員 超，張 寧，倪金鳳

(山東大學 微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟南 250100)

木質(zhì)纖維素是地球上儲量最為豐富的可再生資源，為生物能源的利用提供了材料［1－3］。按照白蟻腸道后腸有無原生動物將其分為低等白蟻和高等白蟻［4］。黃翅大白蟻是一種高等培菌白蟻，其后腸中含有大量微生物，包括細菌、真菌及古菌，這些共生微生物與宿主白蟻組成高度進化的共生體系，可在木質(zhì)纖維素降解中共同發(fā)揮作用［5］。對白蟻腸代謝環(huán)境及從中分離的微生物方面的研究表明，腸道共生微生物能為白蟻提供消化酶以及排毒酶類，并可在氮循環(huán)方面起重要作用［6］，同時保護宿主白蟻免受病原體的侵入［7］。

對低等白蟻的研究已經(jīng)證實:腸道中微生物具有極高的多樣性［3，8］，而且存在大量未培養(yǎng)微生物［9］。高等白蟻腸道微生物多樣性的研究較為有限，并且高等白蟻如何利用腸道微生物協(xié)助木質(zhì)纖維素的降解依然不清楚。為更好地了解高等白蟻腸道微生物組在木質(zhì)纖維素降解過程中所發(fā)揮的作用，筆者以黃翅大白蟻為材料，通過對后腸微生物的條件培養(yǎng)，了解腸道微生物組在纖維素降解中參與木質(zhì)纖維素降解作用的可能性，同時利用變性梯度凝膠電泳方法對此環(huán)境中的微生物群落進行分析，鑒定此環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu)，進一步了解黃翅大白蟻纖維素的降解機制，以期為生物質(zhì)能源的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

在超凈臺無菌條件下將50只黃翅大白蟻工蟻解剖獲得后腸，用研磨棒研磨作為后腸微生物組材料;所用感受態(tài)為自制大腸桿菌感受態(tài)E.coli DH5α;測序載體為質(zhì)粒pMD18T vector，Takara公司。

1.1.2 培養(yǎng)基基礎(chǔ)(basic media，BM)培養(yǎng)基參照文獻［10］。BM+羧甲基纖維素鈉(CMC)培養(yǎng)基:在BM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入0.5%CMC。

BM-Ac(acetate)+filter paper(BF)培養(yǎng)基:在無NaAc的BM培養(yǎng)基中加入4條1 cm ×5 cm Whatman No.3濾紙(GE公司)。

1.1.3 主要器材

恒溫水浴搖床(哈爾濱東聯(lián)電子科技有限公司);臺式離心機(Eppendorf公司);PCR儀、變性梯度凝膠電泳儀(美國Bio-Rad公司);電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)過程

首先將黃翅大白蟻后腸微生物材料以1%接種到5 mL BM+CMC的培養(yǎng)基中，30℃富集培養(yǎng)1 d，之后以1%的接種量轉(zhuǎn)接至BF培養(yǎng)基中，每天記錄濾紙降解情況。

1.2.2 酶活性電泳

提取此濾紙降解環(huán)境的總蛋白，并進行如下的活性電泳實驗:①內(nèi)切葡聚糖酶活性電泳。配制12%SDS-PAGE蛋白膠，在分離膠中添加0.1%CMC，提取的蛋白試樣不煮沸，直接上樣。按照“先20 mA、30 min，后 30 mA、50 min”的條件進行電泳，電泳結(jié)束后，用于內(nèi)切葡聚糖酶(EG)分析的分離膠先在10 mmol/L、pH 5.5醋酸鈉緩沖液(SAB)中浸泡30 min，然后0.1%剛果紅染色30 min，1 mol/L NaCl脫色30 min，有EG酶活性的位置將出現(xiàn)1條清晰透明條帶。②β-葡萄糖苷酶活性電泳。提取的蛋白試樣在上樣前不要煮沸，然后在12%SDS-PAGE中電泳，電泳緩沖液為三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸，按照同上條件進行電泳。電泳結(jié)束后，用于β-葡糖苷酶(BG)活性分析的分離膠在室溫下先用0.1 mol/L SAB緩沖液預(yù)處理30 min，再浸沒在3 mmol/L 4-甲基傘形基-β-D-吡喃葡糖苷(MUG)中20～30 min，最后在紫外線下檢測BG酶所在位置的熒光信號。③木聚糖酶活性電泳。配制蛋白膠時，在分離膠中添加0.1% 山毛櫸木聚糖，提取的蛋白試樣在上樣前不要煮沸，然后在12%SDSPAGE中電泳。電泳結(jié)束后，用于木聚糖酶分析的分離膠在25%異丙醇磷酸鹽溶液洗滌40 min，再用磷酸鹽溶液洗滌3次，每次15 min，接著在磷酸鹽溶液中37℃反應(yīng)90 min，然后用0.5%剛果紅溶液染色20 min，最后用1 mol/L NaCl溶液脫色。

1.2.3 總基因組的提取

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法提取群落總基因組。①離心后向沉淀中加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5 mL Eppendorf管中;②加入800 μL的CTAB提取緩沖液，混勻(CTAB在65℃水浴預(yù)熱)，每5 min輕輕振蕩幾次，20 min后12 000 r/min離心15 min;③小心吸取上清液，加入等體積的酚和氯仿溶液各 400 μL，混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min;④小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min。重復(fù)步驟④1～2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止。取上清，－20℃沉淀1 h，4℃、12 000 r/min離心10 min;棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次;室溫下干燥5～15 min后，溶于30～50 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)去離子水中，于－20℃或者－70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

利用提取的全基因組進行PCR擴增，分析細菌多樣性用的引物:341f-GC:5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3';518r:5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。擴增真菌用的引物:GC Fung:5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG-3';NS1:5'-GTAGTCA-TATGCTTGTCTC-3'。PCR程序如下:95℃ 5 min;接著進行20個循環(huán)(94℃ 30 s，65～55℃ 30 s)，每循環(huán)降0.5℃，72℃ 1 min;然后15個循環(huán)(94℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min);最后72 ℃ 5 min。擴增后，進行DGGE實驗。細菌多樣性實驗參數(shù)如下:丙烯酰胺質(zhì)量分數(shù)8%，變性劑質(zhì)量分數(shù)40% ～60%，45 V電壓下電泳17 h;真菌多樣性實驗參數(shù)如下:丙烯酰胺質(zhì)量分數(shù)6%，變性劑質(zhì)量分數(shù)20%～40%，70 V電壓下電泳13 h。電泳結(jié)束后，切除條帶，將DNA片段從凝膠中溶出，以去除GC-clamp的引物再次進行 PCR，對擴增片段純化后，連接pMD18T vector，進行測序及比對分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃翅大白蟻后腸微生物群落對濾紙的降解作用

解剖獲得的黃翅大白蟻微生物經(jīng)過富集培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入以濾紙為唯一C源的BF培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，開始時濾紙完好，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，濾紙逐漸分解成碎片，培養(yǎng)液開始變渾濁，至7 d后，可以明顯觀察到微生物對Whatman No.3的降解狀況，如圖1所示。由圖1可見:與對照組相比，實驗組溶液呈現(xiàn)明顯渾濁，培養(yǎng)基中充滿了絲絮狀的纖維，培養(yǎng)基中的濾紙被降解成小塊;而對照組溶液清晰透明，濾紙條帶形狀完整。

圖1 黃翅大白蟻后腸微生物對Whatman No.3濾紙的降解Fig.1 Digestion of Whatman No.3 filter paper by microbiome of M.barneyi

Warnecke等［11］利用高通量測序的方法對白蟻屬后腸P3區(qū)進行研究，發(fā)現(xiàn)含有高多樣性的微生物群落，并且檢測到來自于45個糖苷水解酶家族(cazy family，carbohydrate-active enzymes)的糖苷水解酶催化域，表明其后腸微生物可能參與纖維素的降解。通過利用基本鹽培養(yǎng)基對黃翅大白蟻后腸微生物的培養(yǎng)，使得微生物組得以利用唯一C源濾紙而生長起來，進一步證實了后腸微生物組在協(xié)助宿主白蟻降解結(jié)晶纖維素方面可能起到一定的協(xié)助作用。

2.2 微生物群落的酶譜分析

為了解微生物在白蟻木質(zhì)纖維素降解方面起的作用，已有研究者利用分子生物學方法，發(fā)現(xiàn)了白蟻腸道中細菌來源的木質(zhì)纖維素水解酶［12－14］。但白蟻后腸微生物在降解纖維素不同底物方面，尚缺乏直接證據(jù)。為此，通過黃翅大白蟻微生物群落對濾紙的降解培養(yǎng)，利用酶譜分析的方法，檢測環(huán)境中纖維素降解酶的存在情況。提取此環(huán)境的總蛋白，經(jīng)過一定程度的濃縮后，進行酶譜分析，結(jié)果如圖2所示。

從圖2(a)可見，此環(huán)境中檢測到了2條相對分子質(zhì)量較大的具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的條帶(箭頭標出)。為了更好地了解黃翅大白蟻腸道中微生物對纖維素的降解作用，培養(yǎng)基中只含有基本鹽類，濾紙是唯一C源，營養(yǎng)較為貧瘠，所以微生物群落的濃度相對比較低，酶譜分析檢測到的信號不是很強。同時檢測到了相對分子質(zhì)量大小在4.5×103左右的β-葡萄糖酶活性條帶，且條帶較為清晰。木聚糖酶活性條帶較為清晰，對木聚糖酶的酶譜分析顯示了木聚糖酶的存在。白蟻降解半纖維素需要半纖維素酶類，但目前為止還沒有白蟻自身來源的半纖維素酶的報道［15］。由此可知，白蟻腸道微生物在半纖維素降解方面可能起到重要作用。黃翅大白蟻后腸微生物具有獨立降解纖維素的能力，酶譜分析實驗證實了此群落具有纖維素降解功能的內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的存在。

2.3 黃翅大白蟻后腸濾紙降解微生物群落結(jié)構(gòu)的鑒定

通過限定條件培養(yǎng)和酶譜分析的實驗已經(jīng)證實:黃翅大白蟻后腸微生物組能夠在營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中對濾紙行使降解作用，為了進一步探究此纖維素降解環(huán)境中發(fā)揮作用的微生物種類，接下來利用DGGE的方法對微生物的群落結(jié)構(gòu)進行鑒定，結(jié)果如圖3所示。

圖2 黃翅大白蟻后腸降解濾紙微生物的全蛋白和酶活性電泳Fig.2 Activity electrophoresis of filter paper-hydrolyzing microbiome of M.barneyi hindgut

圖3 黃翅大白蟻后腸纖維素降解微生物群落結(jié)構(gòu)的鑒定Fig.3 DGGE profiles of 16S rRNA and 18S rRNA gene amplified from filter paper digestion community of M.barneyi

由圖3可知:此環(huán)境中含有7種細菌(圖3(a))，3種真菌(圖3(b));從數(shù)量上看，細菌的數(shù)量遠大于真菌數(shù)量，暗示細菌在濾紙降解中發(fā)揮了重要作用。為鑒定菌種，DGGE膠上的條帶被切割下，DNA從膠內(nèi)溶出，再次進行PCR，產(chǎn)物經(jīng)純化后連接T-載體，并測序。得到的序列信息在NCBI網(wǎng)站上進行比對，以確定此環(huán)境中微生物的種類。7種細菌種類如下:1～7分別來自于芽胞桿菌屬(Bacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)、變形桿菌屬(Proteobacterium)、變形桿菌屬(Proteobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、無色桿菌屬(Achromobacter)和微桿菌屬(Microbacterium)。Baird等［16］研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus具有纖維素降解所需的內(nèi)切葡聚糖酶［16］。Bacillus屬微生物在白蟻中具有較高多樣性，并在白蟻木質(zhì)纖維素降解的初級階段中發(fā)揮作用，同時某些芽胞桿菌具有降解芳香化合物的能力［17－18］。來源于變形菌屬的微生物對昆蟲消化道內(nèi)碳循環(huán)有重要作用。在海洋蛀木蟲腸道內(nèi)，來源于變形桿菌屬的微生物Teredinibacter turnerae基因組中含有101個糖苷水解酶家族 (GHs)和117個碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBMs)［19］，表明其在纖維素降解方面與昆蟲的協(xié)同作用。此外在微桿菌屬中，也有葡萄糖苷酶的報道［20］。對3種真菌進行鑒定，1～3分別來自白地霉屬(Galactomyces)、糞殼菌屬(Sordariomycetidae)和白地霉屬(Galactomyces)。Baffi等［21］對橄欖生態(tài)系統(tǒng)進行研究，發(fā)現(xiàn)了來自白地霉的真菌，并對該真菌進行酶活性分析，表明具有β-葡萄糖苷酶、聚半乳糖醛酸酶以及脂酶活性;同時在咖啡殘渣的具有纖維素降解能力的微生物中也發(fā)現(xiàn)了來源于白地霉屬的真菌［22］。因此，通過酶譜分析檢測到的纖維素降解酶類可能由上述微生物提供，并協(xié)助黃翅大白蟻完成木質(zhì)纖維素的降解過程，但尚不能確定具體由哪種微生物提供了纖維素降解酶。本研究通過黃翅大白蟻后腸濾紙降解微生物的群落結(jié)構(gòu)鑒定，初步確定了在此環(huán)境中起纖維素降解作用的微生物種類，但這些微生物是如何行使降解功能的，以及不同微生物之間的相互關(guān)系如何，仍需要進一步研究。

3 結(jié)論

初步研究了黃翅大白蟻后腸降解濾紙的微生物群落，對此微生物群落進行酶譜分析，直觀地證明了此環(huán)境中纖維素及半纖維素降解酶的存在。利用變性梯度凝膠電泳的方法對環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)進行鑒定，確定了此環(huán)境中起作用的主要微生物組成。

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