(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鹽城 224001)

海娜花，即指甲花 Lawsonia inermis L.，為千屈菜科 (Lythtaceae)散沫花屬植物，我國(guó)漢代《南方草木狀》中稱其為散沫花，1964年版《維吾爾醫(yī)常用藥材》中稱指甲花的維吾爾語(yǔ)名稱為Hina或Mihid，還指出其英文名稱為Henna。

1 儀器與試藥

DF-2型集熱式磁力加熱攪拌器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-CA型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；85-2A型恒溫磁力攪拌器(常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠)，LC-20型高效液相色譜儀(日本島津公司)。95%乙醇、甲醇(分析純，西隴化工)，磷酸二氫銨，磷酸；海娜花粉(天然植物粉，烏魯木齊印伊海娜有限公司)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA，生化試劑，廣東環(huán)凱)，RPMI-1640液體培養(yǎng)基(生化試劑，賽默飛世爾)；白色念珠菌凍干粉(生化試劑，南京便診生物科技，CMCC98001)；刃天青。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜(HPLC)條件

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:A為30 mmol/L磷酸二氫銨，B為甲醇(用磷酸調(diào)pH=3)溶液，梯度洗脫；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 海娜有效成分提取方法優(yōu)化

2.2.1回流提取法

溶劑濃度選擇:稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別加入50%，70%，90%乙醇50 mL，于80℃溫度下回流提取，每隔1 h取出液體，過(guò)濾，殘?jiān)^續(xù)加入50%，70%，90%乙醇50 mL回流提取，重復(fù)上述步驟3次。量取提取液10 mL，40℃減壓蒸干，用2 mL HPLC法流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測(cè)[1]。結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，90%乙醇回流提取時(shí)出峰晚，物質(zhì)的非極性高；用50%乙醇回流提取時(shí)出峰早，物質(zhì)的極性高；而70%乙醇介于兩者之間。因此，選擇70%乙醇作為優(yōu)化的回流提取溶劑。

表1 3種不同濃度乙醇回流提取液的峰面積比較

提取溫度選擇:稱量海娜花粉5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50mL，分別在60，80，100℃溫度下回流提取，每隔1h取出液體，過(guò)濾，殘?jiān)^續(xù)加入70%乙醇50mL，保持上述3個(gè)溫度回流提取，重復(fù)上述步驟3次。量取提取液10mL，40℃減壓蒸干，用2mL HPLC法流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)0.22μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，100℃時(shí)的峰面積比60℃和80℃都要高，故此選擇100℃作為優(yōu)化的回流提取溫度。

表2 不同溫度下回流提取液的峰面積比較

提取時(shí)間選擇:稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，100℃下分別回流0.5，1.0，1.5h，取出液體，過(guò)濾。量取提取液10mL，40℃減壓蒸干。用2mL HPLC法流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)0.22μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表3。可見(jiàn)，回流提取1.0h的峰面積比0.5h和1.5h的都要大，故提取時(shí)間選擇1.0h。

表3 不同提取時(shí)間回流提取液的峰面積比較

2.2.2超聲提取法

提取溫度選擇:稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，分別在40，50，60℃溫度下超聲提取，每隔1 h取出液體，過(guò)濾，殘?jiān)^續(xù)加入70%乙醇50 mL，保持上述3個(gè)溫度超聲提取，重復(fù)上述步驟3次。量取提取液10 mL，40℃減壓蒸干，用2 mL HPLC法流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表4。可見(jiàn)，50℃溫度下超聲提取的峰面積較高，故選用50℃作為超聲提取溫度。

表4 不同溫度下超聲提取液的峰面積比較

提取時(shí)間選擇:稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，在50℃下超聲提取0.5，1.0，1.5 h，取出液體，過(guò)濾。量取提取液10 mL，40℃減壓蒸干，用2 mL HPLC法流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表5?？梢?jiàn)，超聲提取1.5 h的峰面積比0.5 h和1.0 h的都要高，故超聲提取時(shí)間選擇1.5 h。

表5 不同提取時(shí)間超聲提取液的峰面積比較

2.2.3相同條件下超聲提取法與回流提取法比較

稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50mL，在60℃下分別回流提取和超聲提取，每隔1h取出液體，過(guò)濾，殘?jiān)^續(xù)加入70%的乙醇50 mL回流或超聲提取，重復(fù)上述步驟3次。量取提取液10mL，40℃減壓蒸干，用2 mL HPLC法流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)0.22μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)表6?？梢?jiàn)，在相同溫度和時(shí)間下，回流提取法的峰面積明顯大于超聲提取法，故相同條件下回流提取法的效果更佳。

表6 2種提取方法的峰面積比較

2.3 體外抑菌試驗(yàn)

白色念珠菌的培養(yǎng):將白色念珠菌凍干粉活化后，挑取少許菌落轉(zhuǎn)種于PDA平板，28℃培養(yǎng)12d，用適量無(wú)菌生理鹽水沖洗平板，用無(wú)菌移液管尖端輕輕探劃白色念珠菌菌落，制備懸液。將含有分生孢子或孢囊孢子及菌絲片段的混懸液用無(wú)菌移液管移至無(wú)菌試管中，充分混勻靜置5 min，將上部均一懸液轉(zhuǎn)移到帶螺紋的無(wú)菌管中，旋緊蓋子，置旋渦混合器混勻15s。在分光光度計(jì)上讀取分生孢子或孢囊孢子懸液吸光度(A)，調(diào)整 A為0.15。制備的菌懸液用RPMI-1640培養(yǎng)基1∶50稀釋后，作為待接種物。

海娜花提取物稀釋液的制備:稱量海娜花粉5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50mL，在100℃溫度下回流提取，每隔1 h取出液體過(guò)濾，殘?jiān)^續(xù)加入70%乙醇50mL回流提取，重復(fù)上述步驟3次。合并3次的提取液，40℃減壓蒸干，精密稱取干浸膏適量，用RPMI-1640培養(yǎng)基配置成1 280μg/mL的貯備液。

接種:按照NCCLS M38-A方法[2]，將提取物稀釋液在無(wú)菌96孔板的第2列到第11列孔之間進(jìn)行倍比稀釋，第1列孔裝RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL，作為無(wú)菌對(duì)照，第2列到第11列孔裝倍比稀釋過(guò)的海娜花提取物稀釋液100 μL與菌懸液100 μL，第12列孔裝無(wú)菌生理鹽水100 μL與菌懸液100 μL，作為生長(zhǎng)對(duì)照。各孔用槍頭吹打均勻，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。

結(jié)果判定:將96孔板在28℃培養(yǎng)箱靜置孵育3 d，向各孔中加入比色指示劑刃天青，繼續(xù)孵育30 min后，觀察加樣孔的顏色。藍(lán)色表示無(wú)菌生長(zhǎng)，紫色表示部分生長(zhǎng)，紅色表示生長(zhǎng)，最低抑菌濃度(MIC)值為顏色由藍(lán)色到紫色輕微改變時(shí)的最低藥物質(zhì)量濃度。試驗(yàn)結(jié)果顯示，海娜花提取物對(duì)白色念珠菌的 MIC為320 ～640 μg/mL。

3 討論

20世紀(jì)70年代，Abd-E-l Malik等[3]采用薄層色譜法對(duì)指甲花葉乙醇提取物中具有抗菌活性的4種成分進(jìn)行了分離，其中3種分別被鑒定為沒(méi)食子酸(gallic acid)、指甲花醌(lawsone，2-羥基-1，4-萘醌)和1，4-萘醌，并發(fā)現(xiàn)葉子提取物對(duì)葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptoccus)、布魯氏菌(Brucella)、沙門(mén)菌(Salmonella)有抵抗作用，但對(duì)綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)和白色念珠菌(Candida albican)卻沒(méi)有抑制作用。20世紀(jì)80年代，Afzal等[4]對(duì)從指甲花葉中提取的1，2-二羥基-4-葡糖氧基萘醌的抗菌活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)1，2-二羥基-4-葡糖氧基萘醌對(duì)枯草桿菌、酵母菌屬(Paslorianas)有抑制作用。另外，Malekzadeh等[5]的研究表明，指甲花的提取物在生物體外對(duì)多種革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均有抑制作用，且指甲花提取物的抗菌活性與其所含的主要染色物質(zhì)指甲花醌有關(guān)。Awadh等[6]的研究也表明，指甲花的提取物(水、乙醇、乙酸乙酯提取物)具有抗菌活性，但未發(fā)現(xiàn)它有細(xì)胞毒活性。

溶劑濃度選擇時(shí)，乙醇濃度為70%時(shí)的提取效果最佳，而濃度較低或較高時(shí)的提取效率會(huì)明顯下降?？赡苁且?yàn)槿軇舛容^低時(shí)，海娜花中的有效成分不能被完全提取出來(lái)；而溶劑濃度較高時(shí)，雖然有效成分能被完全提取出來(lái)，但其中部分成分可能已被破壞，從而導(dǎo)致提取效率降低。

回流提取時(shí)，溫度在100℃時(shí)的提取效果最佳，可能是由于溫度高時(shí)分子運(yùn)動(dòng)加快，溶解速度變快，從而提取率增加。超聲提取時(shí)，溫度在50℃時(shí)的提取率最高，可能是因?yàn)闇囟忍陀行С煞植荒鼙煌耆艹?，而溫度過(guò)高時(shí)雖然溶出率增加，但超聲和升溫同時(shí)會(huì)將部分有效成分分解，導(dǎo)致提取率降低。

回流提取時(shí)提取時(shí)間為1 h的效果最佳，時(shí)間過(guò)短提取不充分，而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又會(huì)破壞有效成分。超聲提取時(shí)提取時(shí)間為1.5 h時(shí)的效果最佳，超聲溫度較低，即使提取時(shí)間達(dá)到1 h后有效成分仍不能被完全溶出，因而提取時(shí)間要比回流提取時(shí)長(zhǎng)。

比較2種方法，在相同條件下，回流提取法的提取效率更高，可能是因?yàn)槌曁崛r(shí)分子間的運(yùn)動(dòng)過(guò)于劇烈而致使有效成分被破壞，使提取率降低?；亓魈崛》ǖ淖罴压に嚄l件為:稱量海娜花粉5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50mL，在100℃下回流提取1 h，取出液體，過(guò)濾，殘?jiān)^續(xù)加入70%乙醇50 mL回流，重復(fù)提取3次。超聲提取法的最佳工藝條件為:稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，在50℃下超聲提取1.5 h，取出液體，過(guò)濾，殘?jiān)^續(xù)加入70%乙醇50 mL超聲，重復(fù)提取3次。

海娜花提取物對(duì)白色念珠菌的 MIC為320～640 μg/mL，遠(yuǎn)高于一般抗真菌藥物的 MIC值。這可能有兩方面原因:一是天然藥物提取物中的雜質(zhì)和無(wú)效成分較多，真正抗真菌的有效成分含量較低；二是筆者對(duì)于NCCLS M38-A方法還不能熟練掌握，可能產(chǎn)生了操作誤差[7-8]。因此，需要對(duì)海娜花提取物作進(jìn)一步分離、純化，得到抗真菌成分較高的產(chǎn)物；同時(shí)，應(yīng)更好地掌握NCCLS M38-A方法，提高測(cè)定的準(zhǔn)確度。

參考文獻(xiàn)：

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