王 歡，胡集鋮，李 亞，韓萍芳

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 211800;2.上海市尚德實(shí)驗(yàn)學(xué)校，上海 201315)

作為生物催化劑，酶在工業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品等各個領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［1］。在資源、能源短缺和環(huán)境不斷惡化的今天，酶促轉(zhuǎn)化已被提到相當(dāng)重要的戰(zhàn)略高度［2］。但是，游離酶在實(shí)際使用過程中對環(huán)境十分敏感，同時很難從反應(yīng)體系中被分離回收和重復(fù)利用，這些缺點(diǎn)是酶促反應(yīng)產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)瓶頸［3］。為了克服這些問題，在20世紀(jì)60年代，酶固定化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生且快速發(fā)展起來。

隨著對酶固定化技術(shù)研究的深入，探索高效廉價的載體引起了人們的重視。海泡石具有截面積為0.36 nm×1.06 nm的管狀貫穿通道及高達(dá)900 m2/g的理論表面積［4］。在通道和孔洞中可以吸附大量的水或極性物質(zhì)，包括低極性物質(zhì)，因此，海泡石具有很強(qiáng)的吸附能力［5］。由于海泡石具有以上這些特點(diǎn)，使之具備作催化劑載體的良好條件［6］。

脂肪酶(lipase，E C 3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一類特殊的酯鍵水解酶，能分解生物產(chǎn)生各種天然油脂，主要水解由甘油和C12原子以上的長鏈脂肪酸形成的甘油三酯。其重要特征是在異相系統(tǒng)(油-水)界面上水解特殊酯(脂肪酸甘油酯)類作為重要的工業(yè)用酶被廣泛應(yīng)用于食品、制革、飼料洗滌和油脂化工等工業(yè)領(lǐng)域［7－8］。

筆者以海泡石為載體固定化豬胰脂肪酶(PPL)，并考察固定化酶的最適條件及穩(wěn)定性、最適pH等理化性質(zhì)，以期為進(jìn)一步的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

豬胰脂肪酶(porcine pancreas lipase，PPL)，南京奧多福尼生物技術(shù)有限責(zé)任公司;海泡石(47 μm，預(yù)處理);Pluronic P123(EO20-PO70-EO20)、檸檬酸、三乙酸甘油酯、磷酸(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;NaHCO3、NaH2PO4、Na2HPO4和 NaOH(分析純)，廣東汕頭西隴化工廠。

1.2 分析測試儀器

DSHZ-300A型恒溫振蕩器(太倉市試驗(yàn)設(shè)備廠)，85-1型磁力攪拌器(金壇醫(yī)療設(shè)備廠)，PHS-3C型pH測定儀(上海盛磁儀器有限公司)，GL-21M型離心機(jī)(上海離心機(jī)械研究所)，Nexus 670傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)(美國Nicolet公司)，JEM-2010UHR高分辨透射電鏡(SEM)儀(日本電子光學(xué)公司)。

1.3 海泡石的預(yù)處理

取原礦樣放入燒杯中，加入適量蒸餾水(體積比1∶5)，磁力攪拌10 min后，水化過夜。傾去上層懸浮物，取中間層懸濁液。下層沉淀物按上述方法再處理幾次，把得到的所有懸濁液抽濾，所得固體在105 ℃下烘干［9］。

1.4 脂肪酶的固定化

取2 mg/mL的酶溶液40 mL、海泡石80 mg，加入100 mL具塞三角燒瓶中，混合液在25℃、110 r/min的條件下，進(jìn)行酶固定化?；旌弦悍磻?yīng)到一定時間后，取出燒瓶在10℃、3 000 r/min條件下離心10 min。上清液用考馬斯亮藍(lán)蛋白測試方法測定其蛋白含量，上清液中減少的蛋白量即是海泡石材料上所固定的酶蛋白量，固定化的酶蛋白與載體量的比例可以由Pa=(ρi－ρf)V/m計(jì)算得出，式中:Pa為單位載體上固定的酶蛋白的量(mg/g)，ρi和ρf為反應(yīng)前后酶溶液的質(zhì)量濃度(g/L)，V為反應(yīng)液體積(mL)，m為使用的載體質(zhì)量(g)。

1.5 酶活的測定

在100 mL的三角瓶中加入2 g三乙酸甘油酯、50 mL去離子水、10 mL pH為7.0的緩沖液，磁力攪拌器攪拌10 min制備成乳濁液。當(dāng)溶液pH穩(wěn)定后記錄初始pH值，并加入游離脂肪酶或固定化的脂肪酶。反應(yīng)30 min，用0.02 mol/L的NaOH溶液滴定，使pH回到初始值，記錄消耗的NaOH的量。

一個酶活(U)定義:在40℃的條件下，每分鐘內(nèi)催化1 μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酶的固定化

2.1.1 固載時間對酶固定化的影響

在磷酸緩沖液(PBS)pH 7.0的條件下，考察固載時間對脂肪酶固定化的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知:脂肪酶在海泡石的最佳固定化時間為4 h，此時固定化酶活力達(dá)到最大值，固定化時間過長或過短均使固定化酶活力下降。這是因?yàn)殡S著時間的延長，過多的酶吸附于載體表面，導(dǎo)致載體孔道堵塞，酶蛋白分子互相屏蔽，能與底物契合的酶數(shù)量減少。因此，最佳固定化酶反應(yīng)時間為4 h。

圖1 固定化時間對海泡石固載豬胰脂肪酶比酶活的影響Fig.1 Effects of time on activities of immobilized PPL on sepiolite

2.1.2 溫度對酶固定化的影響

由于溫度過高會導(dǎo)致酶變性失活，因此考察不同溫度(20～50℃)對酶固定化的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知:當(dāng)溫度小于30℃，所得固定化脂肪酶的比酶活較高(306 U/g);但是當(dāng)溫度超過30℃時，酶活急劇下降，這是因?yàn)樵诠潭ɑ^程中酶失活所致。因此，在脂肪酶固定化過程中溫度應(yīng)控制在25～30℃之間比較理想，最佳溫度為25℃。

圖2 溫度對海泡石固載豬胰脂肪酶比酶活的影響Fig.2 Effects of temperature on activities of immobilized PPL on sepiolite

2.1.3 pH對酶固定化的影響

考察緩沖液的pH對酶固定化的影響，結(jié)果如表1所示。

由表1可知:脂肪酶的固定量受pH的影響較大，在pH 5.0的緩沖液中，酶的固定量最大為97.36 mg/g;在pH 6.0～7.0的緩沖液中，酶的固定量有所降低，但不明顯。這是因?yàn)橹久傅牡入婞c(diǎn)為5.0，當(dāng)溶液的pH大于酶分子的等電點(diǎn)時，酶分子帶負(fù)電;當(dāng)溶液的pH小于等電點(diǎn)時，酶分子帶正電，同時載體孔道內(nèi)表面pH比溶液中pH要小，在這種情況下，蛋白質(zhì)分子表面的正電荷逐漸減少為零電荷，蛋白質(zhì)分子間的庫倫力在減少，分子之間可以較緊密的單層排列在載體的內(nèi)表面［10－11］，從而能在 pH 5.0 ～7.0時得到較高的固定量，并使得酶分子的活力在pH 6.0處充分表現(xiàn)出來。但在pH 6.0～9.0之間，由于酶分子表面所帶電荷從中性變?yōu)樨?fù)值，這時酶分子和載體表面都帶負(fù)電荷，彼此之間相互排斥，從而導(dǎo)致酶的固定量降低，酶活降低［12］。

表1 pH對酶固定量及酶活的影響Table 1 Effects of pH on PPL enzymeimmobilization and enzymatic activities on sepiolite

2.2 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 固定化酶的化學(xué)穩(wěn)定性

考察不同pH的磷酸緩沖液分別浸泡游離脂肪酶和海泡石固定化脂肪酶30 min，然后測定其酶活，以各自未經(jīng)浸泡的初始酶活力為100%計(jì)，計(jì)算相對酶活力，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知:游離脂肪酶的酶活大大降低，最高的相對酶活力也未達(dá)到50%，而且游離酶對酸堿非常敏感;經(jīng)固定化的脂肪酶對酸堿的耐受力明顯加強(qiáng)，相同pH條件下浸泡后固定化脂肪酶的相對活力均大于游離酶，而且固定化脂肪酶在pH在5.0～9.0范圍內(nèi)都能維持接近90%的較高酶活。

圖3 游離脂肪酶和固定化脂肪酶的pH穩(wěn)定性Fig.3 Effects of pH on stability of free and immobilized lipase

2.2.2 固定化酶的熱穩(wěn)定性

將游離脂肪酶和海泡石固定化脂肪酶分別置于60℃環(huán)境中處理0～6 h，然后測定處理后的酶活，計(jì)算相對酶活力，以各自未經(jīng)熱處理的初始酶活力為100%計(jì)，結(jié)果見圖4。

由圖4可知:游離酶在60℃環(huán)境下活力下降很快，1 h后游離酶的活力基本只有最初活力的33%。而對于固定化酶，其活力在60℃環(huán)境下下降比較緩慢，且反應(yīng)2 h后固定化酶的活力仍保留最初活力的87%。這說明固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性得到了顯著的提高。酶作為一種蛋白質(zhì)，其構(gòu)象對熱不穩(wěn)定，在高溫下會因變性而失活。當(dāng)酶蛋白被固定在載體上后，脂肪酶的三級結(jié)構(gòu)可以得到保護(hù)而不至于被高溫破壞，酶活力從孔道中緩慢釋放，使得固定化酶的熱穩(wěn)定性得到了提高。酶催化反應(yīng)通常會在較高溫度下進(jìn)行，固定化酶提高了酶作用效率和耐熱性，這無疑對酶催化反應(yīng)是非常有利的。

2.2.3 固定化酶的可重復(fù)利用性

重復(fù)利用在酶催化應(yīng)用方面具有很重要的作用，尤其在工業(yè)上對于節(jié)約成本方面顯得非常重要。圖5表示的是重復(fù)利用次數(shù)對酶活的影響結(jié)果。由圖5可知:固定化酶的催化活力隨重復(fù)次數(shù)的增加而下降，但在經(jīng)過5次重復(fù)使用后，其活力仍保留了91 U/g的比酶活。由于實(shí)驗(yàn)中，固定化酶使用量比較少，在回收脂肪酶的過程時不可避免地存在一定的損失，這可能也是導(dǎo)致酶活下降的原因之一。同時酶分子與材料之間是通過弱的分子間作用力(氫鍵、范德華力)吸附，經(jīng)過多次的反應(yīng)、分離和洗滌，也使得酶分子很容易從孔道中脫落［13－14］。因此，就固定化脂肪酶本身而有，其重復(fù)使用性能還是理想的。

圖4 游離脂肪酶和海泡石固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Effects of temperature on stability of free and immobilized lipase

圖5 使用次數(shù)對海泡石固載豬胰脂肪酶比酶活的影響Fig.5 Effects of reuse cycles on the activity of the immobilized PPL on sepiolite

2.3 固定化海泡石材料的表征分析

2.3.1 FT-IR分析

圖6為固定化海泡石材料的紅外表征結(jié)果。由圖6可知:Si—O—Si對稱和不對稱伸縮振動峰出現(xiàn)在471、1 095 和 800 cm－1處。這些 Si—O—Si鍵形成了SiO2網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在脂肪酶固載上去之后，該峰的強(qiáng)度明顯減少，是因?yàn)镾i—OH的基團(tuán)和脂肪酶的N—H基團(tuán)產(chǎn)生了氫鍵。而且2 850到2 995 cm－1處的C—H伸縮振動峰、1 577cm－1處的C—O伸縮振動峰、1 434 cm－1周圍的C—H扭曲振動峰，這些脂肪酶的特征峰都只出現(xiàn)在固載酶的紅外圖譜上［15］。這些結(jié)果均表明，脂肪酶已成功固載在海泡石上。

圖6 海泡石材料和固定化脂肪酶的FT-IR圖譜Fig.6 FT-IR spectra of SEP and SEP-PPL

2.3.2 SEM分析

圖7為海泡石與固載后海泡石后的SEM照片結(jié)果。由圖7可知:未固載脂肪酶的海泡石和固載后的海泡石的存在明顯差異，對比可以看出脂肪酶已經(jīng)聚集固載于海泡石上。

圖7 海泡石和固定化酶的海泡石的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.7 SEM images of SEP and SEP-PPL

3 結(jié)論

采用海泡石制備固定化脂肪酶具有工藝簡單、條件溫和及操作方便的特點(diǎn)。制備的固定化酶有較高的酶活，其最適固載時間為4 h，磷酸緩沖液pH 6.0，此時比酶活為309 U/g。獲得的固定化酶在pH和熱穩(wěn)定性的適應(yīng)能力都有顯著提高，固定化酶在60℃環(huán)境中保存2 h后仍保留最初活力的87%。實(shí)驗(yàn)表明海泡石是固定化脂肪酶的良好載體。

［1］ Katchalski-Katzir E.Immobilized enzymes-learning from past successes and failures［J］.Trends Biotechnol，1993，11(11):471-478.

［2］ Schmid A，Dordick J S，Hauer B，et al.Industrial biocatalysis today and tomorrow［J］.Nature，2001，409:258-268.

［3］ 游金坤，余旭亞，趙鵬.吸附法固定化酶的研究進(jìn)展［J］.化學(xué)工程，2012，40(4):1-2.

［4］ 張琦.海泡石吸附性能研究［D］.天津:河北工業(yè)大學(xué)，2002.

［5］ 宋秀芹，馬建峰，楊華麗，等.海泡石澄清作用在菜汁制作中的應(yīng)用［J］.化學(xué)世界，1996，37(7):349-351.

［6］ 鄧庚風(fēng)，羅來濤，陳昭平，等.海泡石的性能及其應(yīng)用［J］.江西科學(xué)，1999，17(1):61.

［7］ Jaeger K E，Eggert T.Lipases for biotechnology［J］.Curr Opin Biotechnol，2002，13(4):390-397.

［8］ 劉海洲，吳小飛，牛佰慧，等.脂肪酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用與研究進(jìn)展［J］.糧食加工，2008，33(5):55-57.

［9］ 張晴，陳勇.海泡石對有機(jī)染料吸附作用的研究［J］.青島大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，1995，8(2):73-77.

［10］ Vinu A，Murugesan V，Tangermann O，et al.Adsorption of cytochrome c on mesoporous molecular sieves:influence of pH，pore diameter，and aluminum incorporation［J］.Chem Mater，2004，16(16):3056-3065.

［11］ Vinu A，Murugesan V，Hartmann M，et al.Adsorption of lysozyme over mesoporous molecular sieves MCM-41 and SBA-15:influence of pH and aluminum incorporation［J］.J Phys Chem B，2004，108:7323-7330.

［12］ Katiyar A，Lei L，Smirniotis P，et al.Protein adsorption on the mesoporous molecular sieve silicate SBA-15:effects of pH and pore size［J］.J Chromatogr A，2005，1069:119-126.

［13］ Ma H，He J，Evans D G，et al.Immobilization of lipase in a mesoporous reactor based on MCM-41［J］.J Mol Catal B:Enzymatic，2004，30(5/6):209-217.

［14］ Yadav G D，Jadhav S R.Synthesis of reusable lipases by immobilization on hexagonal mesoporous silica and encapsulation in calcium alginate:transesterification in non-aqueousmemdium［J］.Microporous Mesoporous Mater，2005，86:215-222.

［15］ Zhu Kai，Wang Jianqiang，Wang Yanhua，et al.Synthesis of retinyl palmitate catalyzed by Candida sp.99-125 lipase immobilized on fiber-like SBA-15［J］.J Nanosci Nanotechnol，2011，11(9):7593-7602.