鄭瑩麗，楊朝霞，佘高照，張 春，張朝暉

(1.吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000； 湖南省龍山縣現(xiàn)代中藥材開發(fā)有限公司，湖南 龍山 416800)

白術(shù)為我國常用中藥之一，為菊科植物白術(shù)的干燥根莖，常用于治療脾胃氣弱、瀉泄和胎動不安等疾病[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和降血糖等作用[2]，其提取研究對于開發(fā)白術(shù)多糖資源具有重要意義。目前，白術(shù)多糖的常用提取方法主要有熱水浸提、稀酸浸提、稀堿浸提等傳統(tǒng)方法[3]。近年來，各種新的提取工藝也有應(yīng)用，如酶法提取[4]、微波提取[5]和超聲提取[6]等。超聲提取技術(shù)具有提取時(shí)間短、能耗低、效率高等特點(diǎn)[7]，劉勝姿等[8]成功驗(yàn)證了超聲提取白術(shù)多糖的工藝。但采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化白術(shù)多糖超聲提取工藝的報(bào)道很少。本研究中主要在傳統(tǒng)水提法基礎(chǔ)上，以武陵山區(qū)龍山白術(shù)為原料，輔助超聲波處理，利用超聲波的空化作用、熱效應(yīng)、機(jī)械作用加速細(xì)胞壁的破碎，促進(jìn)胞內(nèi)多糖的溶出，縮短提取時(shí)間[9]。并以白術(shù)多糖得率為評價(jià)指標(biāo)，在原料顆粒提取時(shí)間、提取溫度、料液比等單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法[10]優(yōu)化超聲波提取白術(shù)多糖的工藝條件，為開發(fā)利用白術(shù)多糖資源及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DF-101S型集熱式磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；JA2003N型電子天平(上海精密儀器廠)。白術(shù)(龍山現(xiàn)代中藥材開發(fā)有限公司，批號為1204003)；70%乙醇(成都金山化學(xué)試劑有限公司)；苯酚、濃硫酸(湖南省邵陽市方華化工有限公司)；氯仿(武漢點(diǎn)達(dá)有限公司)，正丁醇(南京東方之珠有限公司)；無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110833-200902)；蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝流程及提取方法

工藝流程:白術(shù)→粉碎(過20目篩)→70%乙醇回流→抽濾得白術(shù)顆?！诱麴s水→超聲輔助浸提→抽濾得濾液→定容→測定多糖含量。稱取白術(shù)顆粒5.0 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加70%乙醇100 mL，85℃加熱回流1.5 h，過濾所得白術(shù)顆粒用10 mL 70%乙醇洗滌2次。收集白術(shù)顆粒，加入75 mL蒸餾水，80℃超聲輔助提取70 min，趁熱抽濾，殘?jiān)?0 mL蒸餾水洗滌2次，濾液于250 mL容量瓶中定容。用紫外-可見分光光度計(jì)分析測定白術(shù)多糖的含量。

2.2 白術(shù)多糖得率測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:稱取無水葡萄糖0.332g，精密稱定，置1000mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，分別置10 mL容量瓶中，各加水至2.0 mL，再加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后置40℃水浴中加熱15 min，取出，置冷水中冷卻10 min。同時(shí)取2.0 mL蒸餾水做空白，用紫外-可見分光光度計(jì)在490 nm波長處測定吸光度，將上述數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 A=16.81C+0.029，r=0.999 7，式中 C為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(g/L)，A為吸光度。

測定方法:采用苯酚-硫酸法[11]，精密吸取0.2 mL樣品溶液，置50 mL容量瓶中，加水稀釋定容。然后精密量取2.0 mL，置試管中，加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后置40℃水浴中加熱15 min，取出，置冷水中冷卻10 min，同時(shí)用2.0 mL蒸餾水作空白，用紫外-可見分光光度計(jì)在490 nm波長處測定吸光度。多糖得率(%)=(比色液質(zhì)量濃度×比色液體積×定容體積)/(供試樣品體積×供試樣品質(zhì)量×103)×100%。

2.3 超聲波提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

稱取一系列干燥過篩后的白術(shù)顆粒5.0 g，分別置250 mL錐形瓶中，加入蒸餾水，超聲輔助提取，趁熱抽濾，殘?jiān)?0 mL蒸餾水洗滌2次，得濾液，濾液置250 mL容量瓶中定容，采用苯酚-硫酸法檢測溶液中白術(shù)多糖含量，探討各因素對白術(shù)多糖得率的影響。

顆粒度:固定超聲提取溫度為80℃，在料液比為1∶15下超聲提取時(shí)間70 min，分別對過8，20，40，60目篩的白術(shù)顆粒進(jìn)行提取，研究不同粒度對白術(shù)多糖得率的影響。結(jié)果見圖1 A?？梢?，白術(shù)原料顆粒度對白術(shù)多糖得率有顯著影響，原料越細(xì)小，浸提越充分，提取得率越高。但由于白術(shù)含有大量淀粉，若顆粒太細(xì)，進(jìn)行提取時(shí)，淀粉溶出提取液會成糊狀，影響白術(shù)多糖含量的測定。綜合生產(chǎn)周期和試驗(yàn)操作，顆粒度選取過20目篩較好。

料液比:固定超聲提取溫度為80℃，提取時(shí)間為70 min，采用料液比 1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30對過 20 目篩的白術(shù)顆粒進(jìn)行提取。結(jié)果見圖1 B。隨著料液比的增加，多糖得率隨之增加，到1∶15時(shí)多糖得率達(dá)到最高。再增加溶劑比例，多糖得率無明顯變化。這是因?yàn)樵诖侄嗵堑奶崛∵^程中，隨著溶劑用量的增加，物料的溶出量逐漸增加，達(dá)到飽和溶出度后，多糖得率不再改變。從實(shí)際生產(chǎn)操作條件和成本考慮，加水量不宜過大，故料液比以1∶15為宜。

提取溫度:固定料液比1∶15，白術(shù)顆粒粒度為20目篩，超聲提取時(shí)間為 70 min，分別在 40，50，60，70，80，90，100 ℃下研究不同溫度對白術(shù)多糖得率的影響。結(jié)果見圖1 C。隨著溫度的升高，多糖的得率不斷升高，80℃達(dá)到最高，其原因可能是溫度過高會使多糖產(chǎn)生降解，從而導(dǎo)致多糖得率下降。同時(shí)，高溫對多糖的結(jié)構(gòu)與活性也會產(chǎn)生一定的影響，故最佳提取溫度應(yīng)為80℃。

提取時(shí)間:固定提取溫度為80℃，料液比為1∶15，分別在40，50，60，70，80，90 min 下研究提取時(shí)間對過 20 目篩的白術(shù)多糖得率的影響。結(jié)果見圖1 D。隨著超聲提取時(shí)間的增加，多糖的得率不斷升高。在70 min后隨著時(shí)間的延長，多糖得率曲線基本平緩，這表明白術(shù)多糖基本提取完畢。從節(jié)省能源和減少生產(chǎn)周期考慮，提取時(shí)間以70 min為宜。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

Box-behnken試驗(yàn)結(jié)果:為了進(jìn)一步研究超聲提取的工藝條件，該試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取參數(shù)。根據(jù)Box Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[10]，綜合前述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)3 個(gè)因素，采用 3 因素3水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)。分析因素與水平設(shè)計(jì)見表1，響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見表2。利用SAS8.1軟件對上表中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次線性回歸擬合和顯著性分析，分析結(jié)果見表3?；貧w擬合數(shù)學(xué)模型為，Y=12.41400+0.258 75 A+0.45125 B+0.235 00C+0.14500AB-0.077500AC+0.11750BC-0.49200A2-0.37200B2-0.719 50C2。由表3可見，料液比與超聲時(shí)間的交互項(xiàng)對多糖得率影響顯著，溫度的二次項(xiàng)對多糖得率影響顯著，超聲時(shí)間的二次項(xiàng)對多糖得率影響顯著。該模型的 R=0.979，R值越接近1，擬合度越高，表明該模型對試驗(yàn)的擬合較好。故影響因素順序?yàn)闇囟龋境晻r(shí)間＞料液比。

圖1 白術(shù)多糖得率影響因素考察

白術(shù)多糖提取的響應(yīng)面分析:白術(shù)多糖提取工藝，用SAS 8.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到響應(yīng)曲面圖及等高線圖，確定最優(yōu)提取條件，提取時(shí)間為70.16 min，提取溫度為80.26℃，料液比為1∶15.61。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中操作條件，超聲提取白術(shù)多糖的最優(yōu)條件可優(yōu)化為提取時(shí)間70 min，提取溫度80℃，料液比1∶15。在最優(yōu)條件下進(jìn)行的5組平行試驗(yàn)，得到白術(shù)多糖得率分別為12.47%，12.42%，12.38%，12.39%，12.56%，平均值為12.44%，與預(yù)測值12.54%相差0.10%。因此，該模型能很好地預(yù)測結(jié)果。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果

2.5 白術(shù)多糖提取方法比較

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9]并結(jié)合實(shí)際，以多糖得率作為衡量提取效率的指標(biāo)，稱取5.0 g過20目篩的白術(shù)顆粒，在提取溫度為90℃、料液比為1∶20的條件下進(jìn)行熱水浸提6 h，將所得物進(jìn)行抽濾，得濾液。濾液用70%的乙醇沉淀24 h，將其進(jìn)行離心，即得到多糖粗品，采用苯酚-硫酸法對產(chǎn)品中白術(shù)多糖進(jìn)行檢測，多糖得率最高可達(dá)7.59%。

比較水提法和超聲輔助提取法，可知超聲輔助提取白術(shù)多糖能大大縮短提取時(shí)間，在最佳條件下白術(shù)多糖得率也比熱水提法的多糖得率高。因此，超聲輔助提取法明顯優(yōu)于水提法。

3 討論

通過單因素試驗(yàn)，以及在此基礎(chǔ)上通過設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面分析法試驗(yàn)，最終確定出超聲提取白術(shù)多糖的最佳工藝參數(shù):顆粒度為20目，料液比為1∶15，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為70 min。在此條件下，白術(shù)多糖得率達(dá)12.44%。

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