鐘菲菲，楊慧蘭，樊建勇 ，劉巖 ，高睿迪 ，游韶平

1.廣州軍區(qū) 廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 510010；2.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006

單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）主要包括1型（HSV-1）和2型（HSV-2），兩型病毒堿基有70%的同源性。HSV-1感染面部，潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)；HSV-2主要感染生殖器，并在骶尾神經(jīng)節(jié)建立長期潛伏，是引起生殖器皰疹的主要病原體[1]，潛伏的病毒可因各種非特異性刺激而復(fù)發(fā)，產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀。目前還無特效藥物控制HSV的感染和復(fù)發(fā)，而且其潛伏復(fù)發(fā)的分子機制不明確。HSV-2基因表達過程受到級聯(lián)作用的調(diào)節(jié)，這些病毒基因可被分成三大類，包括立即早期（IE）基因、早期（E）基因和晚期（L）基因。ICP34.5（infected cell protein 34.5）是由晚期基因編碼的神經(jīng)毒性因子，是一種蛋白激酶R抑制劑，對病毒的復(fù)制和致病性起關(guān)鍵作用[2-5]。ICP34.5基因由長重復(fù)序列RL1區(qū)域編碼，與潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（latency-associated transcripts，LAT）反向互補，研究表明其受多種機制調(diào)控。ICP4可促進ICP34.5的表達[6]，HSV-2 LAT編碼的miRNA靶向 ICP34.5 的 5'UTR 和外顯子 1[7-9]，通過調(diào)節(jié)ICP34.5的表達，對病毒的潛伏與復(fù)發(fā)有重要作用。為此，我們構(gòu)建了HSV-2 ICP34.5真核表達質(zhì)粒，確認其能在Vero細胞中表達，并且能降低空質(zhì)粒對Vero細胞的損傷作用，為進一步研究HSV-2 ICP34.5對宿主細胞的生物學(xué)作用和病毒潛伏與復(fù)發(fā)機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）、大腸桿菌TOP10、HSV-2 333標準株、質(zhì)粒pEGFP-C2由本實驗室保存；KOD FX Neo聚合酶購自東洋紡公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；病毒基因組提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒及T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ為NEB公司產(chǎn)品；胰酶Giboc、轉(zhuǎn)染試劑盒Xfect購自Clontech公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；MTT、DMSO購自Sigma公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中HSV-2 333株的LAT ICP34.5序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計PCR引物并添加酶切位點和保護堿基。上游引物為P1（5'-CGGGG?TACCAGGGGCCGTCCGAACGTTTTT-3'），下游引物為 P2（5'-CCCAAGCTTCGTGCATGCGTGCCGAGT?GAA-3'）（上、下游引物分別引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位點）。內(nèi)參β-actin上游引物為P3（5'-CGTAC?CACTGGCATCGTGAT-3'），下游引物為 P4（5'-GT?GTTGGCTGACAGGTCTTTG-3'）。引物由上海 Invit?rogen公司合成。

1.3 Vero細胞的培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下對Vero細胞進行常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。

1.4 病毒的接種及基因組的提取

HSV-2感染Vero細胞后，于顯微鏡下觀察細胞病變，待70%～80%細胞發(fā)生病變時收集細胞，反復(fù)凍融使細胞充分裂解，低速離心后取上清液，用病毒基因組提取試劑盒提取HSV-2基因組。

1.5 ICP34.5片段的PCR擴增

以提取的HSV-2 333株基因組為模板，PCR擴增ICP34.5片段。反應(yīng)體系包括2×PCR緩沖液25 μL，2.0 mmol/L dNTP混合液10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板2 μL，KOD FX Neo聚合酶1.0 μL，補滅菌蒸餾水至50 μL，瞬時離心混勻。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min，然后以98℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2 min行 36個循環(huán)，72℃延伸 10 min后冷卻至4℃。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.6 pEGFP-C2質(zhì)粒和ICP34.5片段的雙酶切及酶切產(chǎn)物回收

將純化的ICP34.5目的片段和pEGFP-C2質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ分別雙酶切，反應(yīng)完畢后0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠，分別回收線性載體和ICP34.5片段，具體回收步驟參照TaKaRa公司的膠回收試劑盒說明書。

1.7 ICP34.5片段與pEGFP-C2質(zhì)粒的連接及轉(zhuǎn)化

ICP34.5片段與pEGFP-C2質(zhì)粒連接反應(yīng)體系包括ICP34.5片段酶切回收產(chǎn)物5 μL、pEGFP-C2質(zhì)粒酶切回收產(chǎn)物 2 μL、T4DNA 連接酶 1.0 μL、T4DNA連接酶緩沖液1 μL，補滅菌蒸餾水至10 μL。瞬時離心后放入PCR儀中于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，均勻涂布于含60 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，靜置30 min，再倒置培養(yǎng)16 h。

1.8 重組質(zhì)粒的提取和鑒定

1.8.1 菌落PCR鑒定 挑取卡那霉素抗性平板上的陽性菌落，進行菌落PCR。除模板外，PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及循環(huán)參數(shù)與擴增ICP34.5片段相同。以HSV-2基因組為模板做陽性對照。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測目標條帶。

1.8.2 重組質(zhì)粒的雙酶切及測序鑒定 選取只能擴增出與陽性對照有一致條帶的重組質(zhì)粒進行KpnⅠ、HindⅢ雙酶切，酶切體系和pEGFP-C2質(zhì)粒雙酶切相同，酶切條件為37℃水浴酶切過夜。酶切產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將同一陽性克隆的菌液送上海英駿公司，用pEGFP-C2質(zhì)粒的通用引物測序。

1.9 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細胞

待6孔板中的細胞生長密度達80%～90%時，用Xfect轉(zhuǎn)染試劑盒分別將 pEGFP-C2/LAT-ICP34.5、pEGFP-C2轉(zhuǎn)染至Vero細胞，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察融合蛋白的表達情況。

1.10 RT-PCR鑒定LATICP34.5在Vero細胞中的表達

轉(zhuǎn)染48 h后，于熒光顯微鏡下觀察Vero細胞中綠色熒光蛋白的表達情況，并收獲細胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，PCR擴增ICP34.5及β-actin。反應(yīng)體系包括2×PCR緩沖液25 μL，2.0 mmol/L dNTP 混合液 10 μL，KOD FX Neo聚合酶1.0 μL，引物P1、P2或P3、P4各2 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 2 μL，加雙蒸水至 50 μL。擴增ICP34.5/β-actin基因的條件為94℃預(yù)變性5 min，然后以98℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸2 min行35個循環(huán)，72℃延伸10 min后冷卻至4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳鑒定。

1.11 重組質(zhì)粒對Vero細胞活性的影響

重組質(zhì)粒pEGFP-ICP34.5及空白質(zhì)粒pEGFPC2轉(zhuǎn)染Vero細胞48 h后，在96孔培養(yǎng)板的每孔中加入20 μL 5 mg/mL MTT，37℃孵育4 h，吸出培養(yǎng)基，每孔加200 μL DMSO溶解結(jié)晶，微型振蕩器上振蕩10 min，用酶標儀（Biocell）測定D490nm值，每個實驗組設(shè)6個復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.12 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果采用SPSS16.0軟件進行分析，各組數(shù)據(jù)均以x±s表示，各組間兩兩比較采用單因素的方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的擴增

以提取的HSV-2 333標準株基因組為模板，擴增出的條帶和目標條帶大小一致（加上酶切位點和保護堿基約1400 bp）（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒pEGFP-C2/ICP34.5的雙酶切和測序鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ雙酶切，可獲得約1400 bp和4.7 kb的條帶（圖2），說明目的片段已插入真核表達載體pEGFP-C2。上海英駿公司測序結(jié)果（略）與GenBank中的HSV-2 333標準株ICP34.5序列一致，表明重組質(zhì)粒pEGFPICP34.5構(gòu)建成功。

2.3 RT-PCR 檢測重組質(zhì)粒 pEGFP-C2/ICP34.5 在Vero細胞中的表達

圖1 目的片段HSV-2 ICP34.5的PCR產(chǎn)物M：Wide range DNA marker；1：ICP34.5擴增產(chǎn)物

轉(zhuǎn)染48 h后，用熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pEGFP-C2/ICP34.5在Vero細胞中有表達，表現(xiàn)為強綠色熒光。RT-PCR結(jié)果表明，只有從轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C2/ICP34.5的Vero細胞中提取的RNA才能擴增出ICP34.5基因，而β-actin（452 bp）在轉(zhuǎn)染了2種質(zhì)粒的Vero細胞中所提取的RNA中均可擴增出來（圖3）。

2.4 重組質(zhì)粒表達的綠色熒光在Vero細胞中的分布特點

轉(zhuǎn)染48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的分布情況，可見重組質(zhì)粒pEGFP-ICP34.5表達的綠色熒光（圖4A）主要集中在細胞核，大多數(shù)為圓形，形態(tài)規(guī)則，分布均勻；而空質(zhì)粒pEGFP-C2表達的綠色熒光（圖4B）在細胞核和細胞質(zhì)中都有分布，且不規(guī)則，與重組質(zhì)粒組相比，熒光強度較弱。

2.5 MTT法測重組質(zhì)粒對Vero細胞活性的影響

MTT法測定的D490nm值與細胞存活量成正比。轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒的細胞D490nm值都低于正常對照組，說明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對細胞有一定的損傷作用；轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒 pEGFP-ICP34.5 的 Vero細 胞 D490nm值（1.744±0.121）明顯高于空質(zhì)粒pEGFP-C2組（1.523±0.117）（P＜0.05），與正常對照組（1.781±0.132）（P＜0.05）無顯著差異，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與正常對照組差異顯著（P＜0.05），說明HSV-2 ICP34.5能降低空質(zhì)粒對細胞的損傷作用（圖5）。

圖2 重組質(zhì)粒pEGFP-ICP34.5的酶切M：Wide range DNA marker；1：KpnⅠ酶切pEGFP-ICP34.5；2：KpnⅠ、HindⅢ雙酶切pEGFP-ICP34.5

圖3 RT-PCR鑒定HSV-2 ICP34.5基因在Vero細胞中的表達M：Wide range DNA marker；1：陰性對照；2：轉(zhuǎn)染pEGFP-C2的Vero細胞組β-actin內(nèi)參條帶；3：轉(zhuǎn)染pEGFP2-C2的Vero細胞組無目的片段；4：轉(zhuǎn)染pEGFP-C2/ICP34.5的Vero細胞組的ICP34.5片段；5：轉(zhuǎn)染pEGFP-C2/ICP34.5的Vero細胞組β-actin內(nèi)參條帶

圖4 質(zhì)粒表達的綠色熒光在Vero細胞中的分布特點（200×）A：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒48 h后Vero細胞中的熒光表達情況；B：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒48 h后Vero細胞中的熒光表達情況

圖5 MTT法檢測重組質(zhì)粒對Vero細胞活性的影響A：轉(zhuǎn)染pEGFP-ICP34.5的Vero細胞；B：轉(zhuǎn)染pEGFP-C2的Vero細胞；C：正常Vero細胞

3 討論

當病毒感染細胞時，病毒對細胞各個系統(tǒng)的影響從不同的角度形成了一個復(fù)雜的交互作用網(wǎng)絡(luò)，使細胞的各個環(huán)節(jié)都陷入病毒的控制之中，使病毒在一定的細胞狀態(tài)下獲得最大可能的生存機會。同其他病毒一樣，HSV也進化出了一系列逃避宿主抗病毒的策略[10]，其中很重要的一點是ICP34.5抵御宿主的抗病毒作用，它可以抑制1型干擾素的產(chǎn)生及其效應(yīng)，為病毒基因組在細胞內(nèi)的穩(wěn)定存在創(chuàng)造條件，促進HSV在細胞內(nèi)的潛伏[11-12]。

HSV-1 ICP34.5是由γ134.5基因編碼的病毒毒力蛋白。其C端結(jié)構(gòu)與GADD相應(yīng)結(jié)構(gòu)域同源，發(fā)揮磷酸輔助因子的功能，能結(jié)合蛋白磷酸酶，使其功能逆轉(zhuǎn)，從而對CIF-2a去磷酸化，這可使由蛋白激酶R激活而導(dǎo)致的蛋白合成終止作用被去除。另外，其N端能通過RNase形成的鍵而結(jié)合Us11基因。在HSV-1感染的細胞中，dsRNA依賴性的蛋白激酶PKR會被激活，然后將elF2的亞基磷酸化。這是宿主細胞的抗病毒機制，會造成宿主細胞蛋白合成的停止，從而抑制病毒的復(fù)制。為逃避宿主細胞的這種抗病毒機制，ICP34.5會與細胞中的蛋白磷酸酶1及elF2a結(jié)合，形成一種大分子的復(fù)合物，并使elF2a脫磷酸化。因此，ICP34.5可以重新開啟宿主細胞蛋白合成，同時幫助病毒完成自身的蛋白合成。

自噬在對抗病毒感染、避免病毒逃逸中有重要作用。自噬基因beclin-1的表達為宿主自噬作用所必需，有文獻報道，ICP34.5缺失突變株病毒粒子不能正常地從細胞核中釋放，同時喪失了同beclin-1結(jié)合的能力，從而無法破壞beclin-1介導(dǎo)的宿主抗病毒自噬作用[13-15]，病毒復(fù)制所必需的毒力因子ICP34.5有可能是通過靶標宿主自噬關(guān)鍵蛋白Be?clin-1來發(fā)揮毒力作用的。通過遺傳學(xué)手段阻斷PKR（自噬誘導(dǎo)信號分子），可以使自噬抑制缺陷的病毒毒力得到回復(fù)，進一步說明自噬在抵抗病毒感染中起重要作用。

但是，HSV-1和HSV-2的致病作用存在明顯的差異，通常HSV-2比HSV-1在多種動物模型中具有更強的神經(jīng)毒力。與HSV-1 ICP34.5同系物不同的是，HSV-2 ICP34.5的編碼基因是一個經(jīng)過選擇性剪接并含有一個內(nèi)含子的基因[16]。另外，HSV-1 ICP34.5與TBK1和Beclin-1結(jié)合等重要功能與其N端有關(guān)，而在HSV-2 ICP34.5中卻未證實與N端有關(guān)。HSV-1和HSV-2 ICP34.5編碼基因具有較高的同源性（約80%），特別是在逆轉(zhuǎn)eIF2a磷酸化過程中起重要作用的C端具有更高的同源性，而國內(nèi)外對HSV-2 ICP34.5的研究鮮有報道。在本實驗中，我們構(gòu)建了HSV-2 ICP34.5真核表達載體，實現(xiàn)了其在Vero細胞中的表達，為后續(xù)研究ICP34.5在HSV-2潛伏與復(fù)發(fā)中的作用奠定了實驗基礎(chǔ)。

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