周文超，李薇，熊小敏

1.廣州軍區(qū) 廣州總醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州軍區(qū) 檢驗(yàn)中心，廣東 廣州 510010；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

Sakaguchi等于1995年首次提出CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）是一種具有免疫抑制/調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞群；2003年，Treg細(xì)胞被正式確認(rèn)為獨(dú)立的T細(xì)胞亞群。Treg細(xì)胞與感染、腫瘤、移植、自身免疫性疾病等多種疾病密切相關(guān)[1-2]。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞特異性表達(dá)Foxp3（fork?head/winged helix transcription factor 3，叉頭狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3），F(xiàn)oxp3與Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能密切相關(guān)，同時(shí)也是維持其免疫抑制功能的必要條件[3]。目前公認(rèn)Foxp3是CD4+CD25+Treg細(xì)胞特有的細(xì)胞標(biāo)志。CD4+CD25+Treg細(xì)胞高表達(dá)Foxp3，而只有很少的其他細(xì)胞表達(dá)Foxp3[4]。由于Foxp3位于細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)時(shí)需要打孔破膜，影響細(xì)胞活性，目前的技術(shù)尚不能直接分離活的Foxp3陽(yáng)性細(xì)胞。2006年Liu等[5]發(fā)現(xiàn)，CD127（IL-7受體）與Foxp3的表達(dá)有相關(guān)性。Seddiki等[6]發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞活化后高表達(dá)CD127，而Treg細(xì)胞則低表達(dá)CD127（CD4+CD25highCD127dim），因此CD127可以幫助識(shí)別Treg細(xì)胞與活化的T細(xì)胞。王會(huì)平等[7]報(bào)道，CD4+CD25+CD127low三標(biāo)記法是檢測(cè)Treg細(xì)胞的最理想指標(biāo)。目前少見有關(guān)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的正常人參考范圍的報(bào)道，迄今有關(guān)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的報(bào)道大部分是對(duì)照組與不同疾病組進(jìn)行比較，且所有有關(guān)對(duì)照組CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的表達(dá)范圍均不相同。為此，我們采用流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)2011年12月～2012年8月來(lái)我院健康體檢的人群外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的表達(dá)水平進(jìn)行了調(diào)查分析，以此建立本實(shí)驗(yàn)室健康成年人外周血中的參考范圍，方便我院臨床醫(yī)生對(duì)移植、腫瘤等相關(guān)疾病的研究，期望能夠?yàn)榕R床治療、判斷病程預(yù)后提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 觀察對(duì)象

收集2011年12月～2012年8月廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院體檢中心健康成年人外周血標(biāo)本180例，這些觀察對(duì)象在本院體檢期間血常規(guī)、尿常規(guī)、生化、肝功能、腎功能、腫瘤標(biāo)志物等各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)；心電圖、胸部X線檢查、腹部B超影像分析均未見明顯異常；無(wú)明顯的心、腦血管疾患，故視為健康人群。其中男99例、女81例，年齡17～84歲，平均43.64歲。根據(jù)性別分為男女2組；根據(jù)不同年齡段分為17～29歲（n=51）、30～39歲（n=34）、40～49歲（n=24）、50～59歲（n=36）、≥60歲（n=35）共5個(gè)組，依次編為1、2、3、4、5組。

1.2 其他材料

CD4-FITC、CD25-PE、鼠抗人 CD127-PerCPCy5.5、鼠IgG1-PE、鼠IgG1-PerCP-Cy5.5、溶血?jiǎng)⑶室?、流式?xì)胞儀BD FACS Calibur、細(xì)胞分析管（BD Biosciences公司）；TL-5.0w臺(tái)式離心機(jī)（上海市離心機(jī)械研究所有限公司）。

1.3 方法

清晨空腹采取EDTA-K3抗凝靜脈血2 mL，每份標(biāo)本設(shè)測(cè)定、同型對(duì)照2管，于測(cè)定管中加入CD4-FITC、CD25-PE 各 10 μL、鼠抗人 CD127-PerCPCy5.5 2 μL；同 型 對(duì) 照 管 中 加 入 CD4-FITC、鼠IgG1-PE 各 10 μL，鼠 IgG1-PerCP-Cy5.5 2 μL；分別于2管中各加入100 μL抗凝血?jiǎng)┖笳袷幓靹?，室溫避光?biāo)記15 min；加入1 mL溶血?jiǎng)袷幓靹?，室溫避光溶?0 min；2000 r/min離心2 min，棄上清液，加鞘液1 mL，2000 r/min離心2 min，棄上清液，加鞘液500 μL，充分混勻后上機(jī)分析。用Cell?quest軟件，以同型對(duì)照管CD4/SSC散點(diǎn)圖中CD4+FITC細(xì)胞群設(shè)門，確定鼠IgG1-PE/鼠IgG1-PerCPCy5.5散點(diǎn)圖中的陰性區(qū)域，分析測(cè)定管Cellquest圖中右下象限CD25+CD127low細(xì)胞群陽(yáng)性百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同性別健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的百分率

用Levene檢驗(yàn)方差齊性，結(jié)果顯示方差齊（F=0.321，P=0.572），采用獨(dú)立樣本的 t檢驗(yàn)，不同性別健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞百分率男、女分別為（4.06±1.56）%和（3.59±1.48）%，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 不同年齡段各組間外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的百分率

應(yīng)用單向方差分析，各組間進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示1、2、3組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），4、5組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；1、2、3組分別與4、5組間具有顯著性差異（P＜0.05）。參見表1。

2.3 健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞百分率參考范圍的確定

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，不同性別健康成年人CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的百分率無(wú)顯著性差異；17～49歲不同年齡段3組間無(wú)顯著差異，≥50歲2組間亦無(wú)顯著差異，而這2個(gè)年齡段之間則存在顯著性差異。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞參考范圍在實(shí)際使用中可忽略性別，但須依據(jù)17～49歲、≥50歲2個(gè)年齡段設(shè)不同的截?cái)嘀?，具體范圍確定為≤49歲為（3.30±1.45）%，≥50歲為（4.69±1.27）%。參見表2、圖1。

3 討論

CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞與腫瘤、移植疾病、自身免疫性疾病等密切相關(guān)，在不同的疾病中有升高或降低的趨勢(shì)。以往有關(guān)Treg細(xì)胞的研究中，多以CD4+CD25+細(xì)胞群中的Foxp3為主。Foxp3被認(rèn)為是特異性表達(dá)于CD4+CD25+Treg細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)記分子，在一定程度上可反映CD4+CD25+Treg細(xì)胞的水平和功能活性，可作為證實(shí)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表面標(biāo)志[8-9]。但由于Foxp3是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，檢測(cè)分析時(shí)須破膜打孔，檢測(cè)過(guò)程長(zhǎng)、復(fù)雜，且易影響細(xì)胞活性及丟失細(xì)胞數(shù)目，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[10]。2006年Liu等發(fā)現(xiàn)CD127（IL-7受體）與Foxp3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。與此同時(shí)，Seddiki等發(fā)現(xiàn)CD127可以幫助識(shí)別CD4+CD25+Treg細(xì)胞與活化的T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞活化后高表達(dá)CD127（CD4+CD25+CD127high），而真正的Treg細(xì)胞僅表達(dá)較低的CD127（CD4+CD25+CD127low）。因此，在 CD4+CD25+基礎(chǔ)上聯(lián)合CD127抗原，可以更好地識(shí)別人CD4+CD25+Treg細(xì)胞[7]。迄今在有關(guān)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的研究中，少見該指標(biāo)參考范圍的報(bào)道，多建立在疾病觀察組與對(duì)照組比較上[11-13]。國(guó)內(nèi)郭新紅等[11]報(bào)道健康對(duì)照組為（4.02±1.66）%，嚴(yán)波等[12]報(bào)道健康對(duì)照組為（6.027±0.854）%，結(jié)荊線等[13]報(bào)道健康對(duì)照組為（3.21±0.96）%，王盈等[14]報(bào)道健康人為（6.55±0.11）%，Zhang 等[15]報(bào)道健康對(duì)照組為（5.44±1.44）%，Guo 等[16]報(bào)道 健 康對(duì)照組（2.5±0.9）%。綜上，有關(guān)CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞指標(biāo)的報(bào)道不盡一致。本研究結(jié)果顯示，CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞指標(biāo)男性略高于女性，但經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，性別之間無(wú)顯著差異，表明該指標(biāo)在應(yīng)用于臨床時(shí)可以忽略性別。本研究還顯示，17～49歲間3個(gè)年齡段無(wú)顯著性差異，≥50歲的2個(gè)年齡段無(wú)顯著差異，而17～49歲與≥50歲2個(gè)年齡段間則存在顯著差異，表明臨床應(yīng)用該指標(biāo)時(shí)應(yīng)根據(jù)17～49歲及≥50歲設(shè)2個(gè)不同的截?cái)嘀禐閰⒖挤秶?/p>

表1 不同年齡段健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的百分率（x±s）

表2 健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127low Treg細(xì)胞的百分率（x±s）

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與有關(guān)報(bào)道存在差異[11～16]，可能與地域、試劑、標(biāo)本的選擇有關(guān)。本研究建立的CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞健康成年人表達(dá)范圍具前瞻性與創(chuàng)新意義，可用于腫瘤、器官移植、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜等多種疾病的臨床治療與療效觀察，并對(duì)疾病的病程轉(zhuǎn)歸具有一定的探討價(jià)值。由于年齡大于50歲的人群或多或少存在某些慢性疾患，真正意義上的健康人標(biāo)本來(lái)源較少，存在一定的局限性，有待于后續(xù)研究中加以補(bǔ)充完善。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)≤49歲與≥50歲健康成年人外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細(xì)胞的表達(dá)范圍

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