譯/石 毅

突破極限，見所未見
——2014年諾貝爾化學獎側(cè)記

譯/石 毅

2014年諾貝爾化學獎得主（左）艾力克·貝齊格（Eric Betzig），（中）斯特凡·W·赫爾（Stefan W.Hell），（右）W·E·莫納（W.E.Moerner）。

2014年諾貝爾化學獎給了三個物理學家：艾力克·貝齊格（Eric Betzig）、斯特凡·W·赫爾（Stefan W.Hell）和W·E·莫納（W.E.Moerner），以表彰他們對于發(fā)展超分辨率熒光顯微鏡做出的卓越貢獻。他們的突破性工作使光學顯微技術(shù)進入了納米尺度，從而使科學家們能夠觀察到活細胞中不同分子在納米尺度上的運動。

這三位獲獎科學家都是業(yè)內(nèi)知名人士，很有知名度。貝齊格是美國應用物理學家和發(fā)明家，目前在美國霍華德·休斯醫(yī)學研究所珍利亞農(nóng)場研究園區(qū)工作；赫爾是羅馬尼亞出生的德國物理學家，現(xiàn)在擔任德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究所所長；莫納則是美國單分子光譜和熒光光譜領(lǐng)域的著名專家，從1998年至今一直在斯坦福大學擔任教授。

光學顯微鏡及其分辨率限制

為什么說這三位獲獎者的工作是突破性的呢？

故事得從光學顯微鏡說起。隨著黑暗的中世紀結(jié)束，歐洲進入文藝復興時期。在文化藝術(shù)得到極大發(fā)展的同時，現(xiàn)代自然科學也慢慢發(fā)展起來：第一臺光學顯微鏡正是在文藝復興時期問世。是誰制造了第一臺光學顯微鏡已不完全可考（一說是兩個荷蘭的眼鏡制造商于16世紀晚期發(fā)明），但這不重要。重要的是，從此以后科學家們可以用光學顯微鏡來瞧瞧這個瞅瞅那個了，觀察的對象當然也包括各種生命有機體。在那個時代，隨便看看樹葉小草也是個重量級的大發(fā)現(xiàn)：著名的羅伯特·胡克（Robert Hooke）先生就是在1665年用光學顯微鏡看了看紅酒瓶的軟木塞從而發(fā)現(xiàn)了細胞的存在?，F(xiàn)代生物學及微生物學皆因光學顯微鏡而誕生，光學顯微鏡也成為生命科學中必不可少的工具。隨著人們觀測的東西越來越小，人們不禁疑問，光學顯微鏡到底能看多小？

“能看多小”換成比較科學的說法就是“分辨率有多高”。分辨率（嚴格講是光學分辨率）描述的是成像系統(tǒng)解析成像細節(jié)能力，或者說是成像系統(tǒng)能區(qū)分的兩點之間的最小距離。1873年，物理學家恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）得出結(jié)論：傳統(tǒng)的光學顯微鏡分辨率有一個物理極限，即所用光波波長的一半（大概是0.2微米，即200納米）。

為什么會這樣呢？要理解這個，我們回到高中物理曾經(jīng)介紹過的單縫衍射實驗：當一束光經(jīng)過一條狹縫，在中間亮條紋的兩側(cè)會出現(xiàn)一系列明暗交替的條紋。這是因為光是電磁波，它被狹縫限制時會發(fā)生衍射從而偏離直線傳播。如果光經(jīng)過的不是一條狹縫，而是一個圓孔，那么圓孔會在各個方向上限制光的傳播，從而光在各個方向上發(fā)生衍射而形成圓孔衍射圖樣，或者叫“愛里斑”（Airy Disk）：這個圖案中心有一個比較大的亮斑，外圍有一些明暗交替的環(huán)。同樣的道理，由于衍射的存在，成像系統(tǒng)無法把光線匯聚成無限小的點，而只會在像平面上形成有限大小的愛里斑。通過任何光學儀器成像的過程，都可以認為是把物平面上的無數(shù)微小的點轉(zhuǎn)換成愛里斑，然后再把它們疊加起來呈現(xiàn)在像平面上。這樣的結(jié)果是，任何成像系統(tǒng)所得到的像無法精確地描述物體的所有細節(jié)。

那么像平面上能夠呈現(xiàn)多精細的細節(jié)？假如物平面上有兩個點，通過一個光學成像系統(tǒng)后產(chǎn)生兩個愛里斑。當這兩個點離得較遠時，像平面上的愛里斑也會離得較遠——此時我們可以輕松分辨出物平面上有兩個點。如果把兩個點逐漸移近，愛里斑也會隨之接近。當它們接近到一個圓斑中心與另一個圓斑邊緣重合的時候，我們達到能夠分辨出有兩個點的極限（這就叫瑞利判據(jù)）。如果這兩個點更接近，像平面上的兩個愛里斑就幾乎重合在一起，成為一個圓斑，那物平面上的兩個點就不可分辨了。因此，愛里斑的直徑就給出了理想光學系統(tǒng)的最高分辨率；在光學顯微鏡中，這個數(shù)值大概是光波波長的小一半，0.2微米或200納米。

（A），（B）愛里斑；（C）分辨率及瑞利判據(jù)。

很長時間以來，人們都認為光學顯微技術(shù)無法突破這個極限。為了達到更高的分辨率，很多人選擇了其他顯微技術(shù)，如電子顯微鏡（分辨率能達到0.2納米）。事實上，電子顯微鏡也是遵循衍射規(guī)律的。不同的是電子波長比光波短1 000倍，從而分辨率更高。然而，電子顯微鏡有一個很明顯的缺點：它很難用于活體生物樣品的觀察；相反地，光學顯微鏡對于觀察的樣品基本沒有侵略性。

超分辨率熒光顯微鏡的原理

這三位科學家是如何突破光學顯微鏡的分辨率極限呢？

首先登場的是莫納。超分辨率熒光顯微鏡很重要的一個方面是熒光。熒光是一種光致冷發(fā)光現(xiàn)象。熒光分子能夠吸收一種波長的光，放射出另外一種波長的光。熒光分子是有一定壽命的，其持續(xù)發(fā)光一段時間后，將不能繼續(xù)發(fā)光（這種現(xiàn)象叫作光致褪色）。熒光分子可以是熒光蛋白質(zhì)分子（如2008年諾貝爾化學獎得主錢永健發(fā)現(xiàn)的綠色熒光蛋白），也可以是有機分子。在莫納之前，人們觀測熒光分子時都是同時觀測到幾百萬幾千萬個分子，得到的結(jié)果是其平均統(tǒng)計結(jié)果。而莫納是第一個能夠探測單個熒光分子的人，于1989年將技術(shù)推進到觀測單個熒光分子。能夠探測并觀察單個熒光分子對于超分辨率顯微鏡極其重要。雖然單個熒光分子成像后也是一個0.2微米的愛里斑，但是在沒有其他分子存在的情況下，它的中心位置可以更精確地被確定下來的。這就好比一座山峰直徑很大，但是峰頂?shù)奈恢脜s能輕松地測量。在一定條件下，單個熒光分子的定位精度能達到1納米。這是超分辨率顯微鏡的基礎。

莫納的另一個貢獻是發(fā)現(xiàn)了像控制電燈泡一樣方便地控制熒光蛋白發(fā)光的方法：一些已褪色的熒光蛋白在照射405nm激光后能夠被激活，再照射其激發(fā)光（如488nm）即可重新發(fā)出熒光；這個方法稱為“光激活（photoactivation）”。

貝齊格發(fā)明的超分辨率顯微鏡叫光激活定位顯微鏡（photoactivated localization microscopy，PALM），其中所利用的就是莫納發(fā)現(xiàn)的光激活方法。貝齊格利用微量的405nm激光照射樣品，使得其中極小部分熒光分子能夠發(fā)出熒光。由于這些發(fā)光的熒光分子很稀疏從而相距較遠，它們的位置能夠精確地確定下來。等這些分子光致褪色后，再次照射405nm激光而激活另一小部分熒光分子。重復這個過程即可將樣品中的所有分子定位出來，從而得到整個樣品的圖像。

溶酶體膜在不同顯微鏡下的成像結(jié)果（左）傳統(tǒng)光學顯微鏡成像；（中）光激活定位顯微鏡成像；（右）放大的光激活定位顯微鏡成像。注：0.2微米刻度相當于阿貝衍射極限，分辨率得到很大改善。

赫爾則另辟蹊徑，他發(fā)明的是STED（受激發(fā)射損耗，stimulated emission depletion）熒光成像技術(shù)。在這個技術(shù)中，雖然激發(fā)光脈沖能夠激發(fā)0.2微米區(qū)域內(nèi)的所有熒光分子，但是另一種甜甜圈形狀的激光能將其照射區(qū)域的所有分子的熒光消除，從而只留下中間的分子的熒光。通過掃描整個樣品，從而實現(xiàn)對整個樣品的成像。

華人科學家莊小威的工作

值得一提的是，幾乎與貝齊格2006年發(fā)明PALM同時，哈佛大學化學系與物理系的華人教授莊小威也獨立發(fā)明了另一種超分辨率顯微鏡（STORM，stochastic optical reconstruction microscopy）。PALM和STORM這兩種顯微技術(shù)不僅同年，而且原理也基本一致。不同之處在于貝齊格利用的是光激活蛋白，而莊小威使用的是有機熒光分子對。但很遺憾的是，莊小威并未能分享2014年的諾貝爾化學獎。

另一片天空

今天，科學家們能夠從最微小的分子細節(jié)來研究活細胞，這在前人看來是不可能的事情。在納米顯微（nanoscopy）領(lǐng)域，科學家可以觀察到更小的結(jié)構(gòu)，也可以觀測活細胞中不同分子的運動——他們能夠看到腦部神經(jīng)細胞間的突觸是如何形成的，他們能夠觀察到與帕金森氏癥、阿爾茲海默癥和亨丁頓舞蹈癥相關(guān)的蛋白聚集過程，他們也能夠在受精卵分裂形成胚胎時追蹤不同的蛋白質(zhì)。這無疑將推動人類從分子水平理解生命科學中的現(xiàn)象與機理。

來源：nobelprize.org