羅俊華 曹秋實

（1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430061）

·臨床觀察·

地五養(yǎng)肝方對HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群和細胞因子的影響*

羅俊華1，2曹秋實2

（1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430061）

目的觀察地五養(yǎng)肝方對HBeAg陰性慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血T淋巴細胞亞群和細胞因子的影響。方法將103例患者隨機分為對照組和治療組，對照組予以恩替卡韋治療，治療組在對照組治療基礎上加用地五養(yǎng)肝方。兩組共治療48周。觀察兩組患者HBV DNA轉陰率，檢測外周血細胞因子IL-17、IL-10的水平，并用流式細胞技術檢測外周血CD3+、CD4+及CD8+T淋巴細胞的表達情況。結果治療48周后，治療組患者HBV DNA轉陰率顯著高于對照組（P＜0.05），CD8+水平較對照組明顯下降（P＜0.01），CD4+及CD4+/CD8+水平較對照組升高更顯著（P＜0.05），IL-17、IL-10水平較對照組降低更明顯（P＜0.05）。結論T淋巴細胞和細胞因子在HBeAg陰性CHB的發(fā)病及轉歸中起到非常重要的作用，地五養(yǎng)肝方與恩替卡韋聯(lián)用能顯著改善外周血T淋巴細胞亞群狀態(tài)，調節(jié)細胞因子IL-17、IL-10的水平，提高抗病毒療效。

地五養(yǎng)肝方 慢性乙型肝炎 HbeAg T淋巴細胞亞群 細胞因子

HBeAg陰性慢性乙型肝炎（CHB）相對HBeAg陽性CHB具有病程較長、病情易反復、抗病毒療效差等特征［1］，是目前研究的熱點之一，其病情進展和預后與病毒水平密切相關。T淋巴細胞亞群及相關細胞因子的平衡在機體清除HBV中起到關鍵性作用［2］。研究表明，中醫(yī)中藥可以改善CHB患者免疫功能，增強西藥抗病毒的效果。本研究采用地五養(yǎng)肝方聯(lián)合恩替卡韋治療HBeAg陰性CHB，觀察治療前后HBV DNA、IL-17、IL-10及外周T細胞亞群的變化，探討其作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 納入標準：診斷標準符合2011年《慢性乙型肝炎防治指南》（2010年版）［3］；6個月內(nèi)未使用干擾素及核苷類似物、免疫抑制劑或免疫增強劑。排除標準：合并人類皰疹病毒、巨細胞病毒、HIV感染；合并藥物中毒、乙醇中毒等因素所致的肝炎及脂肪肝、自身免疫性肝炎者；同時或重疊感染甲、丙、丁、戊型肝炎病毒者。

1.2 臨床資料 收集2011年11月至2013年10月在湖北省中醫(yī)院肝病中心門診就診的HBeAg陰性CHB患者103例。將患者按照隨機數(shù)字表法隨機分為兩組。對照組48例，男性30例，女性18例；平均年齡（38.10±13.70）歲。治療組55例，男性34例，女性21例；平均年齡（37.90±13.20）歲。兩組患者在性別、年齡、病程、肝功能等方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。所有患者對本研究均知情同意，相關程序符合醫(yī)學倫理學有關標準并取得醫(yī)院人體試驗委員會批準。

1.3 治療方法 對照組給予恩替卡韋片0.5 mg/d（中美上海施貴寶制藥有限公司，商品名為博路定，批準文號為國藥準字H20052237，規(guī)格為0.5 mg）口服。治療組在口服恩替卡韋基礎上，加用地五養(yǎng)肝方（江陰天江藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號12040019，規(guī)格為10 g）口服1包/次，每日2次（早晚溫開水沖服）。療程48周。

1.4 觀察指標 （1）肝功能及HBV DNA的檢測。肝功能檢測采用Beckman全自動生化分析儀；HBV DNA定量采用熒光定量PCR法，由專人按照儀器操作規(guī)程和試劑盒說明書操作。試劑盒購自武漢博士得生物工程公司。（2）IL-17及IL-10的檢測。采用ELISA法，試劑盒購自武漢博士得生物工程公司，按試劑盒說明書操作。（3）T淋巴細胞亞群的檢測。采用美國BD公司生產(chǎn)的BD FACScalibur流式細胞儀，檢測外周血T淋巴細胞亞群。采集靜脈血1 mL，肝素鈉抗凝，取流氏管分別加入靜脈抗凝全血100 μL及三色標記的單克隆抗體（鼠抗人 CD3-FITC，CD4-APC，CD8-PE，試劑均購自美國BD公司）20 μL，混勻室溫避光30 min后加含2.5％胎牛血清（FBS）的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）2.5 mL，離心洗去多余抗體，破紅，再次離心洗滌，棄上清，細胞以10 g/L多聚甲醛重懸，流式細胞儀檢測CD3+、CD4+及CD8+T細胞亞群。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗，治療前后比較采用配對t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組治療前后肝功能比較 見表1。兩組治療后丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）及總膽紅素（TBIL）水平與治療前比較均顯著下降（P＜0.01）；與對照組治療后比較，治療組治療后ALT、AST及TBIL水平明顯降低（P＜0.05）。

2.2 兩組HBV DNA陰轉情況比較 治療48周后，治療組HBV DNA轉陰51例（92.7％），對照組轉陰37例（77.1％），治療組HBV DNA陰轉率明顯高于對照組（P＜ 0.05）。

表1 兩組治療前后ALT、AST及TBIL水平比較（±s）

表1 兩組治療前后ALT、AST及TBIL水平比較（±s）

與本組治療前比較，*P＜0.01；與對照組同期比較，△P＜0.05。

組 別ALT（U/L） AST（U/L）TBIL（μmol/L）治療組 治療前 43.54±23.71（n＝55）治療后 21.91±9.70*△對照組 治療前 46.88±21.57 147.93±51.32 139.85±40.77 49.52±10.32*△ 45.91±11.67*△143.53±47.22 141.16±42.69（n＝48）治療后 29.47±10.51*57.83±12.45* 54.41±13.83*

2.3 兩組治療前后外周血T淋巴細胞亞群比較 見表2。對照組治療后CD4+及CD4+/CD8+較治療前均顯著增加（P＜0.05），CD3+及CD8+差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療組治療后CD4+及CD4+/CD8+較治療前均顯著增加 （P＜0.01或 P＜0.05），CD8+顯著下降 （P＜0.01），CD3+差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與同期對照組比較，CD4+及CD4+/CD8+升高更明顯（P＜0.05）。

表2 兩組治療前后外周血T淋巴細胞亞群比較（±s）

表2 兩組治療前后外周血T淋巴細胞亞群比較（±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組同期比較，△P＜0.05。下同。

組 別CD3+（％） CD4+（％） CD8+（％） CD4+/CD8+治療組 治療前（n＝55）治療后對照組 治療前65.21±16.90 29.51±5.10 35.12±5.92 0.84±0.29 67.42±11.21 41.13±6.32**△26.91±4.90**1.54±0.40*△65.53±17.47 29.31±4.66 34.74±6.16 0.83±0.35（n＝48）治療后66.76±10.55 35.61±5.40*30.81±5.64 1.16±0.32*

2.4 兩組治療前后血清細胞因子水平比較 見表3。兩組治療后IL-17、IL-10水平較治療前均顯著下降（P＜0.01）；與對照組治療后比較，治療組治療后IL-17、IL-10水平明顯降低（P＜0.05）。

表3 兩組治療前后IL-17及IL-10水平比較（pg/mL，±s）

表3 兩組治療前后IL-17及IL-10水平比較（pg/mL，±s）

組 別 IL-17 IL-10治療組 治療前 191.65±48.25 83.42±23.73（n＝55） 治療后 118.94±121.66**△ 47.81±14.65**△對照組 治療前 198.33±31.61 82.67±22.46（n＝48） 治療后 137.67±119.75** 58.41±16.20**

3 討論

HBV感染中HBeAg陰性感染占70％。HBeAg陰性CHB具有較高的向肝硬化、終末期肝病、肝細胞癌發(fā)展的傾向［4］，其HBV變異所引起的宿主免疫應答的相應變化，往往使感染后的病情進展趨于復雜［5］。國內(nèi)外研究證實，HBeAg陰性CHB患者外周血CD4+T淋巴細胞減少，CD8+T淋巴細胞增加，CD4+/CD8+比值下降［6-7］。CD4+淋巴細胞的數(shù)量和功能下降，直接導致細胞免疫功能低下，不利于宿主對病毒進一步清除。CD8+淋巴細胞過度活化又會導致嚴重肝組織破壞。伴隨T淋巴細胞亞群失衡，CHB患者也存在細胞因子（如IL-17、IL-10等）的失調。IL-17是一種重要的促炎癥細胞因子，主要是由活化的記憶性CD4+T淋巴細胞分泌，它可以促進機體局部產(chǎn)生趨化因子，誘導其致炎因子引起組織損害。研究發(fā)現(xiàn)IL-17與HBV感染后的肝臟炎性損傷有著密切關系，大部分CHB患者IL-17水平與ALT和病毒載量呈正相關［8］。IL-10是一種強有力的免疫和炎癥抑制因子，它可以抑制Th1型免疫應答，降低CHB患者的細胞免疫功能，促進Treg的增殖和活化，導致HBV持續(xù)存在［9］。Arnaud等研究表明CHB患者IL-10水平明顯升高，高水平的IL-10不利于HBV的清除［10］。如何最大程度改善CHB患者感染后免疫耐受狀態(tài)，恢復T淋巴細胞亞群的平衡，改善細胞因子的失調，徹底清除HBV，是治療HBeAg陰性CHB的關鍵。

恩替卡韋是目前治療HBeAg陰性CHB抗病毒極有前景的藥物，能強效抗病毒，且耐藥率低。中醫(yī)藥對HBV的直接作用不及現(xiàn)在的西藥抗病毒藥物，但中醫(yī)藥能有效改善CHB患者的宿主狀態(tài)，增強西藥抗病毒效果，阻止或延緩CHB病程進一步發(fā)展［11］。地五養(yǎng)肝方通過補腎來糾正CHB患者紊亂的免疫功能狀態(tài)，促進病毒的清除及肝細胞的正常再生，方中重用熟地黃補腎填精扶正，茵陳蒿清熱利濕祛邪，共為君藥；五味子配熟地黃增強補腎功能，生甘草配茵陳蒿增強清熱解毒功能，共為臣藥；姜黃辛溫通絡、活血化瘀為佐藥；方中甘草又能調和諸藥，行使藥之能。全方共奏補腎祛邪之功。臨床研究表明地五養(yǎng)肝方能改善HBeAg陰性CHB患者臨床證候、抗肝損傷、抗肝纖維化。方中熟地及五味子并入肝腎二經(jīng)，肝腎同養(yǎng)，對免疫系統(tǒng)具有雙向調節(jié)作用，使機體免疫抑制狀態(tài)有一定恢復［12-13］。

本研究結果說明恩替卡韋抗病毒療效明顯，且可間接改善機體細胞免疫功能，與報道一致［14-15］。地五養(yǎng)肝方能改善HBeAg陰性CHB患者的免疫狀態(tài)，提高恩替卡韋的療效。

綜上所述，T淋巴細胞及各種細胞因子在HBeAg陰性CHB的發(fā)病及轉歸中起到非常重要的作用，地五養(yǎng)肝方與恩替卡韋聯(lián)用有一定的協(xié)同作用，能更好調整細胞因子水平，調節(jié)T淋巴細胞亞群的平衡，明顯改善肝功能，顯著提高HBV DNA轉陰率，提高CHB抗病毒療效。但由于本研究納入病例少，觀察時間短，對地五養(yǎng)肝方聯(lián)合恩替卡韋療程及遠期療效，以及地五養(yǎng)肝方調節(jié)T淋巴細胞亞群及細胞因子平衡的進一步機制等，還有待進一步研究。

［1］He D，Guo S，Chen W，et al.Long-term outcomes after nucleos（t）ide analogues discontinuation in chronic hepatitis B patients with HBeAg-negative［J］.BMC Infect Dis，2013，13（6）：458.

［2］Beckebaum S，Cicinnati VR，Zhang X，et al.Hepatitis B virus-induced defect of monocyte-derived dendritic cells leads to mpaired T helper type 1 response in vitro：mechanismsforviralimmuneescape［J］.Immunology，2003，109（5）：487-495.

［3］中華醫(yī)學會肝病學分會、感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.臨床肝膽病雜志，2011，27（1）：Ⅰ-Ⅺ.

［4］Bai H，Liu H，Chen X，et al.Influence of age and HBeAg status on the correlation between HBV DNA and hepatic inflammation and fibrosis in chronic hepatitis B patients［J］.Dig Dis Sci，2013，58（5）：1355-1362.

［5］陳育霞，施雅利.e抗原陰性的慢性乙型肝炎研究進展［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2010，31（15）：205-207.

［6］Han YP，Li J，Jiang LF，Xu QQ，et al.Hepatitis B e antigen from chronic hepatitis B patients induces Th1/Th2 cytokine imbalance in vitro［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2013，21（8）：584-589.

［7］孫學華，劉巧麗，李曼，等.慢性乙型肝炎患者CD4和CD8 T細胞亞群的研究［J］.細胞與分子免疫學雜志，2011，27（5）：545-550.

［8］Zhang JY，Zhang Z，Lin F，et al.Interleukin-17-producing CD4（+）T cells increase with severity of liver damage in patients with chronic hepatitis B［J］.Hepatology，2010，51（6）：81-91.

［9］齊育英，林振忠，明德松，等.IL-6、IL-10、IL-17在慢性乙型病毒性肝炎患者血中水平分析［J］.中國免疫學雜志，2013，29（11）：1177-1180.

［10］Arnaud V，Li J，Wang Y，et al.Regulatory role of interleukin-10 and interferon-gamma in severe hepatic central and peripheral fibrosis in humans infected with Schistosoma japonicum［J］.J Infect Dis，2008，198（11）：418-426.

［11］劉文娟，蔣海寅，張永華.慢性乙型肝炎免疫學機制和中醫(yī)藥治療研究進展［J］.浙江中西醫(yī)結合雜志，2011，21（2）：140-143.

［12］宋連昆，陳乃.地黃藥理作用研究進展［C］.第2屆中國藥理學會補益藥藥理專業(yè)委員會學術研討會論文匯編，2012：23-24.

［13］杜建成.五味子化學成分及藥理研究進展［J］.中國醫(yī)藥科學，2011，20（1）：32-33.

［14］林孟新，蘇智軍，郭如意，等.恩替卡韋治療慢性乙型肝炎患者外周血細胞亞群和補體的變化［J］.實用肝臟病雜志，2013，16（4）：354-355.

［15］Yu XP，Guo RY，Su ML，et al.Dynamic changes of treg and Th17 cells and related cytokines closely correlate with the virological and biochemical response in chronic hepatitis B patients undergoing nucleos（t）ide analogues treatment［J］. Hepat Mon，2013，13（12）：15332.

Effects of Diwu Yanggan Decoction on T lymphocyte Subsets and Cytokines in Peripheral Blood in Pa-tients with HBeAg-negative Chronic Hepatitis B

LUO Junhua，CAO Qiushi. Wuhan General Hospital of PLA Guang-zhou Military Command，Wuhan 430070，China

Objective：To investigate the effects of Diwu Yanggan decoction on T lymphocyte subsets and cytokines in peripheral blood in patients with HBeAg-negative chronic hepatitis B.Methods：103 cases with HBeAg-negative CHB were randomly divided into 2 groups.The control group was only given entecavir 0.5 mg/d while the treatment group was added with Diwu Yangganfang on the basis of entecavir.The treatment course was 48 weeks.The variations of HBV DNA，IL-17，IL-10，CD3+，CD4+and CD8+T lymphocytes in the patients were detected.Results：After 48 weeks treatment，Compared with the control group，the negative conversation rate of HBV DNA was significantly higher in the treatment group（P＜0.05）.The percentages of CD4+and CD4+/CD8+T lymphocytes in the treatment group were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）.The levels of IL-17 and IL-10 in the treatment group were significantly lower than those in the control group（P＜0.05）. Conclusion：T lymphocyte and cytokines play extremely important role in the onset and transformation of HBeAg-negative chronic hepatitis B.Diwu Yanggan decoction combined with entecavir can significantly increase the percentages of CD4+and CD4+/CD8+T lymphocytes and reduce the levels of IL-17 and IL-10 to improve efficacy.

Diwu Yanggan decoction；Chronic hepatitis B；HBeAg；T lymphocyte subsets；Cytokines

R512.6+2

A

1004-745X（2014）08-1505-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.045

2014-04-04）

國家中醫(yī)藥管理局國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務建設科研專項課題（JDZX2012052）