sclerosis in diabetic nephropathy[J].Nephron Extra,2012,2(1):87-103.

[5] Chawla T.Role of the renin angiotensin system in diabetic nephropathy[J].World J Diabetes,2010,1(5):141-145.

R587.1

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1671-8194（2014）18-0083-02

國家職業(yè)病臨床重點?？平ㄔO(shè)項目（編號：WY2011873）