祝成亮，李 艷，劉興暉，葉芳麗

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060；2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200135；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442008)

丙型肝炎病毒對(duì)白細(xì)胞介素32表達(dá)影響的研究

祝成亮1，李 艷1，劉興暉2，3，葉芳麗1

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430060；2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200135；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442008)

目的 探討丙型肝炎病毒(HCV)在體內(nèi)外對(duì)白細(xì)胞介素32(IL-32)表達(dá)的影響。方法 熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)Huh7.5.1細(xì)胞中IL-32 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-32的血清含量。結(jié)果 HCV感染的Huh7.5.1細(xì)胞IL-32 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照細(xì)胞高，HCV患者IL-32血清含量明顯高于健康對(duì)照(P＜0.05)。結(jié)論 HCV能夠在體內(nèi)外促進(jìn)IL-32的合成和分泌。

丙型肝炎病毒；白細(xì)胞介素32；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；表達(dá)

據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，目前全球有大約1.7億的人感染丙型肝炎病毒(HCV)，約有20%的HCV患者會(huì)在20年內(nèi)發(fā)展成為肝硬化，一旦肝硬化形成，發(fā)展成為肝癌的進(jìn)程為每年1%～4%，HCV肝損傷并非由病毒本身直接導(dǎo)致，而是由于病毒與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用過(guò)程中導(dǎo)致正常肝組織產(chǎn)生纖維樣變引起。白細(xì)胞介素32(IL-32)是一種重要的炎癥因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。本研究主要通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討HCV對(duì)IL-32表達(dá)的調(diào)節(jié)，為揭示HCV的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集HCV感染的患者138例，其中男性75例，女性63例，平均年齡(45.3±13.4)歲，所有患者均排除其他肝病毒和細(xì)菌的感染。選取126例健康體檢者作為對(duì)照，其中男性67例，女性59例，平均年齡(42.7±12.5)歲。

1.2 材料 人肝癌細(xì)胞系Huh7.5.1及含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1細(xì)胞由本室保存[1]；IL-32 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Rapidbio公司；IL-32多克隆抗體購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)美國(guó)Abcam公司；TRIzol R試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購(gòu)自美國(guó)Promega公司，熒光定量PCR采用美國(guó)LC480 PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) Huh7.5.1細(xì)胞用含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 熒光定量PCR檢測(cè) TRIzol R試劑提取Huh7.5.1細(xì)胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用IL-32基因的檢測(cè)引物5'-GAGACAGTGGCGGCTTAT-3' (上游)，5'-TCCTCAACATCCGGGACA-3'(下游)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參照。

1.3.3 Western blot檢測(cè) 裂解液裂解Huh7.5.1細(xì)胞，取30μg蛋白樣品加入上樣緩沖液后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素(NC)膜上，分別加入IL-32蛋白多克隆抗體和二抗，最后采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)進(jìn)行顯色。

1.3.4 EIISA的檢測(cè) IL-32血清含量采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，HCV感染組和對(duì)照組IL-32血清含量的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCV患者IL-32血清水平升高 我們收集了138例HCV患者和126例健康體檢者血清，采用ELISA檢測(cè)了IL-32的水平。結(jié)果顯示，HCV患者血清IL-32水平[(162.54±43.78)pg/ml]顯著的高于健康體檢者水平[(98.59±37.36)pg/ml，P＜0.05]。

2.2 HCV在細(xì)胞水平上調(diào)IL-32 mRNA和蛋白的表達(dá) 為探討HCV在細(xì)胞水平對(duì)IL-32表達(dá)的影響，我們采用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)了含JFH-1株HCV病毒感染的Huh7.5.1及其對(duì)照細(xì)胞IL-32 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，感染了HCV的Huh 7.5.1細(xì)胞IL-32 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高。見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 熒光定量PCR檢測(cè)IL-32 mRNA的表達(dá)

圖2 Western blot檢測(cè)IL-32蛋白的表達(dá)

3 討論

丙型肝炎病毒(HCV)是一種屬于黃病毒科家族的帶有包膜的RNA病毒，它包含一條長(zhǎng)為9 600個(gè)堿基的正義單鏈RNA基因組。HCV感染能夠引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致急慢性肝炎，最終發(fā)展為原發(fā)性肝癌(HCC)，HCV感染是HCC發(fā)生的主要原因之一。

白細(xì)胞介素32(IL-32)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，其基因定位于16號(hào)染色體上，含有8個(gè)小外顯子，主要由免疫細(xì)胞表達(dá)，但在一些炎癥部位的組織中也有表達(dá)[2]。研究證實(shí)艾滋病患者和流感患者血清中IL-32的表達(dá)升高[3]，在乙型肝炎的研究中也發(fā)現(xiàn)，乙肝患者IL-32的血清水平也明顯升高[4]。

在本研究中，我們通過(guò)ELISA的方法檢測(cè)了HCV患者和健康對(duì)照者血清含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCV患者IL-32血清含量明顯高于健康對(duì)照，表明HCV能夠在體外上調(diào)IL-32的表達(dá)。目前一般認(rèn)為HCV并非直接損傷肝細(xì)胞，而是由于機(jī)體炎癥反應(yīng)所引起。HCV感染機(jī)體后導(dǎo)致一系列細(xì)胞因子表達(dá)的升高，包括白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素12(IL-12)、γ-干擾素(IFN-γ)等[4]。IL-32能夠誘導(dǎo)很多炎癥因子如白細(xì)胞介素1β(IL-1β)，IL-6，白細(xì)胞介素8(IL-8)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等的表達(dá)，進(jìn)而引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)[5]。因此，HCV可能通過(guò)上調(diào)IL-32的表達(dá)來(lái)參與肝炎的發(fā)生和發(fā)展。

由于HCV主要感染肝細(xì)胞，我們采用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)了HCV病毒感染的肝癌細(xì)胞Huh7.5.1及其對(duì)照細(xì)胞IL-32表達(dá)的差異，發(fā)現(xiàn)HCV能夠在體內(nèi)促進(jìn)IL-32的表達(dá)。研究證實(shí)流感病毒和乙型肝炎病毒(HBV)通過(guò)激活CREB和NF-κ B通路誘導(dǎo)IL-32的轉(zhuǎn)錄[2，6]，但HCV通過(guò)何種信號(hào)通路調(diào)節(jié)IL-32的表達(dá)，是否也通過(guò)激活CREB和NF-κ B通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，尚待進(jìn)一步研究。

[1]祝成亮,李 艷,葉芳麗,等.丙型肝炎病毒上調(diào)膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1的表達(dá)[J].海南醫(yī)學(xué),2013,24(17):2497-2498.

[2]Li W,Liu Y,Mukhtar MM,et al.Activation of interleukin-32 pro-inflammatory pathway in response to influenza A virus infection[J]. PLoS One,2008,3(4):e1985.

[3]Xu Q,Pan X,Shu X,et al.Increased interleukin-32 expression in chronic hepatitis B virus-infected liver[J].

[4]Jung MY,Son MH,Kim SH,et al.IL-32 gamma induces the maturation of dendritic cells with Th1-and Th17-polarizing ability through enhanced IL-12 and IL-6 production[J].J Immunol,2011, 186(12):6848-6859.

[5]Nold-Petry CA,Nold MF,Zepp JA,et al.IL-32-dependent effects of IL-1beta on endothelial cell functions[J].Proc Natl Acad Sci U SA,106(10):3883-3888.

[6]Pan X,Cao H,Lu J,et al.Interleukin-32 expression induced by hepatitis B virus protein X is mediated through activation of NF-κB [J].Mol Immunol,2011,48(12-13):1573-1577.

Study on the effect of Hepatitis C virus(HCV)on the expression of interleukin 32.

ZHU Cheng-liang1,LI Yan1, LIU Xing-hui2,3,Ye Fang-lil.1.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital,of Wuhan Universety,Wuhan 430060,Hubei,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Shanghai Pudong New Area Gongli Hospital,Shanghai, 200135,CHINA;3.Department of Clinical Laboratory,Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442008,Hubei,CHINA

Objective To explore the effect of hepatitis C virus(HCV)on the expression of interleukin 32 (IL-32).Methods The mRNA and protein expression of IL-32 in Huh7.5.1 cells were measured by real-time PCR and western blot.Serum levels of IL-32 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results Expression of IL-32 mRNA and protein was higher in Huh7.5.1 cells infected by HCV than in the control cells.Serum IL-32 levels was significantly higher in HCV patients as compared with healthy controls(P＜0.05).Conclusion HCV can upregulate the synthesis and secretion of IL-32 both in vivo and in vitro.

Hepatitis C virus;Interleukin 32;Enzyme-linked immunosorbent assay;Expression

R512.6+3

A

1003—6350（2014）18—2708—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1062

2014-03-31)

國(guó)家臨床重點(diǎn)?？茖ｍ?xiàng)經(jīng)費(fèi)(編號(hào)：2010305)；國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81101485)；湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號(hào)：D20122404)

李 艷。E-mail：yanlitf1120@163.com