吳建永

教授，美國喬治城大學醫(yī)學院神經(jīng)科學系，華盛頓特區(qū) 20007

美麗的腦彩虹

吳建永

教授，美國喬治城大學醫(yī)學院神經(jīng)科學系，華盛頓特區(qū) 20007

腦彩虹；神經(jīng)細胞；熒光蛋白

數(shù)以億計的神經(jīng)細胞默默地在神經(jīng)系統(tǒng)的各個部門工作。神經(jīng)細胞緊緊地擠在一起，像森林里的大樹那樣枝叉互相交織纏繞。在枝叉頂端，不同的神經(jīng)細胞相互接觸并傳遞信息。腦子能想事情，關鍵就靠神經(jīng)細胞之間錯綜交織的聯(lián)系。在大腦皮層里，每個神經(jīng)細胞大約要把信息送給幾千個其他細胞，同時每個細胞也要接受并處理從幾千個神經(jīng)細胞來的信息?？墒巧窠?jīng)細胞之間的相互聯(lián)系是很難看清楚的，就像在遠處用望遠鏡看森林，雖然可以看清樹枝和葉片，但是由于許多樹的樹枝是交叉在一起的時候，很難看清哪枝哪葉來自哪棵樹。而且因為細胞組織都是半透明的，因此沒有染過色的腦組織在普通顯微鏡下看起來像肉凍，分不清單個的神經(jīng)細胞，只能模模糊糊地看到一些由于神經(jīng)細胞整齊排列形成的層狀結構。100多年來在神經(jīng)科學發(fā)展的同時，科學家一直在發(fā)展各種技術給神經(jīng)細胞“著色”，以便看清單個神經(jīng)細胞的枝枝叉叉。

腦彩虹技術

腦彩虹(brain bow) 技術是利用遺傳技術使神經(jīng)細胞著色的美麗技術，由哈佛醫(yī)學院的理奇曼(Jeff W. Lichtman) 和三思(Joshua R. Sanes)小組于2007年發(fā)明的。從圖1可以看到，利用此技術看到的神經(jīng)細胞，每個的顏色都是獨一無二的。雖然很多細胞看起來都是紅的，但這個偏點黃，那個偏一點青，還有的偏一些紫。這樣通過計算機的顏色識別技術就能完全識別每個神經(jīng)細胞，追蹤它們的每個細小的分叉。哪怕它們緊密排列，分支互相交織纏繞，也能分辨清楚。

圖1 用腦彩虹技術拍攝的神經(jīng)細胞。圖中彩色圓圈是神經(jīng)細胞胞體，胞體連接的樹枝狀結構是細胞的突觸。由于每個細胞都有一個獨特的顏色，可以利用圖像處理技術把相互交叉的突觸看清(圖片來自http://medicalxpress.com/news/2013-11-entire-brain-brainbow-ii-technology.html)

腦彩虹技術的原理和彩色電視中的三原色技術類似。電視的顯示屏上雖然只有紅、綠、藍三種熒光粉，但通過調整每種熒光顏色的亮度，可以配比出萬紫千紅的顏色。同樣，用腦彩虹技術可以讓紅、綠、黃、藍、青等幾種熒光蛋白出現(xiàn)在小鼠的每個腦細胞上。所謂熒光蛋白就是在紫外光下能發(fā)出彩色熒光的生物大分子。生物大分子的藍圖可以由基因攜帶。通過轉基因技術讓小鼠的神經(jīng)細胞攜帶熒光蛋白的基因，神經(jīng)細胞就能在熒光顯微鏡的紫外線照射下發(fā)出絢麗色彩。但怎樣讓每個不同的神經(jīng)細胞發(fā)出不同顏色的熒光呢？這就是腦彩虹技術的聰明之處，用分子遺傳學的基因隨機重組技術使不同細胞帶上不同數(shù)量的熒光蛋白。

我們知道動物的整個身體是從一個受精卵發(fā)育而成的。在胚胎發(fā)育早期，每個細胞都是全能的，就是所謂干細胞，每個都有潛能發(fā)育成身體上的不同器官。在胚胎發(fā)育時，干細胞一變二，二變四，數(shù)量快速增加，胚胎的形狀也從一團細胞變成一個管子；然后管子的背面?出現(xiàn)一個皺褶，皺褶變成神經(jīng)管，出現(xiàn)一小群專一能發(fā)育成神經(jīng)細胞的神經(jīng)干細胞；神經(jīng)管最后發(fā)育成脊髓，脊髓的前端膨大成大腦。

理奇曼-三思小組利用轉基因技術中的Cre-Lox 重組方法，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期讓每個神經(jīng)干細胞都攜帶上很多套熒光蛋白的基因，在每套基因內都含有紅、黃、藍三種熒光蛋白的編碼，并讓每套基因都有“重組”的機會。在重組的時候，可以把基因內某個熒光蛋白的編碼基因刪掉。這樣，干細胞每次增殖時會出現(xiàn)一次重組，如果在重組時丟掉了一個藍色蛋白的密碼基因，細胞的熒光就會偏綠(紅黃色多些)。同樣，如果丟掉了一個紅色蛋白基因，細胞顏色就會偏向黃藍組合的青色。從神經(jīng)干細胞發(fā)育到成熟的大腦需要有多次干細胞增殖，每次增殖時細胞的顏色都會出現(xiàn)一些變化。干細胞每次增殖都會產生兩個一模一樣的姊妹細胞，它們的基因一模一樣，顏色也是一樣的。而每個姊妹細胞的下一步增殖，顏色就會由于基因重組丟失不同的熒光蛋白而進一步變化。最后達到每個成熟的神經(jīng)細胞都會攜帶一個獨特的紅、黃、藍熒光蛋白比例，形成圖1見到的美麗腦彩虹。

這種用Cre-Lox重組方法產生基因隨機比例的方法見圖2，更詳細的解釋可以讀他們在2007年發(fā)表于《Nature》的原始文獻（Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature, 450: 56-62. doi:10.1038/ nature06293. 網(wǎng)址見圖2 注釋）。

圖2 用Cre-Lox隨機重組技術產生隨機的顏色比例。 圖中上面的鏈條表示一段帶有紅、黃、藍三種熒光蛋白的基因，在熒光蛋白的基因之間有兩個lox開關(lox2272和loxP)。這個基因只能表達最左邊的熒光蛋白。因此在不出現(xiàn)重組時只表達紅色熒光蛋白(上面紅圈)。在出現(xiàn)cre-lox基因重組的時候可以甩掉兩個相同開關之間的一段DNA。這樣如果甩lox2272之間的一段(紅熒光蛋白) 就會表達黃色熒光蛋白(中間黃圈); 如果甩掉loxP之間的一段(紅、黃熒光蛋白)就只剩下藍色蛋白(下面藍圈)，在轉基因過程中有多個相同的DNA片斷轉進細胞，每個都隨機地重組留下不同的片段，這樣每個細胞就會表達不同數(shù)量的熒光蛋白。(改畫自他們發(fā)表在《Nature》上的文章的圖1a，http:// www.nature.com/nature/journal/v450/n7166/f i g_tab/nature06293_F1.htm l )

熒光蛋白的故事

那么怎樣讓蛋白或其他生物大分子出現(xiàn)彩色的熒光呢？這是一個深刻的問題。用熒光蛋白標記神經(jīng)細胞是研究大腦的一項重要的工具。因此在最近20多年以來開發(fā)不同顏色的熒光蛋白，并提高熒光的亮度就成了神經(jīng)科學研究中的一個重要研究領域。

先簡單講講熒光的原理。我們知道原子周圍環(huán)繞著電子云，電子云攜帶的能量隨其形狀不同而變化。電子云可以和光子相互作用，吸收一個光子而變成帶有更高能量的形狀，也可以高能量形狀通過放出一個光子而變成低能量的形狀。這種與光子交換產生電子云形狀變化的術語叫作“能級躍遷”。一般當電子云吸收一個短波長的光子后會向高能量級躍遷，然后再變回基態(tài)給出一個長波長的光子。所謂熒光就是原子云吸收一個短波長光子(紫外光)之后再給出一個長波長光子(藍黃紅等可見光)的過程。讓神經(jīng)細胞產生不同顏色的熒光牽涉兩個關鍵問題：一是怎樣讓大分子產生不同顏色，二是怎樣讓基因攜帶這種大分子。

在發(fā)現(xiàn)熒光蛋白之前雖然人們已經(jīng)知道許多無機礦物和有機染料可以產生熒光，但是這些物質都不能被基因攜帶進大腦的發(fā)育過程。這是因為基因只能攜帶并讓細胞表達蛋白質類的生物大分子。能產生熒光的蛋白在開始時并不是人可以設計出來的，因為蛋白質的分子是由一串氨基酸構成，氨基酸鏈扭轉折疊形成復雜的三維結構，在能與光子作用的“生色基團”附近如果有其他的分子，會在很大程度上影響熒光的亮度和顏色。所以，在熒光蛋白研究領域里的第一推動來自于自然界的一個熒光蛋白。這第一個蛋白由日本科學家下村修(Osamu Shimomura)發(fā)現(xiàn)。

圖3 從1960年代開始，下村修(后面站立的小伙子)在他的家人和朋友幫助下在太平洋沿岸采集可以在黑暗中發(fā)光的水母(下插圖) (圖片來自諾貝爾官方網(wǎng)站2008化學獎，http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/illpres.html?print=1#.U3jZjdJdUnQ)

1958年，下村修在做碩士論文的時候發(fā)現(xiàn)水母中的一種蛋白在碰到水的時候會發(fā)出綠色的熒光。隨后下村修繼續(xù)此項研究并在20世紀60 年代(他在普林斯頓大學做博士后)純化了水母中的綠色熒光蛋白(圖3)。

下村修發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白在1994年被哥倫比亞大學的卡爾飛(Martin Chalfie)在其他物種中表達，由此證明這種蛋白可以脫離水母中的各種酶系統(tǒng)而獨立地發(fā)出熒光?？墒?，天然綠色熒光蛋白還不能作為一種有效的研究工具，因為它的分子對環(huán)境敏感，而且發(fā)光的強度較弱又不穩(wěn)定。但是在這個天然的蛋白分子的啟發(fā)下，幾個研究小組開始利用分子生物學手段改變蛋白分子的氨基酸鏈以增加發(fā)光的效率。 1995年，Roger Tsien(錢永健——錢學森的侄子，加州大學圣地亞哥分校教授)發(fā)現(xiàn)改變此蛋白分子上一個氨基酸后可以使其發(fā)光大大加強，并且十分穩(wěn)定。沿著這個思路在那幾年出現(xiàn)了一個“熒光蛋白熱”，幾個研究小組使用這種方法來改變天然的綠色熒光蛋白，使其不僅更亮更穩(wěn)定，而且產生藍、黃、青等不同顏色。經(jīng)過十幾年不懈的努力，各種熒光蛋白終于加入了神經(jīng)科學家的工具箱。2008年，下村修、卡爾飛和錢永健因為在熒光蛋白方面的貢獻分享了諾貝爾化學獎(圖4)。

圖4 由于研究熒光蛋白工作而獲得諾貝爾獎的學者(左起：卡爾飛、 下村修、錢永健。圖片來自 http://home.sandiego.edu/～cloer/nobel08.htm l)

說起來，改進天然熒光蛋白的方法并不是靠研究者“拍腦袋”式的聰明設計，而是靠“大躍進”式的隨機亂搞。這是因為我們現(xiàn)在的量子力學還遠遠不足以設計有三維結構的蛋白大分子的電子云，所以用隨機改變的方法反而顯得更聰明且高效。改進天然熒光蛋白的過程首先是把水母綠色熒光蛋白基因轉接在細菌的DNA鏈上，然后讓細菌一變二、二變四地指數(shù)率增殖。每次細菌增殖時其整個DNA鏈都會復制自己，而復制都有可能出現(xiàn)錯誤。這樣隨機產生的錯誤也會出現(xiàn)在熒光蛋白的DNA代碼上，進而在DNA翻譯成蛋白的時候氨基酸鏈也會出現(xiàn)相應的改變。這樣，在一個培養(yǎng)皿里種上幾個細菌，在合適的營養(yǎng)和溫度之下細菌幾十分鐘就能繁殖一代。如此一夜時間就會繁殖幾十代，由一個細菌變成幾億個。在這幾億個細菌中攜帶的熒光蛋白中也會很多個隨機的突變。絕大多數(shù)突變是無意義的，即不會改變顏色或亮度。但是在上萬個培養(yǎng)皿中，幾千億萬億個突變事例里可能會出現(xiàn)個別有意義的突變，這樣研究者就能在紫外燈下看到一個亮點，或“萬綠叢中一點紅”這樣的顏色改變。由此可以把這個有意思的細菌揀出來，進行下一步篩選。

從這種研究方法上我們看到研究者利用了自然界進化的“突變—選擇”的方法，只不過把自然界中需要多少萬年發(fā)生的事加速到了幾年，在實驗室內利用細菌快速繁殖傳代的特點達到目的。實際上水母也是靠進化的辦法產生了綠色熒光蛋白，在黑暗的深海里造出了吸引魚類的小燈籠，從而獲得營養(yǎng)以利自身的生存。

在20世紀90年代，我曾經(jīng)在美國東岸的伍茲霍海洋生物站(Woodshole Marine Biological Labs)工作過7個夏天。夏天的伍茲霍是神經(jīng)科學的圣地，在這個生物站開展的工作曾多次獲得諾貝爾獎。在涼爽的夏夜，小鎮(zhèn)的飯館酒吧里坐滿神經(jīng)科學家，臉紅脖粗的爭論和高聲喧嘩的打賭聲中充滿了神經(jīng)科學的術語。在小路上我曾多次與下村修不期而遇，互相點頭致意。這位樸實無華的退休老人是生物站的榮譽終身教授。我深深地記得他在做報告時會讓坐在門口的聽眾把屋里的燈全都關掉，在黑暗中他從口袋中摸出兩只試管，把兩種溶液混合在一起，產生幽幽鬼火似的藍光。在他得獎前，年復一年，他不斷地重復著那60年代的輝煌。我這樣的老聽眾也會和新來的學生一起，一遍又一遍地享受著那有趣的“祥林嫂故事”。錢永健的報告呢？當然也聽過，屬于那種中氣十足，高潮迭起，每樣都能上《Nature》《Science》那種頂級雜志的工作。在伍茲霍的夏天每周都有幾次當紅“大?！钡膱蟾妫牰嗔艘矔蝾?。

熒光蛋白的諾貝爾獎還有一個與其“擦肩而過”的悲催故事。同在伍茲霍海洋生物站工作，首次克隆出綠色熒光蛋白的人不但沒有得到諾貝爾獎，反而因生計所迫而離開了研究領域，變成了一個客車司機。他叫普拉舍(Douglas Prasher)，1979年的博士，1983年到伍茲霍工作。據(jù)美國國家公共電臺(National Public Radio, NPR)的采訪，1988年普拉舍得到美國癌癥協(xié)會的一筆基金，開始進行克隆綠色熒光蛋白的工作。在今天看來，克隆天然的綠色熒光蛋白是此領域的一個必要的里程碑。他于1992年成功地完成了這個項目，并把克隆出的結果給了卡爾飛、錢永健和其他幾百位科學家。可是，當兩年后基金用完他又去申請NIH(美國國立衛(wèi)生研究所)的基金時被拒了。當時普拉舍正在努力通過終身教授的審核程序，沒拿到NIH基金算是個硬傷，于是他不得不改行，轉到另一個研究機構——美國農業(yè)部，搞一個不相干的動植物檢疫工作。隨著美國研究資金的不斷削減，普拉舍幾年內輾轉幾個技術工作，最后到了NASA(美國國家航空航天局)。然后由于NASA基金的削減，他就完全離開了科研領域，到當?shù)匾粋€汽車行當接送客人的司機，一個小時只掙八塊五(圖5)。

圖5 因為做與諾貝爾獎里程碑項目丟了飯碗的道格·普拉舍 (Douglas Prasher)站在他的送客車前。后來他的故事廣為流傳，終得好人幫助，據(jù)說現(xiàn)在已經(jīng)重回科研崗業(yè)(圖片來自http://graphics8.nytimes.com/images/2008/10/16/science/prasher600.jpg)

普拉舍的故事告訴我們不要成天抱怨自己的工作與諾貝爾獎“擦肩而過”。就算你做的就是諾貝爾獎的里程碑式工作，也不見得就能申請到研究基金，就算得到基金，也不見得能得到終身教授，就算得到了終身教授，也不見得還能得到基金繼續(xù)做科研。

五顏六色的熒光蛋白不但是研究大腦的有力工具，也逐漸進入市場變成具有商業(yè)價值的商品。圖6所示的是一種轉有熒光蛋白基因的斑馬魚，可以在水族箱的紫外燈下發(fā)出各種顏色的美麗熒光。

結語

圖6 五顏六色的轉基因斑馬魚(上圖)和錢永健實驗室開發(fā)的各色熒光蛋白(下圖) (上圖來自：http://exotic-aquariums.com/Fish/FWF/glofish1.jpg，下圖來自http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/illpres.html?print=1#.U3jZjdJdUnQ)

腦彩虹技術只是人類認識大腦過程中的一個美麗的故事。在神經(jīng)科學研究過程中，每一個里程碑之下都有不少美麗和悲傷的故事。

腦彩虹技術發(fā)明只有短短幾年，已經(jīng)有上千篇研究文章。其主要的用途之一是幫助科學家追蹤辨識胚胎中的神經(jīng)細胞是怎樣一路艱辛地發(fā)育成一個健康的大腦。在浩瀚的神經(jīng)科學領域，這個技術只是利用光學方法研究大腦的一個事例。

看了這個故事讀者可能會問，既然能用熒光來看清糾纏在一起的神經(jīng)線路，那么我們能否用光學方法看到神經(jīng)細胞的活動？如果能用光學方法監(jiān)測神經(jīng)活動，那么我們能否用光學方法指揮神經(jīng)細胞的活動？對這兩個問題的回答都是肯定的。但是說來話長，只好且聽下回分解了。

(2014年5月29日收稿)

(編輯：沈美芳)

Brainbow: colorful stories

WU Jian-young
Professor, Department of Neuroscience, School of Medicine, Georgetown University, N.W. , Washington D.C. 20007, U.S.A.

brainbow, neuron, fluorescent protein

10.3969/j.issn.0253-9608.2014.04.009