潘欣，曾思良，宋維，余秀珍，張俊，張鴻聲，方偉，陳敏，廖萬清

1.上?？【S寓醫(yī)館，上海 200433；2.上海市中原中學(xué)，上海 200438；3.同濟大學(xué)，上海 200433；4.第二軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433

左旋天門冬酰胺酶（L-asparaginase，L-ASNase）是治療淋巴細(xì)胞白血病等惡性血液病的重要藥物之一[1]。某些類型的腫瘤細(xì)胞表達(dá)的L-天門冬酰胺合成酶（L-asparagines synthetase，L-AS）活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常細(xì)胞，難以在胞內(nèi)將氨或L-Glu的酰胺基在ATP和Mg2+存在時有效地轉(zhuǎn)移至L-Asp的β羧基生成L-Asn，因而迫使這類腫瘤細(xì)胞利用外源Asn以維持胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成與細(xì)胞增殖[2]；而L-ASNase可水解Asn（必需氨基酸）為Asp和氨，由于人體內(nèi)不存在天然L-ASNase，若向患者體內(nèi)引入L-ASNase，全身性降解Asn，可使這類腫瘤細(xì)胞因L-AS活性低，不能獨立合成Asn，造成Asn饑餓，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的生物合成紊亂而死亡，達(dá)到在不影響正常細(xì)胞生理功能的前提下殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[3]。但L-ASNase是異源酶，免疫原性易致人體產(chǎn)生滅活酶的抗體，且不良反應(yīng)較大，因此亟待研發(fā)低免疫原性L-ASNase給藥方案。目前有臨床試驗將L-ASNase用急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）復(fù)發(fā)患者的自體紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）封裝后再自體回輸[4]，該給藥方案在理論上可消弱L-ASNase的抗原性，阻礙治療性酶被宿主蛋白水解酶降解；在臨床上也觀察到可降低ALL復(fù)發(fā)患者抗-L-ASNase抗體的形成，明顯減弱過敏反應(yīng)、凝血功能障礙和肝功能失常，改善了病患的健康狀況。然而，這種用非基因修飾方法將藥物封裝進RBC的方案或多或少均改變了RBC的形態(tài)和細(xì)胞膜特征（如易碎、變形性下降等），增加了機體清除這部分RBC的機率[5]。由于造血干細(xì)胞在體外向紅細(xì)胞定向分化需時較長，若向造血干細(xì)胞中引入L-ASNase基因，可以使其在定向分化過程中開始表達(dá)L-ASNase，克服紅細(xì)胞生命力短暫、難以在體外長期存活之弱點，延長藥物時效，為尋找合適的分化期導(dǎo)入體內(nèi)遏制ALL奠定基礎(chǔ)。

在本研究中，我們用攜帶L-ASNase的紅細(xì)胞特異性重組慢病毒載體系統(tǒng)包裝出自滅活（self-inacti?vation，SIN）重組慢病毒，以小鼠紅白血?。╩urine erythroleukemia，MEL）細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)可向紅細(xì)胞終端分化為模型，探討重組慢病毒感染后MEL細(xì)胞在分化過程中表達(dá)L-ASNase目的基因，延長藥物時效的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎（human embryonic kidney，HEK）293T細(xì)胞、MEL細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3和穩(wěn)定表達(dá)對照病毒RRL-sEF1α-GFPLuc的NIH/3T3細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞為本課題組保存；大腸桿菌DH5α、包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMTHS4-IVS2（-）、RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry和RRL-sEF1α-2A-mCherry為本課題組保存。

各種限制性內(nèi)切酶為New England Biolabs公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、AIM-V XIVIVO-5培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）為Invitrogen Gibco公司產(chǎn)品，O6-芐基鳥嘌呤（O6-benzylguanine，BG）、雙氯乙亞硝脲［1，3-bis（2-chloroethyl）-1-nitrosourea，BCNU；商品名為卡莫司汀］、六亞甲基二乙酰胺（N，N'-hexameth?ylene bisacetamide，HMBA）、聚乙烯亞胺（polyethyl?enimine，PEI）和聚凝胺（polybrene）為Sigma公司產(chǎn)品；兔抗大腸桿菌L-ASNase多抗為GeneTex公司產(chǎn)品；小鼠抗mCherry單克隆抗體為EarthOx公司產(chǎn)品；青霉素和鏈霉素溶液（以下簡稱雙抗）為Hyclone公司產(chǎn)品；InstaGene Matrix為Bio-Rad公司產(chǎn)品；熒光定量（TaqMan）快速PCR混合試劑盒（2×）為ABI公司產(chǎn)品；哺乳動物細(xì)胞總蛋白抽提試劑（mammali?an protein extraction reagent，M-PER）、2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和鍵合了Alexa 488的山羊抗兔IgG為Affinity Biologicals公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)品LASNase為日本協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社產(chǎn)品。

1.2 慢病毒轉(zhuǎn)移載體的設(shè)計和制備

RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMTHS4-IVS2（-）的結(jié)構(gòu)（圖1）中，為方便監(jiān)測目的基因的表達(dá)，將編碼L-ASNase的cDNA通過2A聯(lián)接體技術(shù)與編碼紅色單體熒光蛋白mCherry的cDNA連接，同受β-珠蛋白啟動子（promoter，P）、β-珠蛋白3'端增強子（enhancer，E）和β-珠蛋白位點控制區(qū)（locus control regions，LCR）DNaseⅠ高敏位點（hypersensi?tive site，HS）中具有較強增強子活性的HS2和具有染色質(zhì)開放活性的HS3調(diào)控[6]。2A為源于一點褐翅蛾病毒的2A短肽（Thosea asigna virus 2A，T2A），當(dāng)核糖體快速處理2A肽C端甘氨酰-脯氨酰之間的肽鍵合成時，會引起2A肽與其下游肽之間發(fā)生自裂解，該序列允許在同一讀框中通過2A的自裂解表達(dá)多種非融合的獨立的目的蛋白[7]。位于載體3'端可以非組織特異性地表達(dá)甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶變異體（methylguanine methyltransferase，MGMT）P140K的耐藥基因由人磷酸甘油酸激酶啟動子（phospho?glycerate kinase promoter，PGK-P）控制，這樣可以通過使用化療藥物BG和BCNU富集基因修飾的陽性細(xì)胞，并確保在篩選富集細(xì)胞的過程中目的基因受到有效控制，不會表達(dá)。為提高載體制備的有效性，增加慢病毒滴度和轉(zhuǎn)染率，刪除了慢病毒載體LCR區(qū)域中功能待定的HS1和有增強子活性的HS4，同時刪除了β-珠蛋白中具內(nèi)含子增強子活性的第 2個內(nèi)含子（intervening sequence 2，IVS2）[8]。由于LCR主要的功能是激活β-珠蛋白基因簇，限制珠蛋白基因僅在紅系細(xì)胞中表達(dá)，確保受調(diào)控基因在發(fā)育或分化過程中以一定的時序和模式正確表達(dá)，因而賦予該載體具有紅系組織特異性[9]。

為快速測定慢病毒載體所攜帶的目的基因可否在靶細(xì)胞中表達(dá)，我們還構(gòu)建了非組織特異性慢病毒載體 RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry，利用2A聯(lián)體技術(shù)將L-ASNase基因和mCherry報告基因置于短的延長因子 1α（short elongation factor 1α，sEF1α；刪除了第一內(nèi)含子）啟動子控制下，在聯(lián)體基因的3'端增加了土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional reg?ulatory element），以提升mRNA的polyA加尾效率。為驗證2A是否影響下游報告基因的正常表達(dá)，還構(gòu)建了僅表達(dá)2A-mCherry的非組織特異性慢病毒載體RRL-sEF1α-2A-mCherry。

應(yīng)用不同的限制性內(nèi)切酶及DNA重組技術(shù)構(gòu)建上述慢病毒轉(zhuǎn)移載體。

1.3 重組慢病毒包裝

用三質(zhì)粒系統(tǒng)瞬時轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞制備重組慢病毒顆粒[9]。當(dāng)HEK 293T細(xì)胞在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中生長達(dá)80%～90%匯合時，棄含雙抗（青霉素終濃度為50 U/mL，鏈霉素終濃度為50 mg/mL）的完全DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS），將PEI轉(zhuǎn)染三質(zhì)?；鞈乙海ㄙ|(zhì)?？偭繛? μg/皿，pMD2.G、psPAX2和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒按1∶2∶3的質(zhì)量比例混懸于1 mL無血清無抗生素 DMEM 中，再加 24 μL pH7.0 的 1 μg/μL PEI）加至用9 mL含10%FBS的完全培養(yǎng)基覆蓋的HEK 293T細(xì)胞中，24 h后棄上清，換預(yù)熱的新鮮完全培養(yǎng)基，分別于48和96 h收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒液，500 r/min離心10 min除去脫落的細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片，用0.45 μm的濾器過濾上清，濾液經(jīng)8500 r/min離心12 h濃縮病毒顆粒，用無血清的AIM-V XIVIVO-5培養(yǎng)基重懸病毒顆粒，分裝至凍存管，-80℃保存?zhèn)溆谩⒅亟M慢病毒以載體名稱命名。

1.4 重組慢病毒滴度測定

用終質(zhì)量濃度為8 μg/mL的Polybrene介導(dǎo)重組病毒顆粒轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3，培養(yǎng)7 d后用InstaGene Matrix抽提基因組DNA。以穩(wěn)定表達(dá)對照病毒RRL-sEF1α-GFPLuc的NIH/3T3細(xì)胞基因組為對照，2套引物-探針聯(lián)合使用，采用多重TaqMan PCR檢測病毒滴度[9]。慢病毒序列檢測所用正向引物為GAG-F（5'-GGAGCTAGAACGATTC GCAGTTA-3'），反向引物為 GAG-R（5'-GGTTGTA GCTGTCCCAGTATTTGTC-3'），探針為 GAG-P（5'-［FAM］ACAGCCTTCTGATGTTTCTAACAGGCCAGG［TAMRA］-3'）。小鼠β-actin（簡稱BAC）為內(nèi)源性對照，正向引物為BAC-F（5'-GGCACCACACCTTC TACAATG-3'），反向引物為 BAC-R（5'-GGGGTGT TGAAGGTCTAAAC-3'），探針為 BAC-P（5'-［HEX］TGTGGCCCCTGAGGAGCACCC［BHQ1］-3'）。 用Applied Biosystems公司的7500 PCR儀，每個定量PCR反應(yīng)中基因組DNA共使用100 ng（1×TaqMan快速PCR混合試劑，500 nmol/L基因特異性正、反向引物和探針），每組反應(yīng)設(shè)3個重復(fù)。在SDS 2.1軟件中設(shè)置定量PCR反應(yīng)程序為95℃ 10 min熱啟動；PCR反應(yīng)94℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)[10]。

已知穩(wěn)定表達(dá)對照病毒RRL-sEF1α-GFPLuc的NIH/3T3每個細(xì)胞中有1個慢病毒載體拷貝數(shù)（vector copy number，VCN），其基因組DNA用未感染慢病毒的NIH/3T3細(xì)胞基因組DNA進行1/5系列稀釋后，通過定量PCR獲得慢病毒轉(zhuǎn)染的VCN回歸曲線。根據(jù)該曲線，計算未知樣品中感染重組慢病毒GAG基因的拷貝數(shù)。病毒滴度（titer，T）計算公式：T（U/mL）=VCN×稀釋率的倒數(shù)×起始細(xì)胞數(shù)[11]。

1.5 免疫染色

人宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板的無菌蓋玻片上，非組織特異性重組慢病毒RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry按 1∶10稀釋感染 HeLa細(xì)胞，24 h后換新鮮完全培養(yǎng)基，96 h后用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗后用含0.5%Triton X-100的PBS透化30 min，用Image-iT FX信號增強劑封閉30 min，加入1∶500稀釋的兔抗大腸桿菌L-ASNase多抗室溫孵育2 h，PBS洗后，加入1∶1000稀釋的鍵合了Alexa 488的山羊抗兔IgG，室溫避光孵育60 min，PBS洗后，晾干的蓋玻片用抗褪色金牌介質(zhì)在載玻片上裝片，指甲油封片。

1.6 BG/BCNU篩選與報告基因檢測

為有效富集陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，MEL細(xì)胞經(jīng)重組慢病毒感染后，先與50 μmol/L BG孵育1 h，再加50 μmol/L BCNU于37℃共孵育1 h，1 h后換預(yù)熱的不含藥物的新鮮培養(yǎng)基，以后每3 d換1次培養(yǎng)液，移除懸浮細(xì)胞，篩選14 d后進行后續(xù)實驗。

分別在指定時間收獲1×105經(jīng)篩選富集的感染非組織特異性重組慢病毒的MEL細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測mCherry紅色熒光強度，以評估BCNU有效篩選情況。

用熒光顯微鏡監(jiān)測感染組織特異性重組慢病毒的MEL細(xì)胞分別在5 mmol/L HMBA誘導(dǎo)前、后報告基因mCherry的表達(dá)情況，以評估調(diào)控因子對目的基因組織特異性表達(dá)的控制效果。

同時用流式細(xì)胞儀監(jiān)測感染或未感染重組慢病毒的MEL細(xì)胞經(jīng)5 mmol/L HMBA誘導(dǎo)前、后報告基因mCherry的表達(dá)情況，以評估MEL細(xì)胞向紅系終端分化過程中攜帶目的蛋白的能力。

1.7 免疫印跡

在指定時間收獲感染或未感染或誘導(dǎo)的MEL細(xì)胞，用哺乳動物細(xì)胞總蛋白抽提試劑抽提細(xì)胞總蛋白，用Bradford法進行蛋白定量，取等量總蛋白（每孔60 μg/20 μL）進行12%SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下用50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，膜與1∶1000稀釋的一抗于4℃孵育過夜，洗膜后與HRP標(biāo)記的二抗于37℃溫育1 h，ECL顯色，獲取圖像。檢測L-ASNase印跡膜使用的一抗為兔抗大腸桿菌L-ASNase多克隆抗體，二抗為山羊抗兔IgG；檢測mCherry的印跡膜使用的一抗為鼠抗mCherry單克隆抗體，二抗為兔抗鼠IgG；檢測看家基因GAPDH表達(dá)的印跡膜使用的一抗為鼠抗GAPDH單克隆抗體，二抗為兔抗鼠IgG。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建和鑒定

為增加慢病毒滴度和轉(zhuǎn)染率，在不影響重組蛋白表達(dá)的組織特異性和預(yù)期可以維持目的基因需要的表達(dá)水平的基礎(chǔ)上，采用優(yōu)化的基因調(diào)控因子，即選擇較短的β-珠蛋白啟動子，并去除β-珠蛋白IVS2和LCR中的HS1和HS4，構(gòu)建了結(jié)構(gòu)正確的含目的基因及報告基因的紅細(xì)胞組織特異性的慢病毒載體RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）、非組織特異性慢病毒載體RRL-sEF1α-LASNase-2A-mCherry和 RRL-sEF1α-2A-mCherry（圖1），并經(jīng)限制性酶譜鑒定和測序分析驗證。

2.2 重組慢病毒滴度檢測

重組慢病毒載體分別與包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G經(jīng)PEI介導(dǎo)瞬時共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得重組慢病毒，經(jīng)8500 r/min離心濃縮，用多重TaqMan PCR測得重組慢病毒RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）的滴度為（4.21±0.58）×107U/mL，RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry的滴度為（7.6±2.5）×106U/mL，RRL-sEF1α-2A-mCherry的滴度為（2.05±0.67）×107U/mL。

2.3 重 組 慢 病 毒 RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry在HeLa細(xì)胞中表達(dá)攜帶基因的檢測

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

為快速鑒定采用2A聯(lián)體技術(shù)可實現(xiàn)重組慢病毒在感染細(xì)胞中同時表達(dá)目的基因及報告基因，將非組織特異性重組慢病毒RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry按1∶10稀釋后感染HeLa細(xì)胞。在激發(fā)光為587 nm、發(fā)射譜為610 nm的熒光顯微鏡下檢測到mCherry報告基因主要在感染細(xì)胞核中表達(dá)（紅色熒光）（圖2B），L-ASNase基因主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，L-ASNase可與多抗結(jié)合，用鍵合了Alex 488的二抗可顯示綠色熒光（圖2C），提示mCherry與LASNase表達(dá)時自2A處自裂解，各自獨立成像，無共定位（圖2D）。

2.4 重組慢病毒感染MEL細(xì)胞后報告基因表達(dá)水平的測定

MEL細(xì)胞以MOI=10分別感染各包裝濃縮的重組慢病毒，用流式細(xì)胞儀在指定時間點監(jiān)測化療藥物BG/BCNU對重組慢病毒感染MEL細(xì)胞的選擇富集效果（圖3），對照為未感染慢病毒的MEL細(xì)胞。非組織特異性重組慢病毒感染MEL細(xì)胞中mCherry報告基因表達(dá)的陽性率經(jīng)篩選后均有所提升，陽性細(xì)胞得到有效富集；組織特異性重組慢病毒感染MEL細(xì)胞中mCherry報告基因未表達(dá)。提示紅系特異性調(diào)控因子對基因表達(dá)控制較嚴(yán)格。多重Taq?Man PCR檢測結(jié)果表明，用BG/BCNU篩選16 d誘導(dǎo)0 d的MEL細(xì)胞中，組織特異性病毒的滴度是未經(jīng)BG/BCNU篩選培養(yǎng)細(xì)胞的3.2倍（P=0.0025）。

紅細(xì)胞特異性重組慢病毒感染的MEL細(xì)胞，經(jīng)BG/BCNU富集16 d后，用5 mmol/L HMBA誘導(dǎo)，MEL細(xì)胞在向紅系終端分化的過程中，在激發(fā)光為587 nm、發(fā)射光為610 nm的熒光顯微鏡下檢測到mCherry報告基因在感染細(xì)胞中得到逐步增高的表達(dá)（紅色熒光）（圖4）。

圖2 重組RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry慢病毒在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)A：明場下感染的HeLa細(xì)胞；B：在激發(fā)光為587 nm、發(fā)射光為610 nm下感染的HeLa細(xì)胞，表達(dá)的紅色單體熒光蛋白mCherry主要在細(xì)胞核內(nèi)；C：L-ASNase與多抗結(jié)合，用鍵合了Alex 488的二抗顯示綠色熒光，激發(fā)光為495 nm，發(fā)射光為519 nm，表達(dá)的L-ASNase主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；D：2種熒光通道與明場融合，mCherry與L-ASNase各自獨立表達(dá)，無共定位

用流式細(xì)胞儀對誘導(dǎo)的MEL細(xì)胞進行監(jiān)測，結(jié)果如圖5，紅細(xì)胞組織特異性重組慢病毒表達(dá)報告基因mCherry的細(xì)胞數(shù)量隨誘導(dǎo)時間的延長而增多，非組織特異性的則相反。對照為未感染重組慢病毒，但用HMBA誘導(dǎo)同樣時間的MEL細(xì)胞。

2.5 重組慢病毒攜帶目的基因及報告基因的表達(dá)鑒定

Western印跡分析顯示，重組慢病毒RRL-sEF1α-2A-mCherry感染的MEL細(xì)胞裂解物中，2A肽N端的部分序列通過自裂解作用游離出來，2A肽C端的部分序列與紅色單體熒光蛋白mCherry的N端結(jié)合；而重組慢病毒RS9-L-ASNase-2A-mCher?ry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）感染的MEL細(xì)胞經(jīng)BG/BCNU選擇和HMBA誘導(dǎo)7 d后，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的L-ASNase的C端結(jié)合了2A肽自裂解作用產(chǎn)生的N端部分序列（圖6）。

3 討論

在抗癌研究過程中，人們發(fā)現(xiàn)多種代謝異常的惡性腫瘤依賴某些外源性氨基酸，例如兒童ALL、卵巢癌、成人非霍奇金淋巴瘤不能合成L-Asn，需要從血液中吸收Asn供其生長，因而耗竭腫瘤必需氨基酸而對正常細(xì)胞不良反應(yīng)最小的癌細(xì)胞選擇性療法誕生了[12]。利用L-ASNase靶向性酶解L-Asn在治療兒童ALL中取得了顯著成功，患兒5年生存率已提高到80%以上，也能明顯減小非霍奇金淋巴瘤[13]。然而，由于人體內(nèi)不存在天然L-ASNase，而異源LASNase在臨床應(yīng)用中受限的主要原因是其免疫原性，以及由此引發(fā)的過敏反應(yīng)、過敏性休克及酶的免疫抑制與清除[14]。因此，降低異源酶的免疫原性，突破臨床應(yīng)用的局限性，成為研究人員需要解決的主要問題。

圖3 流式細(xì)胞儀監(jiān)測化療藥物BG/BCNU選擇對MEL細(xì)胞中mCherry報告基因表達(dá)的影響

目前供臨床使用的細(xì)菌源天門冬酰胺酶制劑有3種類型，一種是大腸桿菌-天門冬酰胺酶（E.coli-asparaginase，EcA）[15]，第二種是聚乙二醇-天門冬酰胺 酶（polyethylene glycol-asparaginase，PEGA）[16]。EcA或PEGA是治療ALL的一線方案。第3種歐文菌-天門冬酰胺酶（Erwinia-asparaginase，ErA）與EcA具有不同的免疫學(xué)特性，在歐洲和美國用作過敏患者的二線或三線治療方案[17]。

圖4 重組RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）慢病毒在MEL細(xì)胞中mCherry的表達(dá)情況

由于RBC的壽命和大小明顯超過其他藥物遞送載體[18]，近年來已有50多種抗感染藥物、抗炎癥藥物、抗腫瘤藥物、解毒作用的酶甚至遺傳物質(zhì)，或采取藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用、電穿孔、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain，PTD）和低滲透壓的方法把藥物在體外封裝到RBC內(nèi)[18]，或通過生物素-親和素結(jié)合的方法把藥物與RBC表面偶聯(lián)的方式進入了臨床研究[19]。近年來，采用基因修飾的方法使攜帶目的基因的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）在向終端分化成為紅細(xì)胞的過程中表達(dá)而發(fā)揮治療作用的方案，已在B型血友病研究中展開[20]。我們擬借鑒此系統(tǒng)，利用基因修飾后表達(dá)L-ASNase的紅細(xì)胞開展惡性血液病的治療研究。

圖5 流式細(xì)胞儀監(jiān)測MEL細(xì)胞誘導(dǎo)分化期間報告基因mCherry的表達(dá)

圖6 重組慢病毒感染MEL細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析

熒光顯微觀察結(jié)果提示，通過2A聯(lián)體技術(shù)連接的L-ASNase和mCherry在細(xì)胞的不同區(qū)域表達(dá)，即mCherry不會干擾L-ASNase行使功能。流式細(xì)胞術(shù)和多重TaqMan PCR法結(jié)果顯示，用50 μmol/L BG-50 μmol/L BCNU可以有效富集重組慢病毒感染的陽性細(xì)胞。由于血紅蛋白是由α-珠蛋白、β-珠蛋白和血紅素組成的結(jié)合蛋白，紅細(xì)胞組織特異性慢病毒載體使用的是β-珠蛋白基因調(diào)控序列，可以預(yù)計當(dāng)感染該重組慢病毒的MEL細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)向紅系終端分化的過程中，隨著血紅蛋白表達(dá)的增高，紅細(xì)胞組織特異性重組慢病毒攜帶的目的基因及報告基因的表達(dá)也將增高。非組織特異性慢病毒載體使用的是非組織特異性的sEF1α啟動子，可以預(yù)計當(dāng)感染該重組慢病毒的MEL細(xì)胞向紅系終端分化過程中，目的基因的表達(dá)會隨著血紅蛋白表達(dá)的增加而逐漸受到抑制。結(jié)果顯示，分別用紅細(xì)胞組織特異性重組慢病毒RS9-L-ASNase-2A-mCherry-PGK-MGMT-HS4-IVS2（-）、非組織特異性重組慢病毒 RRL-sEF1α-L-ASNase-2A-mCherry和 RRL-sEF1α-2A-mCherry感染MEL細(xì)胞，經(jīng)化療藥物BG/BCNU選擇和HMBA誘導(dǎo)紅細(xì)胞分化后，紅細(xì)胞組織特異性重組慢病毒表達(dá)報告基因mCherry的陽性MEL細(xì)胞百分率隨誘導(dǎo)時間的延長而增多，非組織特異性的則相反，與預(yù)計吻合。提示本研究建立的紅細(xì)胞組織特異性重組慢病毒更適合于基因修飾紅細(xì)胞開展惡性血液病的治療。Western印跡結(jié)果顯示L-ASNase和mCherry表達(dá)時在2A處發(fā)生了自裂解，所得表達(dá)產(chǎn)物與預(yù)計相符；與梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品L-ASNase的灰度值相比較，在60 μg/孔總蛋白上樣量中，計算出 L-ASNase量為 0.0179 U，即約為 0.3 U/mg總蛋白。參考非基因修飾方法將L-ASNase封裝進RBC，給荷L5178Y淋巴瘤動物模型一次輸注8 U[5]，本項目預(yù)計需要制備大量攜帶L-ASNase的基因修飾紅細(xì)胞才可能達(dá)到體內(nèi)治療效應(yīng)。盡管MEL細(xì)胞模型比較經(jīng)濟，然而MEL細(xì)胞可使小鼠發(fā)生類似于紅白血病的病征，輸注由其衍生的紅細(xì)胞風(fēng)險較大，因此仍須選擇造血干細(xì)胞進行基因修飾，我們還將繼續(xù)探索。

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