吳建永

教授，美國喬治城大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)系，華盛頓特區(qū) 20007

美麗的腦彩虹

吳建永

教授，美國喬治城大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)系，華盛頓特區(qū) 20007

腦彩虹；神經(jīng)細(xì)胞；熒光蛋白

數(shù)以億計(jì)的神經(jīng)細(xì)胞默默地在神經(jīng)系統(tǒng)的各個(gè)部門工作。神經(jīng)細(xì)胞緊緊地?cái)D在一起，像森林里的大樹那樣枝叉互相交織纏繞。在枝叉頂端，不同的神經(jīng)細(xì)胞相互接觸并傳遞信息。腦子能想事情，關(guān)鍵就靠神經(jīng)細(xì)胞之間錯(cuò)綜交織的聯(lián)系。在大腦皮層里，每個(gè)神經(jīng)細(xì)胞大約要把信息送給幾千個(gè)其他細(xì)胞，同時(shí)每個(gè)細(xì)胞也要接受并處理從幾千個(gè)神經(jīng)細(xì)胞來的信息?？墒巧窠?jīng)細(xì)胞之間的相互聯(lián)系是很難看清楚的，就像在遠(yuǎn)處用望遠(yuǎn)鏡看森林，雖然可以看清樹枝和葉片，但是由于許多樹的樹枝是交叉在一起的時(shí)候，很難看清哪枝哪葉來自哪棵樹。而且因?yàn)榧?xì)胞組織都是半透明的，因此沒有染過色的腦組織在普通顯微鏡下看起來像肉凍，分不清單個(gè)的神經(jīng)細(xì)胞，只能模模糊糊地看到一些由于神經(jīng)細(xì)胞整齊排列形成的層狀結(jié)構(gòu)。100多年來在神經(jīng)科學(xué)發(fā)展的同時(shí)，科學(xué)家一直在發(fā)展各種技術(shù)給神經(jīng)細(xì)胞“著色”，以便看清單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的枝枝叉叉。

腦彩虹技術(shù)

腦彩虹(brain bow) 技術(shù)是利用遺傳技術(shù)使神經(jīng)細(xì)胞著色的美麗技術(shù)，由哈佛醫(yī)學(xué)院的理奇曼(Jeff W. Lichtman) 和三思(Joshua R. Sanes)小組于2007年發(fā)明的。從圖1可以看到，利用此技術(shù)看到的神經(jīng)細(xì)胞，每個(gè)的顏色都是獨(dú)一無二的。雖然很多細(xì)胞看起來都是紅的，但這個(gè)偏點(diǎn)黃，那個(gè)偏一點(diǎn)青，還有的偏一些紫。這樣通過計(jì)算機(jī)的顏色識(shí)別技術(shù)就能完全識(shí)別每個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，追蹤它們的每個(gè)細(xì)小的分叉。哪怕它們緊密排列，分支互相交織纏繞，也能分辨清楚。

圖1 用腦彩虹技術(shù)拍攝的神經(jīng)細(xì)胞。圖中彩色圓圈是神經(jīng)細(xì)胞胞體，胞體連接的樹枝狀結(jié)構(gòu)是細(xì)胞的突觸。由于每個(gè)細(xì)胞都有一個(gè)獨(dú)特的顏色，可以利用圖像處理技術(shù)把相互交叉的突觸看清(圖片來自http://medicalxpress.com/news/2013-11-entire-brain-brainbow-ii-technology.html)

腦彩虹技術(shù)的原理和彩色電視中的三原色技術(shù)類似。電視的顯示屏上雖然只有紅、綠、藍(lán)三種熒光粉，但通過調(diào)整每種熒光顏色的亮度，可以配比出萬紫千紅的顏色。同樣，用腦彩虹技術(shù)可以讓紅、綠、黃、藍(lán)、青等幾種熒光蛋白出現(xiàn)在小鼠的每個(gè)腦細(xì)胞上。所謂熒光蛋白就是在紫外光下能發(fā)出彩色熒光的生物大分子。生物大分子的藍(lán)圖可以由基因攜帶。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)讓小鼠的神經(jīng)細(xì)胞攜帶熒光蛋白的基因，神經(jīng)細(xì)胞就能在熒光顯微鏡的紫外線照射下發(fā)出絢麗色彩。但怎樣讓每個(gè)不同的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)出不同顏色的熒光呢？這就是腦彩虹技術(shù)的聰明之處，用分子遺傳學(xué)的基因隨機(jī)重組技術(shù)使不同細(xì)胞帶上不同數(shù)量的熒光蛋白。

我們知道動(dòng)物的整個(gè)身體是從一個(gè)受精卵發(fā)育而成的。在胚胎發(fā)育早期，每個(gè)細(xì)胞都是全能的，就是所謂干細(xì)胞，每個(gè)都有潛能發(fā)育成身體上的不同器官。在胚胎發(fā)育時(shí)，干細(xì)胞一變二，二變四，數(shù)量快速增加，胚胎的形狀也從一團(tuán)細(xì)胞變成一個(gè)管子；然后管子的背面?出現(xiàn)一個(gè)皺褶，皺褶變成神經(jīng)管，出現(xiàn)一小群專一能發(fā)育成神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞；神經(jīng)管最后發(fā)育成脊髓，脊髓的前端膨大成大腦。

理奇曼-三思小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的Cre-Lox 重組方法，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期讓每個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞都攜帶上很多套熒光蛋白的基因，在每套基因內(nèi)都含有紅、黃、藍(lán)三種熒光蛋白的編碼，并讓每套基因都有“重組”的機(jī)會(huì)。在重組的時(shí)候，可以把基因內(nèi)某個(gè)熒光蛋白的編碼基因刪掉。這樣，干細(xì)胞每次增殖時(shí)會(huì)出現(xiàn)一次重組，如果在重組時(shí)丟掉了一個(gè)藍(lán)色蛋白的密碼基因，細(xì)胞的熒光就會(huì)偏綠(紅黃色多些)。同樣，如果丟掉了一個(gè)紅色蛋白基因，細(xì)胞顏色就會(huì)偏向黃藍(lán)組合的青色。從神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育到成熟的大腦需要有多次干細(xì)胞增殖，每次增殖時(shí)細(xì)胞的顏色都會(huì)出現(xiàn)一些變化。干細(xì)胞每次增殖都會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)一模一樣的姊妹細(xì)胞，它們的基因一模一樣，顏色也是一樣的。而每個(gè)姊妹細(xì)胞的下一步增殖，顏色就會(huì)由于基因重組丟失不同的熒光蛋白而進(jìn)一步變化。最后達(dá)到每個(gè)成熟的神經(jīng)細(xì)胞都會(huì)攜帶一個(gè)獨(dú)特的紅、黃、藍(lán)熒光蛋白比例，形成圖1見到的美麗腦彩虹。

這種用Cre-Lox重組方法產(chǎn)生基因隨機(jī)比例的方法見圖2，更詳細(xì)的解釋可以讀他們?cè)?007年發(fā)表于《Nature》的原始文獻(xiàn)（Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature, 450: 56-62. doi:10.1038/ nature06293. 網(wǎng)址見圖2 注釋）。

圖2 用Cre-Lox隨機(jī)重組技術(shù)產(chǎn)生隨機(jī)的顏色比例。 圖中上面的鏈條表示一段帶有紅、黃、藍(lán)三種熒光蛋白的基因，在熒光蛋白的基因之間有兩個(gè)lox開關(guān)(lox2272和loxP)。這個(gè)基因只能表達(dá)最左邊的熒光蛋白。因此在不出現(xiàn)重組時(shí)只表達(dá)紅色熒光蛋白(上面紅圈)。在出現(xiàn)cre-lox基因重組的時(shí)候可以甩掉兩個(gè)相同開關(guān)之間的一段DNA。這樣如果甩lox2272之間的一段(紅熒光蛋白) 就會(huì)表達(dá)黃色熒光蛋白(中間黃圈); 如果甩掉loxP之間的一段(紅、黃熒光蛋白)就只剩下藍(lán)色蛋白(下面藍(lán)圈)，在轉(zhuǎn)基因過程中有多個(gè)相同的DNA片斷轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞，每個(gè)都隨機(jī)地重組留下不同的片段，這樣每個(gè)細(xì)胞就會(huì)表達(dá)不同數(shù)量的熒光蛋白。(改畫自他們發(fā)表在《Nature》上的文章的圖1a，http:// www.nature.com/nature/journal/v450/n7166/f i g_tab/nature06293_F1.htm l )

熒光蛋白的故事

那么怎樣讓蛋白或其他生物大分子出現(xiàn)彩色的熒光呢？這是一個(gè)深刻的問題。用熒光蛋白標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞是研究大腦的一項(xiàng)重要的工具。因此在最近20多年以來開發(fā)不同顏色的熒光蛋白，并提高熒光的亮度就成了神經(jīng)科學(xué)研究中的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。

先簡(jiǎn)單講講熒光的原理。我們知道原子周圍環(huán)繞著電子云，電子云攜帶的能量隨其形狀不同而變化。電子云可以和光子相互作用，吸收一個(gè)光子而變成帶有更高能量的形狀，也可以高能量形狀通過放出一個(gè)光子而變成低能量的形狀。這種與光子交換產(chǎn)生電子云形狀變化的術(shù)語叫作“能級(jí)躍遷”。一般當(dāng)電子云吸收一個(gè)短波長的光子后會(huì)向高能量級(jí)躍遷，然后再變回基態(tài)給出一個(gè)長波長的光子。所謂熒光就是原子云吸收一個(gè)短波長光子(紫外光)之后再給出一個(gè)長波長光子(藍(lán)黃紅等可見光)的過程。讓神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生不同顏色的熒光牽涉兩個(gè)關(guān)鍵問題：一是怎樣讓大分子產(chǎn)生不同顏色，二是怎樣讓基因攜帶這種大分子。

在發(fā)現(xiàn)熒光蛋白之前雖然人們已經(jīng)知道許多無機(jī)礦物和有機(jī)染料可以產(chǎn)生熒光，但是這些物質(zhì)都不能被基因攜帶進(jìn)大腦的發(fā)育過程。這是因?yàn)榛蛑荒軘y帶并讓細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)類的生物大分子。能產(chǎn)生熒光的蛋白在開始時(shí)并不是人可以設(shè)計(jì)出來的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的分子是由一串氨基酸構(gòu)成，氨基酸鏈扭轉(zhuǎn)折疊形成復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，在能與光子作用的“生色基團(tuán)”附近如果有其他的分子，會(huì)在很大程度上影響熒光的亮度和顏色。所以，在熒光蛋白研究領(lǐng)域里的第一推動(dòng)來自于自然界的一個(gè)熒光蛋白。這第一個(gè)蛋白由日本科學(xué)家下村修(Osamu Shimomura)發(fā)現(xiàn)。

圖3 從1960年代開始，下村修(后面站立的小伙子)在他的家人和朋友幫助下在太平洋沿岸采集可以在黑暗中發(fā)光的水母(下插圖) (圖片來自諾貝爾官方網(wǎng)站2008化學(xué)獎(jiǎng)，http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/illpres.html?print=1#.U3jZjdJdUnQ)

1958年，下村修在做碩士論文的時(shí)候發(fā)現(xiàn)水母中的一種蛋白在碰到水的時(shí)候會(huì)發(fā)出綠色的熒光。隨后下村修繼續(xù)此項(xiàng)研究并在20世紀(jì)60 年代(他在普林斯頓大學(xué)做博士后)純化了水母中的綠色熒光蛋白(圖3)。

下村修發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白在1994年被哥倫比亞大學(xué)的卡爾飛(Martin Chalfie)在其他物種中表達(dá)，由此證明這種蛋白可以脫離水母中的各種酶系統(tǒng)而獨(dú)立地發(fā)出熒光?？墒?，天然綠色熒光蛋白還不能作為一種有效的研究工具，因?yàn)樗姆肿訉?duì)環(huán)境敏感，而且發(fā)光的強(qiáng)度較弱又不穩(wěn)定。但是在這個(gè)天然的蛋白分子的啟發(fā)下，幾個(gè)研究小組開始利用分子生物學(xué)手段改變蛋白分子的氨基酸鏈以增加發(fā)光的效率。 1995年，Roger Tsien(錢永健——錢學(xué)森的侄子，加州大學(xué)圣地亞哥分校教授)發(fā)現(xiàn)改變此蛋白分子上一個(gè)氨基酸后可以使其發(fā)光大大加強(qiáng)，并且十分穩(wěn)定。沿著這個(gè)思路在那幾年出現(xiàn)了一個(gè)“熒光蛋白熱”，幾個(gè)研究小組使用這種方法來改變天然的綠色熒光蛋白，使其不僅更亮更穩(wěn)定，而且產(chǎn)生藍(lán)、黃、青等不同顏色。經(jīng)過十幾年不懈的努力，各種熒光蛋白終于加入了神經(jīng)科學(xué)家的工具箱。2008年，下村修、卡爾飛和錢永健因?yàn)樵跓晒獾鞍追矫娴呢暙I(xiàn)分享了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)(圖4)。

圖4 由于研究熒光蛋白工作而獲得諾貝爾獎(jiǎng)的學(xué)者(左起：卡爾飛、 下村修、錢永健。圖片來自 http://home.sandiego.edu/～cloer/nobel08.htm l)

說起來，改進(jìn)天然熒光蛋白的方法并不是靠研究者“拍腦袋”式的聰明設(shè)計(jì)，而是靠“大躍進(jìn)”式的隨機(jī)亂搞。這是因?yàn)槲覀儸F(xiàn)在的量子力學(xué)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以設(shè)計(jì)有三維結(jié)構(gòu)的蛋白大分子的電子云，所以用隨機(jī)改變的方法反而顯得更聰明且高效。改進(jìn)天然熒光蛋白的過程首先是把水母綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)接在細(xì)菌的DNA鏈上，然后讓細(xì)菌一變二、二變四地指數(shù)率增殖。每次細(xì)菌增殖時(shí)其整個(gè)DNA鏈都會(huì)復(fù)制自己，而復(fù)制都有可能出現(xiàn)錯(cuò)誤。這樣隨機(jī)產(chǎn)生的錯(cuò)誤也會(huì)出現(xiàn)在熒光蛋白的DNA代碼上，進(jìn)而在DNA翻譯成蛋白的時(shí)候氨基酸鏈也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的改變。這樣，在一個(gè)培養(yǎng)皿里種上幾個(gè)細(xì)菌，在合適的營養(yǎng)和溫度之下細(xì)菌幾十分鐘就能繁殖一代。如此一夜時(shí)間就會(huì)繁殖幾十代，由一個(gè)細(xì)菌變成幾億個(gè)。在這幾億個(gè)細(xì)菌中攜帶的熒光蛋白中也會(huì)很多個(gè)隨機(jī)的突變。絕大多數(shù)突變是無意義的，即不會(huì)改變顏色或亮度。但是在上萬個(gè)培養(yǎng)皿中，幾千億萬億個(gè)突變事例里可能會(huì)出現(xiàn)個(gè)別有意義的突變，這樣研究者就能在紫外燈下看到一個(gè)亮點(diǎn)，或“萬綠叢中一點(diǎn)紅”這樣的顏色改變。由此可以把這個(gè)有意思的細(xì)菌揀出來，進(jìn)行下一步篩選。

從這種研究方法上我們看到研究者利用了自然界進(jìn)化的“突變—選擇”的方法，只不過把自然界中需要多少萬年發(fā)生的事加速到了幾年，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)利用細(xì)菌快速繁殖傳代的特點(diǎn)達(dá)到目的。實(shí)際上水母也是靠進(jìn)化的辦法產(chǎn)生了綠色熒光蛋白，在黑暗的深海里造出了吸引魚類的小燈籠，從而獲得營養(yǎng)以利自身的生存。

在20世紀(jì)90年代，我曾經(jīng)在美國東岸的伍茲霍海洋生物站(Woodshole Marine Biological Labs)工作過7個(gè)夏天。夏天的伍茲霍是神經(jīng)科學(xué)的圣地，在這個(gè)生物站開展的工作曾多次獲得諾貝爾獎(jiǎng)。在涼爽的夏夜，小鎮(zhèn)的飯館酒吧里坐滿神經(jīng)科學(xué)家，臉紅脖粗的爭(zhēng)論和高聲喧嘩的打賭聲中充滿了神經(jīng)科學(xué)的術(shù)語。在小路上我曾多次與下村修不期而遇，互相點(diǎn)頭致意。這位樸實(shí)無華的退休老人是生物站的榮譽(yù)終身教授。我深深地記得他在做報(bào)告時(shí)會(huì)讓坐在門口的聽眾把屋里的燈全都關(guān)掉，在黑暗中他從口袋中摸出兩只試管，把兩種溶液混合在一起，產(chǎn)生幽幽鬼火似的藍(lán)光。在他得獎(jiǎng)前，年復(fù)一年，他不斷地重復(fù)著那60年代的輝煌。我這樣的老聽眾也會(huì)和新來的學(xué)生一起，一遍又一遍地享受著那有趣的“祥林嫂故事”。錢永健的報(bào)告呢？當(dāng)然也聽過，屬于那種中氣十足，高潮迭起，每樣都能上《Nature》《Science》那種頂級(jí)雜志的工作。在伍茲霍的夏天每周都有幾次當(dāng)紅“大?！钡膱?bào)告，聽多了也會(huì)打瞌睡的。

熒光蛋白的諾貝爾獎(jiǎng)還有一個(gè)與其“擦肩而過”的悲催故事。同在伍茲霍海洋生物站工作，首次克隆出綠色熒光蛋白的人不但沒有得到諾貝爾獎(jiǎng)，反而因生計(jì)所迫而離開了研究領(lǐng)域，變成了一個(gè)客車司機(jī)。他叫普拉舍(Douglas Prasher)，1979年的博士，1983年到伍茲霍工作。據(jù)美國國家公共電臺(tái)(National Public Radio, NPR)的采訪，1988年普拉舍得到美國癌癥協(xié)會(huì)的一筆基金，開始進(jìn)行克隆綠色熒光蛋白的工作。在今天看來，克隆天然的綠色熒光蛋白是此領(lǐng)域的一個(gè)必要的里程碑。他于1992年成功地完成了這個(gè)項(xiàng)目，并把克隆出的結(jié)果給了卡爾飛、錢永健和其他幾百位科學(xué)家。可是，當(dāng)兩年后基金用完他又去申請(qǐng)NIH(美國國立衛(wèi)生研究所)的基金時(shí)被拒了。當(dāng)時(shí)普拉舍正在努力通過終身教授的審核程序，沒拿到NIH基金算是個(gè)硬傷，于是他不得不改行，轉(zhuǎn)到另一個(gè)研究機(jī)構(gòu)——美國農(nóng)業(yè)部，搞一個(gè)不相干的動(dòng)植物檢疫工作。隨著美國研究資金的不斷削減，普拉舍幾年內(nèi)輾轉(zhuǎn)幾個(gè)技術(shù)工作，最后到了NASA(美國國家航空航天局)。然后由于NASA基金的削減，他就完全離開了科研領(lǐng)域，到當(dāng)?shù)匾粋€(gè)汽車行當(dāng)接送客人的司機(jī)，一個(gè)小時(shí)只掙八塊五(圖5)。

圖5 因?yàn)樽雠c諾貝爾獎(jiǎng)里程碑項(xiàng)目丟了飯碗的道格·普拉舍 (Douglas Prasher)站在他的送客車前。后來他的故事廣為流傳，終得好人幫助，據(jù)說現(xiàn)在已經(jīng)重回科研崗業(yè)(圖片來自http://graphics8.nytimes.com/images/2008/10/16/science/prasher600.jpg)

普拉舍的故事告訴我們不要成天抱怨自己的工作與諾貝爾獎(jiǎng)“擦肩而過”。就算你做的就是諾貝爾獎(jiǎng)的里程碑式工作，也不見得就能申請(qǐng)到研究基金，就算得到基金，也不見得能得到終身教授，就算得到了終身教授，也不見得還能得到基金繼續(xù)做科研。

五顏六色的熒光蛋白不但是研究大腦的有力工具，也逐漸進(jìn)入市場(chǎng)變成具有商業(yè)價(jià)值的商品。圖6所示的是一種轉(zhuǎn)有熒光蛋白基因的斑馬魚，可以在水族箱的紫外燈下發(fā)出各種顏色的美麗熒光。

結(jié)語

圖6 五顏六色的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(上圖)和錢永健實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的各色熒光蛋白(下圖) (上圖來自：http://exotic-aquariums.com/Fish/FWF/glofish1.jpg，下圖來自http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/illpres.html?print=1#.U3jZjdJdUnQ)

腦彩虹技術(shù)只是人類認(rèn)識(shí)大腦過程中的一個(gè)美麗的故事。在神經(jīng)科學(xué)研究過程中，每一個(gè)里程碑之下都有不少美麗和悲傷的故事。

腦彩虹技術(shù)發(fā)明只有短短幾年，已經(jīng)有上千篇研究文章。其主要的用途之一是幫助科學(xué)家追蹤辨識(shí)胚胎中的神經(jīng)細(xì)胞是怎樣一路艱辛地發(fā)育成一個(gè)健康的大腦。在浩瀚的神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，這個(gè)技術(shù)只是利用光學(xué)方法研究大腦的一個(gè)事例。

看了這個(gè)故事讀者可能會(huì)問，既然能用熒光來看清糾纏在一起的神經(jīng)線路，那么我們能否用光學(xué)方法看到神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)？如果能用光學(xué)方法監(jiān)測(cè)神經(jīng)活動(dòng)，那么我們能否用光學(xué)方法指揮神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)？對(duì)這兩個(gè)問題的回答都是肯定的。但是說來話長，只好且聽下回分解了。

(2014年5月29日收稿)

(編輯：沈美芳)

Brainbow: colorful stories

WU Jian-young
Professor, Department of Neuroscience, School of Medicine, Georgetown University, N.W. , Washington D.C. 20007, U.S.A.

brainbow, neuron, fluorescent protein

10.3969/j.issn.0253-9608.2014.04.009