林良才，李金根，王 邦，裴 雪，2，田朝光

(1.中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308;2.吉林大學(xué) 植物科學(xué)學(xué)院，長春 130062)

絲狀真菌粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)又稱粗糙脈孢霉(以下簡稱脈孢菌)，作為生物遺傳學(xué)模式生物已有近百年的研究歷史，其中“一種基因一種酶學(xué)說”獲得了1958年諾貝爾獎。作為天然的纖維素快速降解菌，粗糙脈孢菌可以快速降解木質(zhì)纖維素，并具有利用木糖、纖維二糖、寡糖等組分的能力，有關(guān)脈孢菌降解木質(zhì)纖維素及其纖維素酶的研究早在1950年就有相關(guān)報導(dǎo)［1］。20世紀70年代第3次石油危機時，就掀起了一個研究脈胞菌纖維素酶和半纖維素酶的小高潮，不僅對脈孢菌產(chǎn)纖維素酶的條件、纖維素酶及半纖維素酶酶活性質(zhì)進行了研究［2-3］，而且深入探討了利用脈孢菌直接發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的可能性［4］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，20世紀90年代初期，脈孢菌纖維素的外切酶cbh-1首次被克隆、測序［5］。在我國，最早利用脈孢菌開展纖維素酶研究的是山東大學(xué)曲音波教授，其團隊先后對脈孢菌產(chǎn)纖維素酶及其木糖發(fā)酵進行了系統(tǒng)研究［6-7］。此外，天津理工大學(xué)馮炘教授針對脈孢菌發(fā)酵纖維素酶過程優(yōu)化進行了深入研究［8］。近年來，伴隨著轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等組學(xué)技術(shù)的興起，脈孢菌纖維素降解機制和應(yīng)用的研究再次成為熱點，并取得了多個方面的顯著進展，包括從組學(xué)水平系統(tǒng)研究纖維素降解過程、多糖單加氧酶(PMO)(GH61)家族在纖維素降解中功能、纖維素酶表達調(diào)控以及生物質(zhì)糖轉(zhuǎn)運蛋白功能的研究等。本文中筆者將就這些方面進行重點綜述。

1 粗糙脈孢菌木質(zhì)纖維素降解全基因組水平研究

組學(xué)技術(shù)的興起將真菌木質(zhì)纖維素降解的研究迅速提升到全基因水平。一批重要的木質(zhì)纖維素降解真菌的基因組相繼被測序。脈孢菌是第一個被測序的絲狀真菌［9］，隨后公布了里氏木霉(Trichoderma reesei)的基因組數(shù)據(jù)［10］。比較基因組學(xué)分析顯示，脈孢菌含有的纖維素酶數(shù)目是里氏木霉的兩倍之多，同時還擁有諸多半纖維素酶和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子［10］。2009 年，Tian 等［11］以脈孢菌為研究對象，利用豐富的突變體庫，綜合運用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，首次對纖維素降解真菌進行了全基因組學(xué)水平的系統(tǒng)研究?；虿町惙治鲲@示，脈孢菌在芒草秸稈培養(yǎng)基上有700多個基因轉(zhuǎn)錄本表達顯著變化(相比于蔗糖培養(yǎng)基)。其中在23個預(yù)測的纖維素酶基因中有18個快速顯著上調(diào);在預(yù)測的19個半纖維素基因中有13個顯著上調(diào)。同時，一些轉(zhuǎn)錄因子、糖轉(zhuǎn)運蛋白以及未知功能蛋白也被顯著誘導(dǎo)表達。通過對胞外分泌蛋白進行質(zhì)譜分析，確證了10個纖維素酶和8個半纖維素酶。這些組學(xué)研究結(jié)果為后續(xù)挖掘新型纖維素降解酶系以及遺傳改造脈孢菌提供了豐富的數(shù)據(jù)。隨后，美國加州大學(xué)伯克利分校Louise Glass實驗室繼續(xù)以脈孢菌為對象，對半纖維素降解調(diào)控進行了轉(zhuǎn)錄組和分泌蛋白組水平的研究［12］。除鑒定了353個基因在木聚糖條件下顯著上調(diào)表達以及34個胞外分泌蛋白以外，還證明了xlr-1(NCU06971)是脈孢菌主要的半纖維素酶基因表達正調(diào)控因子，指明xlr-1對半纖維素降解調(diào)控作用普遍存在于脈孢菌、里氏木霉、黑曲霉等纖維素降解真菌中。Schmoll等［13］發(fā)現(xiàn)光感受基因wc-1/2(white collar)及vvd參與了纖維素酶表達調(diào)控。研究指出，WC-1/2組成的復(fù)合物WCC(white collar complex)在脈孢菌生長早期負調(diào)控纖維素酶表達，但是隨著vvd感受光刺激產(chǎn)生光適應(yīng)，WCC活性被抑制，進而增強了細胞對纖維素的利用能力。值得注意的是，wc基因除了形成復(fù)合物間接對纖維素酶表達起調(diào)控作用之外，還能分別獨立地間接負調(diào)控纖維素酶表達，但其具體的調(diào)控通路仍不明晰。此外，伯克利分校的 Phillips等［14］實驗室運用蛋白質(zhì)譜定量技術(shù)，首次對脈孢菌在微結(jié)晶纖維素上的分泌蛋白做了定量分析，測定了胞外分泌纖維素酶的成分比例。結(jié)果顯示，CBH-1(NCU07340)、 GH6-2(NCU09680)、 GH5-1(NCU00762)和GH3-4(NCU04952)是脈孢菌最主要的纖維素酶系成分，占到胞外蛋白總質(zhì)量的63%～65%。隨后，對這4種酶進行了cocktail配比實驗，發(fā)現(xiàn)比例趨勢基本符合脈孢菌本源的分泌蛋白組。然而，這個最優(yōu)配比的纖維素酶系的酶活只能達到本源分泌酶混合物的43%，由此推測纖維素酶水解促進蛋白(包括PMO、纖維二糖脫氫酶(CDH)等)也起著不可忽略的作用。充分利用脈孢菌全基因組突變體庫和功能基因組學(xué)工具，開展纖維素降解途徑新基因和新蛋白的挖掘，必將大大加深對木質(zhì)纖維素降解和纖維素酶表達分泌的基因組水平的理解。

2 粗糙脈孢菌PMO家族纖維素酶研究

纖維素降解是通過內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡糖苷酶3種酶協(xié)同作用完成?；蚪M預(yù)測顯示，脈孢菌含有10個內(nèi)切葡聚糖酶、6個外切葡聚糖酶和7個β-葡萄糖苷基因。早在20世紀50年代，Reese等［15］就提出可以通過添加一種能破壞底物聚合結(jié)構(gòu)的非水解組分來提高纖維素酶的降解效率，促進纖維素的水解。PMO家族的酶就具有這種功能，該家族蛋白是銅依賴的溶解多糖單加氧酶，具有較弱的內(nèi)切葡聚糖酶酶活，其與CDH結(jié)合可增強纖維素酶的水解能力，如GH61家族蛋白。在商業(yè)化的纖維素酶中添加少量的該家族的蛋白即可顯著提高對纖維素的降解作用，故在木質(zhì)纖維素糖化產(chǎn)業(yè)化中有巨大的應(yīng)用前景，也是近年來的研究熱點和重點。

迄今為止，在很多纖維素降解真菌中都發(fā)現(xiàn)了pmo基因，脈胞菌基因組中有14個 pmo基因。Phillips等［14］對N.crassa在微晶纖維素上生長所分泌的胞外蛋白進行定量分析，檢測到4個PMO蛋白，共占分泌蛋白總量的15%。由此可以推斷，無論是從該家族基因數(shù)量還是其分泌量都可看出PMO家族蛋白在纖維素降解過程中發(fā)揮著重要的作用。

Phillips 等［14］、Beeson 等［16］通過對脈孢菌中的PMO家族蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，該家族蛋白的N-端有保守的氨基酸結(jié)構(gòu)域以及2個與金屬離子相結(jié)合的保守的組氨酸位點。PMO家族的酶通過與CDH或者一些低相對分子質(zhì)量的還原劑(如抗壞血酸)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，氧化纖維素、破壞糖苷鍵、裂解纖維素鏈上的不同部位C原子(C-1、C-4和C-6)，進而達到裂解纖維素的目的［17］。Beeson 等［16］的研究表明 PMO-5 氧化裂解纖維素作用位點位于纖維素鏈上的C-1位置，而PMO-4則是作用在C-4和C-6位置。

Kittl等［17］在 Picha pastoris中表達了 N.crassa的4個PMO家族蛋白，分別是PMO3、PMO5、PMO6和PMO10，其中PMO-3、PMO-5和PMO-10具有碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)結(jié)構(gòu)域。通過對N.crassa在芒草上的轉(zhuǎn)錄表達水平分析顯示，PMO-5表達水平提高了107倍，PMO-3提高了85倍，PMO-6上調(diào)了26倍，而PMO-10表達水平幾乎沒有變化。在P.pastoris中重組表達后證實，這些酶為銅依賴的PMO，并且CDH可以有效提高其活性，可以促進纖維素的氧化裂解。然而，已公布的80%的PMO家族蛋白的序列在C端都不具有纖維素結(jié)合域。Harris等［18］指出是否存在該結(jié)構(gòu)域與其增加纖維素水解的能力無關(guān);同時也指出在加入Ca2+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Ni2+和 Zn2+時，PMO 家族蛋白可顯著提高纖維素酶對底物的水解能力;然而當(dāng)不含有這些金屬離子時，添加PMO家族蛋白對纖維素酶的水解能力無顯著影響。同時，Quinlan等［19］通過研究Thermoascusaurantiacus中的 PMO家族蛋白(TaGH61A)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)存在沒食子酸(gallic acid)等電子供體的情況下，該蛋白可促進纖維素的氧化裂解。Kittl等［17］也在N.crassa中證實了這一觀點。

由于PMO家族蛋白可以加速纖維素酶對生物質(zhì)的降解，從而降低纖維素酶的用量，并縮短其反應(yīng)時間，因此PMO家族蛋白的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用將會對木質(zhì)纖維素的利用、轉(zhuǎn)化發(fā)揮重要的作用。在T.reesei中共表達一個高活性的PMO蛋白能夠使其纖維素酶活提高2倍［19］。諾維信公司(Novozymes)生產(chǎn)的一個高效纖維素酶Cellic?CTec2中就添加了PMO蛋白，其酶活相對于之前的產(chǎn)品就有了顯著的提高［20］。PMO家族基因的開發(fā)與利用可有效提高纖維素酶活，并且減少纖維素酶的用量，未來如果能夠大規(guī)模應(yīng)用，將有助于進一步降低生物糖化成本，從而促進生物質(zhì)資源的有效利用。

3 纖維素酶表達調(diào)控研究進展

纖維素酶是在胞內(nèi)表達合成后經(jīng)分泌系統(tǒng)分泌至胞外的，而誘導(dǎo)纖維素酶合成的天然底物是不溶性的，無法進入胞內(nèi)產(chǎn)生誘導(dǎo)表達響應(yīng)，因此它如何產(chǎn)生誘導(dǎo)作用成為了關(guān)注的熱點?；趯σ恍┕烟羌捌溲苌锶缋w維二糖、δ-纖維二糖內(nèi)酯、乳糖和槐糖對纖維素酶表達合成具有強信號誘導(dǎo)作用的研究認識，通常認為木質(zhì)纖維素降解產(chǎn)生的寡糖及其衍生物是作為事實上的誘導(dǎo)底物，產(chǎn)生信號分子，進一步誘導(dǎo)木質(zhì)纖維素酶系基因的大量表達［21］?；碧鞘怯搔?1，2糖苷酶連接的葡萄糖組成，能夠誘導(dǎo)高水平的纖維素酶表達，通常被認為是極佳的天然可溶誘導(dǎo)物［22-23］，尤其是在 T.reesei中，通常認為它是由纖維二糖在β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基作用形成的［24］。纖維二糖是纖維素降解中的重要可溶性中間產(chǎn)物，能夠產(chǎn)生信號分子，誘導(dǎo)纖維素酶的表達，被認為是纖維素酶表達的自然誘導(dǎo)物，但纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶的分子水平機制尚不清楚。在通常條件下，纖維二糖被β-葡萄糖苷酶降解成為葡萄糖，并且引起阻遏效應(yīng)，其對纖維素酶的誘導(dǎo)作用無法體現(xiàn)。粗糙脈孢菌通過敲除 3個主 要 的 β-葡 萄 糖 苷 酶(NCU00130、NCU04952和NCU08755)可以實現(xiàn)在纖維二糖條件下直接表達纖維素酶。突變體Δ3βG在纖維二糖的誘導(dǎo)條件下其蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的響應(yīng)與野生型菌株在纖維素誘導(dǎo)條件下的響應(yīng)相類似。由此推測，其他纖維素降解絲狀真菌的β-葡萄糖苷酶缺失菌株可以直接以可溶性的纖維二糖作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達纖維素酶。

近年來，對纖維素酶基因表達調(diào)控研究主要集中在木霉、曲霉等工業(yè)微生物上［25］(圖1)。目前已知的調(diào)控基因有轉(zhuǎn)錄激活因子XInR［26-29］、轉(zhuǎn)錄抑制因子Ace1［30-31］、激 活 因 子 Ace2［32-34］、葡 萄 糖 阻 遏 蛋 白Cre1［35-36］、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子 PacC［37-39］、CCAAT 結(jié)合復(fù)合體 Hap2/3/5［40-42］和 GATA 因子 AreA［43-44］。在曲霉和木霉中，轉(zhuǎn)錄因子XlnR/XYR1對纖維素酶和半纖維素酶具有重要的調(diào)控作用。然而，XlnR/XYR1在脈孢菌和鐮刀霉中的同源基因并不是纖維素酶表達所必須的，它們是菌體利用半纖維素所必需的，并且調(diào)控半纖維素酶的表達。加州大學(xué)伯克利分校Glass實驗室對200多個粗糙脈孢菌轉(zhuǎn)錄因子敲除菌株在纖維二糖上進行了生長和酶活力檢測的篩選，獲得了2個在子囊真菌中較保守的Zn(Ⅱ)2Cys6家族轉(zhuǎn)錄因子clr-1和clr-2，研究結(jié)果表明這2個轉(zhuǎn)錄因子是所有主要的纖維素酶基因和大部分半纖維酶基因誘導(dǎo)表達所必須的轉(zhuǎn)錄因子［45］。突變株Δclr-1和Δclr-2喪失了在纖維素條件下表達、分泌纖維素酶的能力。然而，這2個突變株在木聚糖條件下依舊可以正常地生長和分泌半纖維素酶。由此推測，在一些纖維素降解絲狀真菌中，纖維素酶和半纖維素酶的表達調(diào)控相互獨立，而clr-1和clr-2正是粗糙脈孢菌纖維素酶表達調(diào)控的重要組成部分。纖維二糖及其轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物作為纖維素酶最初的誘導(dǎo)物。在纖維二糖或是其轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物的誘導(dǎo)下，clr-1被激活，促進一系列可有效利用纖維二糖的基因表達，如clr-2等。clr-2可以進一步直接誘導(dǎo)纖維素酶和某些半纖維素酶的表達。在構(gòu)巢曲霉中，誘導(dǎo)纖維素酶表達所需的是clrB(clr-2的同源基因)，而不是clrA(clr-1的同源基因)。然而，clrA的缺失將導(dǎo)致構(gòu)巢曲霉利用纖維二糖的能力的喪失。因此，clr-1/clrA在絲狀真菌纖維二糖感受途徑中具有重要的保守作用。

圖1 絲狀真菌中參與纖維素酶調(diào)控機制示意［25］Fig.1 Schematic representation of the different fungal trans-acting factors and regulatory responses affecting cellulase expression［25］

轉(zhuǎn)錄因子clr-1和clr-2都屬于鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子超家族，鋅指蛋白是一類具有手指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，對基因表達調(diào)控、細胞分化、胚胎發(fā)育、增強植物抗逆性等方面具有重要的作用，該家族蛋白最初于1983年在非洲爪蟾卵母細胞的轉(zhuǎn)錄因子TFⅢA中被發(fā)現(xiàn)［46-47］，是迄今在真核生物基因組中分布最廣的一類蛋白，也是真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子中最大的家族之一。鋅指蛋白可以根據(jù)高度保守的氨基酸序列分為三大類:①經(jīng)典鋅指蛋白Cys2His2型，是真核生物中最為普遍存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通常以單體的形式與核酸相互作用，如人的轉(zhuǎn)錄因子Sp1、曲霉的碳代謝阻遏調(diào)控因子creA;②Cys4型鋅指蛋白，與Cys2His2型不同，以二聚體的形式與DNA相作用，其同源二聚體識別目標基因的反向重復(fù)序列，異源二聚體可以與正向重復(fù)序列相結(jié)合;③C6型鋅指又稱鋅簇或鋅雙核簇(Zn(Ⅱ)2Cys6或Zn2C6)，包含一個由6個半胱氨酸圍繞著2個鋅離子而形成的DNA結(jié)合域。值得指出的是，該鋅指家族蛋白是真菌所特有的轉(zhuǎn)錄因子，其可以與DNA以單體、同源二聚體或異源二聚體形式結(jié)合［48］。

筆者通過對粗糙脈孢菌鋅指蛋白超家族轉(zhuǎn)錄因子敲除突變體庫的進一步系統(tǒng)篩選，獲得了多個與纖維素酶表達異常的突變體。研究表明，在以結(jié)晶纖維素作為唯一C源的條件下，有3株突變體的蛋白分泌量和纖維素酶活力顯著上升，而顯著下降的有2株(未發(fā)表)。目前，正在深入研究這些潛在的基因?qū)w維素酶表達、分泌的調(diào)控機制以及與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之間的關(guān)系。這些重要的轉(zhuǎn)錄因子功能的揭示將有助于對絲狀真菌木質(zhì)素降解途徑的認識，更有利于形成高產(chǎn)纖維素酶的工程菌株，從而提高木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的利用效率。

4 生物質(zhì)糖轉(zhuǎn)運蛋白克隆鑒定及其在生物質(zhì)乙醇發(fā)酵中的應(yīng)用

作為木質(zhì)纖維素主要成分，纖維素和半纖維素是多種單糖分子聚合而成的復(fù)雜高聚碳水化合物，通過復(fù)合酶系可以水解為各種單糖和寡糖(圖2)。而對水解產(chǎn)物的利用，是纖維素轉(zhuǎn)化為生物燃料和化學(xué)品的重要研究內(nèi)容。特別是關(guān)于木質(zhì)纖維素降解真菌，是如何將降解的單糖和寡糖運入細胞，轉(zhuǎn)運的過程如何受到細胞內(nèi)外因素的調(diào)控以及不同的糖分子如何被特異性地轉(zhuǎn)運，這些方面的研究仍然非常薄弱。深入研究纖維素降解真菌(包括脈孢菌)對纖維素的利用，對于理清纖維素降解機制及糖到化學(xué)品的微生物轉(zhuǎn)化都十分必要。

從脈孢菌在纖維素和半纖維素條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)出發(fā)，已經(jīng)先后克隆了脈孢菌的3個非常重要的糖轉(zhuǎn)運蛋白 CDT1(NCU00801)，CDT2(NCU08114)和An25(NCU00821)。其中，CDT1和CDT2為纖維寡糖轉(zhuǎn)運蛋白，An25為木糖特異的轉(zhuǎn)運蛋白。CDT1自被克隆以來，在纖維二糖發(fā)酵以及與木糖、半乳糖等戊糖共發(fā)酵方面取得了顯著進展，這方面工作主要來自美國伊利諾伊大學(xué)金永株(Yong-su Jin)實驗室和趙惠民實驗室。他們在能發(fā)酵木糖的酵母中引入脈孢菌的CDT1和胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶(NCU04952)，構(gòu)建出能夠同時利用纖維二糖和木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的工程酵母，而胞內(nèi)水解纖維二糖的策略也大大減緩了胞外葡萄糖產(chǎn)生的阻遏效應(yīng)［49-50］。基于相同的思路，金永株實驗室還構(gòu)建了纖維二糖/半乳糖共發(fā)酵的工程酵母，拓寬了酵母發(fā)酵的底物譜［51］。最近，趙慧民實驗室采用纖維二糖代謝途徑定向進化的策略，大大提高了酵母利用纖維二糖的能力，同時將乙醇產(chǎn)量提高到1 g/L/h［52］。此外，研究者也嘗試用含纖維素酶cocktail和含 CDT1的酵母做 CBP(consolidated bioprocess)產(chǎn)乙醇［53］，以及利用纖維二糖發(fā)酵產(chǎn)其他化學(xué)品［54-55］?？偟恼f來，脈孢菌高親和性纖維寡糖轉(zhuǎn)運蛋白的鑒定與應(yīng)用極大地促進了混合糖發(fā)酵的研究，為纖維素乙醇及其他纖維素化學(xué)品發(fā)酵提供了新的思路和工程改造靶點。

圖2 粗糙脈孢菌中參與降解木質(zhì)纖維素的各種酶系［45］Fig.2 Characterized enzyme classesinvolved in lignocelluloses breakdown identified in the N.crassa genome［45］

在五碳糖轉(zhuǎn)運蛋白方面，過去的研究多集中在利用己糖轉(zhuǎn)運蛋白等底物廣譜性轉(zhuǎn)運蛋白來轉(zhuǎn)運五碳糖，而對于特異性五碳糖轉(zhuǎn)運蛋白(pentose specific transporter)的研究才剛剛起步。美國伊利諾伊大學(xué)趙慧民教授實驗室分別從粗糙脈孢菌和畢赤酵母中鑒定了2個木糖特異轉(zhuǎn)運蛋白(An25和Xyp29)［56］。作為半纖維素的主要成分之一，阿拉伯糖的利用對木質(zhì)纖維素徹底轉(zhuǎn)化利用至關(guān)重要，國際上關(guān)于阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白研究逐漸開始涉及。2011年，芬蘭VTT研究中心Richard實驗室的科學(xué)家從Ambrosiozyme monospora酵母中克隆2個阿拉伯糖特異性轉(zhuǎn)運基因(LAT1，LAT2)，但該阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白親和力不高［57］，尋找親和力更高的阿拉伯糖轉(zhuǎn)運蛋白是研究阿拉伯糖轉(zhuǎn)化利用的核心問題之一。

基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)和序列結(jié)構(gòu)域分析，目前脈孢菌全基因組被預(yù)測有39個糖轉(zhuǎn)運蛋白(未發(fā)表數(shù)據(jù))，基本屬于膜蛋白家族MFS(major facilitator superfamily)［58］。依據(jù)轉(zhuǎn)運的機制，MFS 又分為簡單轉(zhuǎn)運蛋白(uniporter)(又稱協(xié)助擴散蛋白(facilitateddiffusion protein)、同向轉(zhuǎn)運蛋白(symporter)以及反向轉(zhuǎn)運蛋白(antiporter)。Uniporter，依靠底物濃度梯度驅(qū)動轉(zhuǎn)運，轉(zhuǎn)運蛋白主要起著協(xié)助運輸?shù)淖饔?。Symporter，向同一個方向同時轉(zhuǎn)運2種及以上的底物，并以其中一種底物的電化學(xué)梯度作為推動力，常見的有 sugar/H+、glucose/Na+、phosphate/H+、nucleoside/H+以 及nitrate/H+等等。Antiporter，向反方向協(xié)同轉(zhuǎn)運2種及以上的底物，驅(qū)動力來源和Symporter一樣，這一類里很多都是drag/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白。真菌中的糖轉(zhuǎn)運蛋白主要是uniporter和symporter/H+類型［58］。早在1974年已有報道指出，脈孢菌在主動轉(zhuǎn)運糖進入細胞的同時會協(xié)同轉(zhuǎn)運質(zhì)子［59］，但在分子水平上哪些糖轉(zhuǎn)運蛋白的作用導(dǎo)致表觀上電勢的變化至今仍沒有被闡釋。此外，由于自然界中脈孢菌能生長在樹枝、秸稈等各種干枯的木質(zhì)纖維上，可以預(yù)見其糖轉(zhuǎn)運蛋白家族具有很高的功能多樣性。同時，在長期的進化適應(yīng)過程中，細胞面對不同的生長環(huán)境，如酸性-堿性、碳充足-碳匱乏，會有很好的策略來協(xié)同這些轉(zhuǎn)運蛋白之間的轉(zhuǎn)運工作，以使得其能高效地吸收外界的營養(yǎng)。全基因組系統(tǒng)解析絲狀真菌中糖轉(zhuǎn)運蛋白動力類型和生化特征，對于研究絲狀真菌環(huán)境適應(yīng)性，理清纖維素降解菌利用木質(zhì)纖維素的機制有重要意義。更進一步地，這種高效的糖轉(zhuǎn)運吸收方式，有可能對改造工程菌(包括酵母、曲霉和木霉)以充分利用培養(yǎng)基中的殘?zhí)前l(fā)酵，提高糖的轉(zhuǎn)化利用率有一定的指導(dǎo)意義。

5 粗糙脈孢菌與生物質(zhì)一步轉(zhuǎn)化

生物質(zhì)具有成本低、可再生以及產(chǎn)量大等特點，是生產(chǎn)生物燃料及化學(xué)品的重要原料。利用生物質(zhì)進行發(fā)酵一般要經(jīng)過預(yù)處理、酶解、發(fā)酵以及最后產(chǎn)品的分離純化。其中，預(yù)處理和酶解過程是整個過程中成本最重的部分。盡管木霉、曲霉和白腐菌等木質(zhì)纖維素降解真菌已被廣泛地應(yīng)用于生物質(zhì)纖維素預(yù)處理和生產(chǎn)纖維素酶過程中。目前為止，直接利用它們將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖或是化學(xué)品卻未見報道。因此，如何直接利用廉價的生物質(zhì)作為底物生產(chǎn)清潔能源或是工業(yè)化學(xué)品成為了今后研究的發(fā)展方向。粗糙脈孢菌作為絲狀真菌的模式菌株不僅具有降解木質(zhì)纖維素所需的酶系，而且還能夠利用降解產(chǎn)物進行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等化學(xué)品［7］。這種直接從初始的生物質(zhì)原料一步發(fā)酵生產(chǎn)生物產(chǎn)品的工藝將極大地降低生產(chǎn)成本，并且大幅提高生物質(zhì)中的碳轉(zhuǎn)化效率。

脈孢菌能夠利用生物質(zhì)降解物中的各種糖類(葡萄糖、木糖及阿拉伯糖等)進行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等。張瀟等［7］研究了不同條件對脈孢菌AS3.1602木糖發(fā)酵的影響，研究表明脈孢菌具有較強的發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇及木糖醇的能力。在木糖發(fā)酵中，乙醇及木糖醇等產(chǎn)物產(chǎn)率很大程度上決定于通氧條件、培養(yǎng)基初始pH值及糖濃度等環(huán)境因素。由于輔因子的不同，真菌中木糖代謝具有氧化還原不平衡的特點。Zhao等［60］經(jīng)過研究證明，在脈孢菌中存在2種木糖還原酶的同工酶(EI和EII)，其中木糖還原酶EII能夠同時利用NADH與NADPH作為輔因子催化氧化還原反應(yīng)，從而有助于減緩細胞內(nèi)氧化還原不平衡，促進的木糖的代謝，進而提高發(fā)酵效率。Zhang等［61］探討了在限氧條件下脈孢菌的木糖代謝，在最佳通氧條件，乙醇產(chǎn)量達到6.7 g/L，轉(zhuǎn)化率為66%。

脈孢菌發(fā)酵木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇一般要經(jīng)過兩個階段:第一階段在有氧條件下，分泌降解纖維素的各種酶類;第二階段，在厭氧或微好氧條件下，將水解產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。Xiros等［62］將脈孢菌DSM 1129在高粱殘渣固體中培養(yǎng)，而后在厭氧或微好氧條件下進行液體發(fā)酵，其乙醇產(chǎn)量為75 g/L，研究表明用堿液對生物質(zhì)進行預(yù)處理有利于乙醇產(chǎn)量的提高，且產(chǎn)生的潛在抑制物對發(fā)酵無抑制作用。Okonko等［63］報道了脈孢菌在37℃下經(jīng)過可以直接發(fā)酵甘蔗渣生產(chǎn)乙醇。

除了纖維素乙醇工藝的整合之外，Wu等［64］通過有性雜交得到β-葡萄糖苷酶的六突變體，其中菌株F5能夠降解纖維素積累纖維二糖(7.7 g/L)。在過量表達纖維二糖脫氫酶的情況下，菌株F5能夠利用纖維素發(fā)酵生產(chǎn)纖維二糖酸(0.4 g/L)及纖維二糖(6.5 g/L)，從而將纖維素酶的酶的生產(chǎn)和酶解過程進行整合。

此外，脈孢菌體內(nèi)還存在豐富的蛋白質(zhì)、維生素B12及脂類等，同時還具有良好的蛋白表達、分泌能力，然而利用木質(zhì)纖維素直接發(fā)酵生產(chǎn)這些高附加值產(chǎn)品還有待進一步的研究。

6 展望

粗糙脈孢菌作為纖維素降解模式真菌，在國際上有較大的研究群體，在技術(shù)方法和文獻資源上具有其他真菌所沒有的優(yōu)勢，使得脈孢菌纖維素降解機理研究能夠在真菌中處于領(lǐng)先地位?？梢灶A(yù)見，除了已經(jīng)取得進展之外，未來幾年，利用粗糙脈孢菌系統(tǒng)在木質(zhì)纖維素降解利用方面的研究將會有更大進展。美國伯克利能源生命科學(xué)研究所(EBI)重點以粗糙脈孢菌系統(tǒng)為依托，部署了一系列的研究項目(表1)。在該方向正在開展的8個項目(Program)中有4個涉及粗糙脈孢菌體系，其中2個主要研究粗糙脈孢菌(蛋白分泌途徑和木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化生物燃料)，另外2個利用粗糙脈孢菌研究果膠降解組學(xué)和纖維素酶系的表達篩選。此外，在該方向14個資助課題(Project)中有3個是粗糙脈孢菌研究(脂肪酸合成，代謝組學(xué)重構(gòu)和生物質(zhì)降解機制)。預(yù)計該系列研究將帶動整個脈孢菌在木質(zhì)纖維素降解機制，蛋白質(zhì)合成分泌等方面取得新一輪進展，同時也表明粗糙脈孢菌木質(zhì)纖維素降解利用研究競爭會更加激烈，包括機理研究和利用該菌進行纖維素酶生產(chǎn)、蛋白表達系統(tǒng)開發(fā)以及燃料化學(xué)品生產(chǎn)等方面。

表1 EBI木質(zhì)纖維素降解領(lǐng)域資助的有關(guān)粗糙脈孢菌的項目和課題Table 1 Long-term programs and short-term projects in cellulose degradation supported by Energy Biosciences Institute(EBI)

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