鐘菲菲，楊慧蘭，樊建勇 ，劉巖 ，高睿迪 ，游韶平

1.廣州軍區(qū) 廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 510010；2.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006

單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）主要包括1型（HSV-1）和2型（HSV-2），兩型病毒堿基有70%的同源性。HSV-1感染面部，潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)；HSV-2主要感染生殖器，并在骶尾神經(jīng)節(jié)建立長(zhǎng)期潛伏，是引起生殖器皰疹的主要病原體[1]，潛伏的病毒可因各種非特異性刺激而復(fù)發(fā)，產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀。目前還無(wú)特效藥物控制HSV的感染和復(fù)發(fā)，而且其潛伏復(fù)發(fā)的分子機(jī)制不明確。HSV-2基因表達(dá)過(guò)程受到級(jí)聯(lián)作用的調(diào)節(jié)，這些病毒基因可被分成三大類，包括立即早期（IE）基因、早期（E）基因和晚期（L）基因。ICP34.5（infected cell protein 34.5）是由晚期基因編碼的神經(jīng)毒性因子，是一種蛋白激酶R抑制劑，對(duì)病毒的復(fù)制和致病性起關(guān)鍵作用[2-5]。ICP34.5基因由長(zhǎng)重復(fù)序列RL1區(qū)域編碼，與潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（latency-associated transcripts，LAT）反向互補(bǔ)，研究表明其受多種機(jī)制調(diào)控。ICP4可促進(jìn)ICP34.5的表達(dá)[6]，HSV-2 LAT編碼的miRNA靶向 ICP34.5 的 5'UTR 和外顯子 1[7-9]，通過(guò)調(diào)節(jié)ICP34.5的表達(dá)，對(duì)病毒的潛伏與復(fù)發(fā)有重要作用。為此，我們構(gòu)建了HSV-2 ICP34.5真核表達(dá)質(zhì)粒，確認(rèn)其能在Vero細(xì)胞中表達(dá)，并且能降低空質(zhì)粒對(duì)Vero細(xì)胞的損傷作用，為進(jìn)一步研究HSV-2 ICP34.5對(duì)宿主細(xì)胞的生物學(xué)作用和病毒潛伏與復(fù)發(fā)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）、大腸桿菌TOP10、HSV-2 333標(biāo)準(zhǔn)株、質(zhì)粒pEGFP-C2由本實(shí)驗(yàn)室保存；KOD FX Neo聚合酶購(gòu)自東洋紡公司；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；病毒基因組提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒及T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ為NEB公司產(chǎn)品；胰酶Giboc、轉(zhuǎn)染試劑盒Xfect購(gòu)自Clontech公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司；MTT、DMSO購(gòu)自Sigma公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中HSV-2 333株的LAT ICP34.5序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)PCR引物并添加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。上游引物為P1（5'-CGGGG?TACCAGGGGCCGTCCGAACGTTTTT-3'），下游引物為 P2（5'-CCCAAGCTTCGTGCATGCGTGCCGAGT?GAA-3'）（上、下游引物分別引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)）。內(nèi)參β-actin上游引物為P3（5'-CGTAC?CACTGGCATCGTGAT-3'），下游引物為 P4（5'-GT?GTTGGCTGACAGGTCTTTG-3'）。引物由上海 Invit?rogen公司合成。

1.3 Vero細(xì)胞的培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下對(duì)Vero細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。

1.4 病毒的接種及基因組的提取

HSV-2感染Vero細(xì)胞后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，待70%～80%細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)收集細(xì)胞，反復(fù)凍融使細(xì)胞充分裂解，低速離心后取上清液，用病毒基因組提取試劑盒提取HSV-2基因組。

1.5 ICP34.5片段的PCR擴(kuò)增

以提取的HSV-2 333株基因組為模板，PCR擴(kuò)增ICP34.5片段。反應(yīng)體系包括2×PCR緩沖液25 μL，2.0 mmol/L dNTP混合液10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板2 μL，KOD FX Neo聚合酶1.0 μL，補(bǔ)滅菌蒸餾水至50 μL，瞬時(shí)離心混勻。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min，然后以98℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2 min行 36個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10 min后冷卻至4℃。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.6 pEGFP-C2質(zhì)粒和ICP34.5片段的雙酶切及酶切產(chǎn)物回收

將純化的ICP34.5目的片段和pEGFP-C2質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ分別雙酶切，反應(yīng)完畢后0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠，分別回收線性載體和ICP34.5片段，具體回收步驟參照TaKaRa公司的膠回收試劑盒說(shuō)明書。

1.7 ICP34.5片段與pEGFP-C2質(zhì)粒的連接及轉(zhuǎn)化

ICP34.5片段與pEGFP-C2質(zhì)粒連接反應(yīng)體系包括ICP34.5片段酶切回收產(chǎn)物5 μL、pEGFP-C2質(zhì)粒酶切回收產(chǎn)物 2 μL、T4DNA 連接酶 1.0 μL、T4DNA連接酶緩沖液1 μL，補(bǔ)滅菌蒸餾水至10 μL。瞬時(shí)離心后放入PCR儀中于16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含60 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，靜置30 min，再倒置培養(yǎng)16 h。

1.8 重組質(zhì)粒的提取和鑒定

1.8.1 菌落PCR鑒定 挑取卡那霉素抗性平板上的陽(yáng)性菌落，進(jìn)行菌落PCR。除模板外，PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及循環(huán)參數(shù)與擴(kuò)增ICP34.5片段相同。以HSV-2基因組為模板做陽(yáng)性對(duì)照。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶。

1.8.2 重組質(zhì)粒的雙酶切及測(cè)序鑒定 選取只能擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照有一致條帶的重組質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ、HindⅢ雙酶切，酶切體系和pEGFP-C2質(zhì)粒雙酶切相同，酶切條件為37℃水浴酶切過(guò)夜。酶切產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將同一陽(yáng)性克隆的菌液送上海英駿公司，用pEGFP-C2質(zhì)粒的通用引物測(cè)序。

1.9 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞

待6孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%時(shí)，用Xfect轉(zhuǎn)染試劑盒分別將 pEGFP-C2/LAT-ICP34.5、pEGFP-C2轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書。48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá)情況。

1.10 RT-PCR鑒定LATICP34.5在Vero細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后，于熒光顯微鏡下觀察Vero細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，并收獲細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，PCR擴(kuò)增ICP34.5及β-actin。反應(yīng)體系包括2×PCR緩沖液25 μL，2.0 mmol/L dNTP 混合液 10 μL，KOD FX Neo聚合酶1.0 μL，引物P1、P2或P3、P4各2 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 2 μL，加雙蒸水至 50 μL。擴(kuò)增ICP34.5/β-actin基因的條件為94℃預(yù)變性5 min，然后以98℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸2 min行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min后冷卻至4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳鑒定。

1.11 重組質(zhì)粒對(duì)Vero細(xì)胞活性的影響

重組質(zhì)粒pEGFP-ICP34.5及空白質(zhì)粒pEGFPC2轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞48 h后，在96孔培養(yǎng)板的每孔中加入20 μL 5 mg/mL MTT，37℃孵育4 h，吸出培養(yǎng)基，每孔加200 μL DMSO溶解結(jié)晶，微型振蕩器上振蕩10 min，用酶標(biāo)儀（Biocell）測(cè)定D490nm值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)均以x±s表示，各組間兩兩比較采用單因素的方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的擴(kuò)增

以提取的HSV-2 333標(biāo)準(zhǔn)株基因組為模板，擴(kuò)增出的條帶和目標(biāo)條帶大小一致（加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基約1400 bp）（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒pEGFP-C2/ICP34.5的雙酶切和測(cè)序鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ雙酶切，可獲得約1400 bp和4.7 kb的條帶（圖2），說(shuō)明目的片段已插入真核表達(dá)載體pEGFP-C2。上海英駿公司測(cè)序結(jié)果（略）與GenBank中的HSV-2 333標(biāo)準(zhǔn)株ICP34.5序列一致，表明重組質(zhì)粒pEGFPICP34.5構(gòu)建成功。

2.3 RT-PCR 檢測(cè)重組質(zhì)粒 pEGFP-C2/ICP34.5 在Vero細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 目的片段HSV-2 ICP34.5的PCR產(chǎn)物M：Wide range DNA marker；1：ICP34.5擴(kuò)增產(chǎn)物

轉(zhuǎn)染48 h后，用熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pEGFP-C2/ICP34.5在Vero細(xì)胞中有表達(dá)，表現(xiàn)為強(qiáng)綠色熒光。RT-PCR結(jié)果表明，只有從轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C2/ICP34.5的Vero細(xì)胞中提取的RNA才能擴(kuò)增出ICP34.5基因，而β-actin（452 bp）在轉(zhuǎn)染了2種質(zhì)粒的Vero細(xì)胞中所提取的RNA中均可擴(kuò)增出來(lái)（圖3）。

2.4 重組質(zhì)粒表達(dá)的綠色熒光在Vero細(xì)胞中的分布特點(diǎn)

轉(zhuǎn)染48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的分布情況，可見重組質(zhì)粒pEGFP-ICP34.5表達(dá)的綠色熒光（圖4A）主要集中在細(xì)胞核，大多數(shù)為圓形，形態(tài)規(guī)則，分布均勻；而空質(zhì)粒pEGFP-C2表達(dá)的綠色熒光（圖4B）在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布，且不規(guī)則，與重組質(zhì)粒組相比，熒光強(qiáng)度較弱。

2.5 MTT法測(cè)重組質(zhì)粒對(duì)Vero細(xì)胞活性的影響

MTT法測(cè)定的D490nm值與細(xì)胞存活量成正比。轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒的細(xì)胞D490nm值都低于正常對(duì)照組，說(shuō)明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞有一定的損傷作用；轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒 pEGFP-ICP34.5 的 Vero細(xì) 胞 D490nm值（1.744±0.121）明顯高于空質(zhì)粒pEGFP-C2組（1.523±0.117）（P＜0.05），與正常對(duì)照組（1.781±0.132）（P＜0.05）無(wú)顯著差異，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與正常對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明HSV-2 ICP34.5能降低空質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的損傷作用（圖5）。

圖2 重組質(zhì)粒pEGFP-ICP34.5的酶切M：Wide range DNA marker；1：KpnⅠ酶切pEGFP-ICP34.5；2：KpnⅠ、HindⅢ雙酶切pEGFP-ICP34.5

圖3 RT-PCR鑒定HSV-2 ICP34.5基因在Vero細(xì)胞中的表達(dá)M：Wide range DNA marker；1：陰性對(duì)照；2：轉(zhuǎn)染pEGFP-C2的Vero細(xì)胞組β-actin內(nèi)參條帶；3：轉(zhuǎn)染pEGFP2-C2的Vero細(xì)胞組無(wú)目的片段；4：轉(zhuǎn)染pEGFP-C2/ICP34.5的Vero細(xì)胞組的ICP34.5片段；5：轉(zhuǎn)染pEGFP-C2/ICP34.5的Vero細(xì)胞組β-actin內(nèi)參條帶

圖4 質(zhì)粒表達(dá)的綠色熒光在Vero細(xì)胞中的分布特點(diǎn)（200×）A：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒48 h后Vero細(xì)胞中的熒光表達(dá)情況；B：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒48 h后Vero細(xì)胞中的熒光表達(dá)情況

圖5 MTT法檢測(cè)重組質(zhì)粒對(duì)Vero細(xì)胞活性的影響A：轉(zhuǎn)染pEGFP-ICP34.5的Vero細(xì)胞；B：轉(zhuǎn)染pEGFP-C2的Vero細(xì)胞；C：正常Vero細(xì)胞

3 討論

當(dāng)病毒感染細(xì)胞時(shí)，病毒對(duì)細(xì)胞各個(gè)系統(tǒng)的影響從不同的角度形成了一個(gè)復(fù)雜的交互作用網(wǎng)絡(luò)，使細(xì)胞的各個(gè)環(huán)節(jié)都陷入病毒的控制之中，使病毒在一定的細(xì)胞狀態(tài)下獲得最大可能的生存機(jī)會(huì)。同其他病毒一樣，HSV也進(jìn)化出了一系列逃避宿主抗病毒的策略[10]，其中很重要的一點(diǎn)是ICP34.5抵御宿主的抗病毒作用，它可以抑制1型干擾素的產(chǎn)生及其效應(yīng)，為病毒基因組在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定存在創(chuàng)造條件，促進(jìn)HSV在細(xì)胞內(nèi)的潛伏[11-12]。

HSV-1 ICP34.5是由γ134.5基因編碼的病毒毒力蛋白。其C端結(jié)構(gòu)與GADD相應(yīng)結(jié)構(gòu)域同源，發(fā)揮磷酸輔助因子的功能，能結(jié)合蛋白磷酸酶，使其功能逆轉(zhuǎn)，從而對(duì)CIF-2a去磷酸化，這可使由蛋白激酶R激活而導(dǎo)致的蛋白合成終止作用被去除。另外，其N端能通過(guò)RNase形成的鍵而結(jié)合Us11基因。在HSV-1感染的細(xì)胞中，dsRNA依賴性的蛋白激酶PKR會(huì)被激活，然后將elF2的亞基磷酸化。這是宿主細(xì)胞的抗病毒機(jī)制，會(huì)造成宿主細(xì)胞蛋白合成的停止，從而抑制病毒的復(fù)制。為逃避宿主細(xì)胞的這種抗病毒機(jī)制，ICP34.5會(huì)與細(xì)胞中的蛋白磷酸酶1及elF2a結(jié)合，形成一種大分子的復(fù)合物，并使elF2a脫磷酸化。因此，ICP34.5可以重新開啟宿主細(xì)胞蛋白合成，同時(shí)幫助病毒完成自身的蛋白合成。

自噬在對(duì)抗病毒感染、避免病毒逃逸中有重要作用。自噬基因beclin-1的表達(dá)為宿主自噬作用所必需，有文獻(xiàn)報(bào)道，ICP34.5缺失突變株病毒粒子不能正常地從細(xì)胞核中釋放，同時(shí)喪失了同beclin-1結(jié)合的能力，從而無(wú)法破壞beclin-1介導(dǎo)的宿主抗病毒自噬作用[13-15]，病毒復(fù)制所必需的毒力因子ICP34.5有可能是通過(guò)靶標(biāo)宿主自噬關(guān)鍵蛋白Be?clin-1來(lái)發(fā)揮毒力作用的。通過(guò)遺傳學(xué)手段阻斷PKR（自噬誘導(dǎo)信號(hào)分子），可以使自噬抑制缺陷的病毒毒力得到回復(fù)，進(jìn)一步說(shuō)明自噬在抵抗病毒感染中起重要作用。

但是，HSV-1和HSV-2的致病作用存在明顯的差異，通常HSV-2比HSV-1在多種動(dòng)物模型中具有更強(qiáng)的神經(jīng)毒力。與HSV-1 ICP34.5同系物不同的是，HSV-2 ICP34.5的編碼基因是一個(gè)經(jīng)過(guò)選擇性剪接并含有一個(gè)內(nèi)含子的基因[16]。另外，HSV-1 ICP34.5與TBK1和Beclin-1結(jié)合等重要功能與其N端有關(guān)，而在HSV-2 ICP34.5中卻未證實(shí)與N端有關(guān)。HSV-1和HSV-2 ICP34.5編碼基因具有較高的同源性（約80%），特別是在逆轉(zhuǎn)eIF2a磷酸化過(guò)程中起重要作用的C端具有更高的同源性，而國(guó)內(nèi)外對(duì)HSV-2 ICP34.5的研究鮮有報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了HSV-2 ICP34.5真核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了其在Vero細(xì)胞中的表達(dá)，為后續(xù)研究ICP34.5在HSV-2潛伏與復(fù)發(fā)中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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