賴 婧，張 波，姚日生，3

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，合肥 230009;2.合肥工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，合肥 230009;3.農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，合肥 230009)

脂肪酸是重要的有機(jī)化工和精細(xì)化工原料，以脂肪酸為原料生產(chǎn)的下游衍生物廣泛應(yīng)用于紡織印染、食品、醫(yī)藥、日用化工、石油化工和橡塑加工等許多領(lǐng)域。目前，世界脂肪酸的主要來(lái)源是從天然動(dòng)植物油脂經(jīng)水解、精餾得到［1］。

微生物油脂，又稱單細(xì)胞油脂(single cell oil，SCO)，是指由微生物在一定條件下將碳水化合物、碳?xì)浠衔锏然|(zhì)轉(zhuǎn)化為菌體內(nèi)大量貯存的油脂［2－4］。與生產(chǎn)動(dòng)、植物油脂相比，微生物油脂的生產(chǎn)有許多優(yōu)點(diǎn)［5］:微生物細(xì)胞增殖快，生產(chǎn)周期短;生長(zhǎng)所需的原料豐富，價(jià)格便宜;所需勞動(dòng)力少，不受季節(jié)、氣候變化的限制;能連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低等。因此，利用微生物發(fā)酵方法，把一些廉價(jià)易得的農(nóng)副產(chǎn)品及食品工業(yè)的廢棄物轉(zhuǎn)化為所需油脂已日益成為許多研究者關(guān)注的熱點(diǎn)［6－7］。

目前，微生物利用淀粉質(zhì)原料產(chǎn)油脂的一般過(guò)程為先將淀粉水解成糖再發(fā)酵產(chǎn)油脂，其中淀粉的水解通常采用雙酶法［8］，在此期間需經(jīng)過(guò)2次pH調(diào)節(jié)，過(guò)程復(fù)雜、繁瑣;而本研究采用實(shí)驗(yàn)室自篩的長(zhǎng)孢被孢霉(M.elongate)可直接利用淀粉質(zhì)原料。針對(duì)M.elongate的這一特性，對(duì)其發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行研究可使微生物發(fā)酵產(chǎn)油脂這一過(guò)程大為簡(jiǎn)化。

筆者對(duì)長(zhǎng)孢被孢霉利用淀粉質(zhì)原料發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行研究，并重點(diǎn)研究補(bǔ)料發(fā)酵方案，以期提高微生物油脂的生產(chǎn)利用率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

M.elongate PFY，合肥工業(yè)大學(xué)久易化工研究所自篩;4℃保藏于斜面培養(yǎng)基。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 30、酵母膏 8、K2HPO40.5、ZnSO40.5、MgSO40.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉(待考察)、玉米漿(待考察)、K2HPO40.5、ZnSO40.5、MgSO40.5。

1.1.3 主要試劑

所用玉米漿為市售;酵母膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其他試劑均為分析級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)

種子培養(yǎng):將活化后的菌體挑取2環(huán)接種到100 mL滅菌種子培養(yǎng)基中，置250 mL搖瓶，于28℃、150 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng):取培養(yǎng)24 h的種子，按2%的接種量接種到100 mL滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，置250 mL搖瓶，于28℃、150 r/min轉(zhuǎn)速下，培養(yǎng)一定時(shí)間，定時(shí)取樣，測(cè)定其油脂含量。

1.2.2 菌體生物量的測(cè)定

采用細(xì)胞干質(zhì)量［9］(dry cell weight，DCW)法測(cè)定菌體生物量。發(fā)酵液過(guò)濾、洗滌，得到的細(xì)胞于60℃下烘干至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，以干菌體質(zhì)量濃度ρ(DCW)(g/L)表示。

1.2.3 殘?zhí)菨舛鹊臏y(cè)定

發(fā)酵液過(guò)濾后，濾液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，采用蒽酮比色法測(cè)定發(fā)酵液中總糖殘余量［10］。

1.2.4 菌體內(nèi)油脂含量的測(cè)定及成分分析

選用索氏提取法測(cè)定油脂含量［11］:采用沸程30～60℃的石油醚提取干菌體內(nèi)的油脂，并于90℃下烘干殘余的石油醚，測(cè)定油脂質(zhì)量。油脂含量以菌體內(nèi)油脂量占菌體干質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)表示，按式(1)計(jì)算。

采用GC-MS法分析油脂成分［12］:將油脂進(jìn)行甲酯化后進(jìn)行GC-MS分析，測(cè)定其中飽和與不飽和脂肪酸的比例。

2 結(jié)果與討論

2.1 油脂成分分析

對(duì)發(fā)酵所得微生物油脂進(jìn)行甲酯化處理后進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果顯示該微生物油脂中含有多種脂肪酸組分，其主要成分含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)):硬脂酸39.90%，油酸31.70%和亞油酸27.30%。

2.2 可溶性淀粉濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

在維持發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比不變的前提下，考察可溶性淀粉質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 C源對(duì)微生物油脂產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of soluble starch concentration on lipid production

由圖1可以看出，C源的用量對(duì)菌體發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響較大。隨著可溶性淀粉濃度的增大，菌體干質(zhì)量不斷增加;而油脂產(chǎn)量則出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并在可溶性淀粉質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)達(dá)最大，為198.21 mg/L，且此時(shí)底物利用率最高，達(dá)0.99%。這是由于當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中供能不足，菌種長(zhǎng)勢(shì)不良，使油脂合成受影響;當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí)，菌株長(zhǎng)勢(shì)較旺，種群密度過(guò)大，造成發(fā)酵后期體系溶氧不足，影響油脂合成。

2.3 玉米漿濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

固定可溶性淀粉質(zhì)量濃度20 g/L，考察不同玉米漿質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 玉米漿對(duì)微生物油脂產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of corn syrup concentration on lipid production

由圖2可以看出:由于N源對(duì)菌體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，隨著玉米漿濃度的升高，生物量不斷增加，但油脂含量則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并于玉米漿質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)達(dá)最大，為278.39 mg/L，且此時(shí)底物利用率最高，為1.39%。這是由于在碳氮比低的情況下更有利于菌體的生長(zhǎng)和生物量的提高。隨著碳氮比的增加，C源和N源優(yōu)先用于菌體生長(zhǎng)，當(dāng)N源耗盡后，N源成為限制性營(yíng)養(yǎng)素，細(xì)胞不能再繼續(xù)擴(kuò)增，就把所吸收的C源物質(zhì)轉(zhuǎn)化成脂類物質(zhì)，作為能源物質(zhì)儲(chǔ)存起來(lái)［13－14］。因此，當(dāng)玉米漿濃度過(guò)低時(shí)，N源消耗過(guò)快，菌體長(zhǎng)勢(shì)不佳，影響油脂合成;當(dāng)玉米漿濃度過(guò)高時(shí)，C源和N源被優(yōu)先用于菌體生長(zhǎng)，油脂產(chǎn)量下降。

2.4 發(fā)酵特性曲線

在20 g/L可溶性淀粉、3 g/L玉米漿的條件下，監(jiān)測(cè)發(fā)酵7 d內(nèi)的菌體生物量(以菌體干質(zhì)量表示)、油脂含量、殘?zhí)菨舛群蚿H變化，結(jié)果見(jiàn)圖3～圖4。

由圖3可知:隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌體濃度和油脂產(chǎn)量不斷增加，糖濃度不斷降低，至發(fā)酵第5天，菌體生物量和油脂產(chǎn)量達(dá)最大，且培養(yǎng)基中的C源基本耗盡，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度僅為2 g/L;此后，菌體細(xì)胞進(jìn)入饑餓狀態(tài)，制約生長(zhǎng)甚至自溶，造成菌體干質(zhì)量和油脂產(chǎn)量下降，殘?zhí)菨舛融呌诓蛔?。因此，可確定單批發(fā)酵的最適發(fā)酵時(shí)間為120 h。

圖3 發(fā)酵特性曲線Fig.3 Biomass variation with fermentation process

圖4 pH隨發(fā)酵過(guò)程的變化Fig.4 Effects of fermentation process on pH

由圖4可知:隨著發(fā)酵的進(jìn)行，體系pH呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，且在發(fā)酵48～96 h處有一平臺(tái)期，此平臺(tái)期也是油脂產(chǎn)量升高和殘?zhí)菨舛冉档妥羁斓臅r(shí)期。造成這一現(xiàn)象的原因可能是:隨著菌體細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)酵液中N源物質(zhì)逐漸消耗，體系pH下降;當(dāng)N源消耗殆盡時(shí)，菌體細(xì)胞開(kāi)始油脂合成，體系pH基本維持不變;隨著C源物質(zhì)的進(jìn)一步消耗，菌體細(xì)胞進(jìn)入衰亡期，菌體自溶，一些胞內(nèi)物質(zhì)釋放到發(fā)酵液中，使pH上升。因此，可通過(guò)監(jiān)測(cè)體系pH變化，確定發(fā)酵結(jié)束時(shí)間。

2.5 補(bǔ)料發(fā)酵對(duì)發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

由菌體生物量和殘?zhí)菨舛入S發(fā)酵的變化曲線可看出，菌體在發(fā)酵48～96 h，底物利用速度較快，故分別選擇發(fā)酵48、72和96 h作為補(bǔ)料開(kāi)始的時(shí)間點(diǎn)，考察僅補(bǔ)C源和同時(shí)補(bǔ)加C源和N源對(duì)油脂產(chǎn)量的影響。即每隔24 h補(bǔ)料，補(bǔ)料3次，單次補(bǔ)料量為可溶性淀粉2 g，玉米漿補(bǔ)加量隨C/N比變化，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 補(bǔ)料對(duì)微生物油脂產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of fed-batch on lipid yield

由圖5可知:各種補(bǔ)料方案對(duì)油脂產(chǎn)量均較不補(bǔ)料組有大幅度提高，且以僅補(bǔ)C源組增幅最大。這是由于補(bǔ)充N源后，培養(yǎng)基中N源增加，C源和N源被優(yōu)先用于菌體生長(zhǎng)，隨著N源逐漸被利用，N源成為限制性營(yíng)養(yǎng)因素，這時(shí)，菌體才開(kāi)始把所吸收的C源物質(zhì)大部分轉(zhuǎn)化成油脂。在發(fā)酵48 h和發(fā)酵72 h開(kāi)始補(bǔ)料，油脂產(chǎn)量和底物利用率相差不大。發(fā)酵48 h開(kāi)始補(bǔ)料，油脂產(chǎn)量最大為598.96 mg/L，底物利用率為2.3%;發(fā)酵72 h開(kāi)始補(bǔ)料，油脂產(chǎn)量最大，為 611.63 mg/L，底物利用率為2.35%。但結(jié)合發(fā)酵周期及經(jīng)濟(jì)效益，發(fā)酵48 h開(kāi)始補(bǔ)料發(fā)酵周期比發(fā)酵72 h開(kāi)始補(bǔ)料發(fā)酵周期短，經(jīng)濟(jì)效益較大。因此，選擇發(fā)酵48 h作為補(bǔ)料開(kāi)始時(shí)間，且可監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程pH變化，在pH 2.5時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料。

在確定補(bǔ)料成分后，考察單次補(bǔ)料量對(duì)油脂產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知:隨著單次補(bǔ)料量的增加，油脂產(chǎn)量逐漸增加，直至單次補(bǔ)料量為4 g時(shí)，油脂產(chǎn)量最高，此后，隨著單次補(bǔ)料量的進(jìn)一步增加，油脂產(chǎn)量降低。這是由于補(bǔ)料量過(guò)大時(shí)，體系黏度較大，溶氧不足，影響油脂合成。因此單次補(bǔ)加4 g可溶性淀粉為最適補(bǔ)料量，此時(shí)底物利用率高，且油脂產(chǎn)量最大，油脂產(chǎn)量較不補(bǔ)料時(shí)增加521.74 mg，增長(zhǎng)率為237.1%。

表1 補(bǔ)料濃度對(duì)微生物油脂產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of feeding culture concentration on lipid yield

3 結(jié)論

通過(guò)研究得出如下結(jié)論:

1)發(fā)酵所得微生物油脂，其主要成分含量為硬脂酸39.90%，油酸31.70%和亞油酸27.30%。

2)單批發(fā)酵的最適可溶性淀粉為20 g/L，最適玉米漿為3 g/L;N源對(duì)菌體增長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

3)油脂合成主要在發(fā)酵48～96 h進(jìn)行，單批發(fā)酵最佳時(shí)間為5 d。

4)通過(guò)補(bǔ)料工藝研究可知，最適起始補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)為發(fā)酵48 h，最適單次補(bǔ)料量為4 g，此時(shí)，油脂產(chǎn)量可增加521.74 mg，增長(zhǎng)率為237.1%。

通過(guò)研究表明，N源對(duì)菌株的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，N源濃度較大時(shí)，培養(yǎng)基中C源和N源優(yōu)先用于菌體細(xì)胞生長(zhǎng)，采用限氮補(bǔ)料工藝可大幅度提高微生物油脂的產(chǎn)量。發(fā)酵所得微生物油脂富含硬脂酸、油酸和亞油酸，均是重要的化工原料，可廣泛應(yīng)用于橡膠、醫(yī)藥和日用品等行業(yè)。

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